Name: 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 배우세요 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 PRMT 단백질 대규모 생산 방법입니다. SF9 세포에서 수밀리그램의 재조합 단백질을 효율적으로 얻어 생화학 및 구조생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템에서 표현된 PRMT 단백질 가족과 함께 일한 원고와 모든 SGC 동료에 대한 귀중한 피드백과 비판적 의견을 제공하는 데 시간을 내어 달리아 바르시테-러브조이에게 감사를 표하고자 합니다.
SGC는 애브비로부터 기금을 받는 등록 자선 단체(1097737 번호)입니다. 바이엘 AG, 보링거 잉겔하임, 제넨테크, 온타리오 유전체 연구소 [OGI-196]를 통해 유전체 캐나다 [OGI-196], 혁신적인 의약품 이니셔티브 를 통해 EU와 EFPIA 2 공동 착수 [EUbOPEN 보조금 875510], 얀센, 머크 KGaA (일명 캐나다와 미국에서 EMD), 화이자, 다케다 및 웰컴 트러스트 106169 [Z4].

<ol><li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation%2C+functions+and+relevance+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation, functions and relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li>
<li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+RGG%2FRG+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li>
<li>Lorton, B. M., Shechter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+consequences+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cellular consequences of arginine methylation.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+Who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).</li>
<li>Frankel, A., Brown, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+kinetic+data%3A+What+the+numbers+tell+us+about+PRMTs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+Proteins+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs.</a> Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).</li>
<li>Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Seña, C. C., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+protein+arginine+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for protein arginine methyltransferases.</a> Methods. 175, 30-43 (2020).</li>
<li>Savitsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+production+of+human+proteins+for+crystallization%3A+The+SGC+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience.</a> Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).</li>
<li>Gileadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressing+the+human+proteome+for+affinity+proteomics%3A+Optimizing+expression+of+soluble+protein+domains+and+in+vivo+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation.</a> New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5, 135(2008).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li>
<li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-insect+cell+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li>
<li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+vector+system%3A+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).</li>
<li>Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).</li>
<li>Invitrogen Life Technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Invitrogen%2C+Bac-to-Bac+Baculovirus+expression+system%22">Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system</a>. , Invitrogen Life Technologies. Carlsbad. (2010).</li>
<li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).</li>
<li>Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Production+Using+the+Baculovirus+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Protein+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein Production Using the Baculovirus Expression System.</a> Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).</li>
<li>Rieffel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+cell+culture+in+reagent+bottles%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Insect cell culture in reagent bottles.</a> MethodsX. 1, 155-161 (2014).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

곤충 세포에서 BEVS의 장점 중 하나는 인산화, myristoylation 및 글리코실화와 같은 보다 복잡한 변형을 가능하게 하기 위해 번역 후 변형 기계의 기능에 중점을 둡트합니다. 포유류 단백질의 고효율 접이식과 함께, 이러한 수정은 생리학적으로 관련된 다운스트림실험(16)에적합한 다량의 변형 및 접힌 단백질을 용이하게 한다.
여기서, 우리는 BAculovirus 발현 플랫폼에서 PRMT 단백질의 다중 구조와 대규모 PRMT 단백질 생산의 성공적인 발현 을 위한 중요한 요소를 강조하는 BEVS의 상세한 프로토콜을 기술했습니다: 1) 24-96 사이 생물학 물질을 전송하기 위하여 정규적이고 조정 가능하고 프로그래밍 가능한 멀티채널 파이펫의 사용 - 잘 세포 배양 판 및 블록의 단계에서 잘 세포 배양 판 및 블록; 재조합 바이러스의 컬렉션, 재조합 바이러스의 바이러스 볼륨의 증폭 및 단백질 발현 스크리닝 블록의 준비. 2) 재조합 바이러스의 생성을 위한 고성능 및 비용 효율적인 트랜스페션 시약. 3) 대규모 단백질 생산을 위한 바쿨로바이러스 감염 곤충 세포(SCBIIC)의 현탁액 배양. 4) 고용량 2.8 L Fernbach 쉐이크 플라스크의 활용은 Sf9 서스펜션 배양및 2.5 L Tunair 쉐이크 플라스크 및 대규모 단백질 생산을 위한 5L 시약 병을 유지한다.
변환 및 전환 단계에 대한 특별한 고려 사항 및 근거. 상용 프로토콜은 하나의 변환14에관능적 인 세포의 100 μL을 사용하는 것이 권장하지만, 상용 DH10Bac E. 대장균 유능한 세포의 변환 효율은 1 x 108 cfu / μg DNA만큼 높기 때문에 우리는 단지 4 μL을 사용합니다. 이것은 박미드 DNA 격리를 위한 고립된 백색 재조합 식민지를 얻기 위하여 각 변환제에 대 한 충분합니다. 24웰 의 형질 전환 판에서 부착된 Sf9 세포는 혈청없는 곤충 매체의 0.5 mL에서 2 x 105 /mL의 세포 밀도로 종자하였다. 이 볼륨은 우물의 작동 표면의 커버리지를 보장하기에 충분합니다. 동시에, 그것은 형질 혼합물을 너무 많이 희석하지 않으므로 형질 효율을 향상시킵니다. 경질 시약은 Sf9 세포에 무독성이며, 미디어 교환은 필요하지 않습니다. 미디어 변화 대신, 10%(v/v) FBS를 함유한 1.5mL의 추가 미디어가 세포 성장을 용이하게 하기 위해 4-5시간 후 트랜스페션 시간에 트랜스페션 플레이트에 추가됩니다. 두 형질 전환 시약의 트랜스페트 효율이 높습니다. 여전히, X-tremeGene 9를 사용하면, 전염된세포(그림 2)에서감염의 징후가 JetPrime 시약보다 10-12h 일찍 나타나므로, 우리는 프로토콜의 다음 단계의 작업 일정에 따라 이러한 시약 중에서 선택하여 전체 공정에서 약간의 유연성을 제공한다.
단백질 시험 발현 스크리닝은 P2 바이러스로 설정할 수 있으며, 초기 재조합 바이러스의 양이 P1로 분류되고, 단백질 발현 스크리닝에 사용하는 제한인자가 된다.
작은 볼륨에서 큰 문화 볼륨으로 이동할 때 고려 사항. 역사적으로, 최적의 세포 성장은 Sf9 세포 유지 보수 및 스케일 업 생산의 현탁액 배양에 높은 공기 공간을 필요로 한다고 믿었다. 그러나 2014년에는 배양선박의 높은 공공이 이전에 생각했던17개보다덜 중요하다고 보고되었다. 흔들리는 플랫폼의 궤도 던지기로 적절하게 조정된 흔들림 속도를 사용하여 설정된 배양 용기는 작은 기포를 장시간 생성하고 유지하여 고용량 서스펜션 배양에서도 충분한 산소 전달을 제공한다. 이러한 접근법으로, 시판되는 곤충 세포는 높은 세포 생존가능성을 희생하지 않고 세포의 두 배시간 내에 더 높은 흔들림 속도로 배양될 수 있다.
따라서, 6년 전, 세포 유지 과정에서 흔들리는 플라스크에서 서스펜션 배양량을 늘리기 시작했고, 흔들리는 상태를 조정 및 모니터링하면서 단백질 생산을 위한 다양한 유형의 배양용기를 도입하였다(그림6). 이러한 배양 용기에 최적의 조건을 확립하기 위해 세포 생존가능성, 크기 및 모양, 응집 상태 및 세포의 감염가능성과 함께 세포 두 배로 증가하는 세포 배양 파라미터를 모니터링했습니다.
예를 들어, Sf9 세포 유지보수의 경우, 2.8 L Fernbach 쉐이크 플라스크에서, 우리는 Sf9 서스펜션 세포의 0.8 L 대신 에 2 L을 배양하고 27°C에서 150 rpm에서 흔들리는 세포 생존가능성은 대부분 99%에 가깝고, 균등하게 모양의 건강한 분할 세포를 갖는다. 스케일업 생산을 위해, 25°C의 낮은 온도에서 145rpm으로 고속으로 흔들리는 5L 시약 병에 4L의 세포를 감염시킵니다. 내장 된 흔들림 플랫폼이있는 가장 일반적으로 사용되는 인큐베이터는 6 x 2.8 L 쉐이크 플라스크 또는 6 x 5 L 시약 병 또는 10 x 2.5 L Tunair 쉐이크 플라스크를 보유 할 수 있습니다. 따라서, 하나의 흔들림 플랫폼의 용량은, 우리가 Fernbach 쉐이크 플라스크및 시약병을 1/3으로 채우면 선박의 고충부가 2.8 L 펀바흐 쉐이크 플라스크및 10 L 대 24 L을 사용하여 5 L 시약병을 사용한다(그림6). 높은 충진량을 가진 배양 용기의 현탁액 세포 배양 유지 및 스케일업 생산은 생산량의 한계를 극복하고 대규모 플랫폼을 채택하는 데 도움이 되었습니다. 따라서, 이것은 생산 파이프라인의 생물 반응기 및/또는 제한된 공간에 접근할 수 없는 실험실에 매우 유용합니다.
이 프로토콜은 PRMT4, 7, 9, 및 그의 태그가 지정된 PRMT5-MEP50 복합체 및 PRMT66의 플래그 태그 전길이 단백질에 대해 SGC 간행논문6에 설명된 바와 같이 적절한 수지를 활용하고 정제 완충제를 수정함으로써 다양한 친화성 태그를 가진 단백질 구조의 생산 및 정화에 용이하게 적응될 수 있다. 우리는 단백질의 PRMT 가족을 위한 BEVS 프로토콜을 기술하더라도, 동일 접근은 그밖 단백질 가족에 적용될 수 있습니다.

단메틸 또는 대칭/비대칭 디메틸 방식으로 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제(PRMT) 메틸레이트 아르기닌 잔류물. 반복적인 RG/RGG/GRG 서열은 대부분의 PRMT에 의해 매우 선호되며 다양한 단백질1,2에서발견된다. 히스톤 또는 전사 인자 및 접합 인자와 같은 아르기닌 메틸화 단백질은 전사, 접합 및 크로마틴구조를조절3,4. 기판 및 공동 요인 활용, 회전율 및 PRMT의 운동학의 다양한 조절에 대한 지식 증가뿐만 아니라 선택적 억제제의 생성은 이러한 효소및복합체5,6에기계론적 빛을 발산했다. 그러나, 모든 PRMT 가족 구성원은 같은 정도로 공부; 예를 들어 PRMT9는 최근에 PRMT 패밀리1의구성원으로 만 발견되었습니다. 이러한 단백질에 대한 구조 및 효소 기능 연구는 충분한, 종종 밀리그램, 재조합 단백질의 양을 사용할 수 있어야합니다.
대장균(대장균) 원생발식 시스템은 일반적으로 주어진 단백질7,8,9에대한 다중 구조를 활용한 발현 스크리닝을 위한 첫 번째 선택이다. 그러나, 대장균계 발현은 PRMT5 및 PRMT7에 대해 특별히 언급했듯이 항상 활성 형태로 PRMT 단백질의 충분한 양을 초래하지는 않습니다(아래 참조). 따라서, 대장균에서 발현하지 못하거나 진핵식 기계에 의해 제조될 필요가 있는 PRMT는 대체 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)에서 발현 스크리닝에 적합한 벡터로 스캐닝되었다. 대장균이 PRMT1, PRMT3 및 PRMT8의 샘플을 발현하는 동안, PRMT3 및 PRMT8은 체외 세포 및 결정학, 이중 메틸 트랜스퍼라제 도메인의 MEP50 결합 파트너를 필요로 하는 PRMT5와 같은 다른 PRMT, 그리고 PRMT7 및 9와 같은 PRMT, 충분한 양의 활성 수량을 얻기 위하여 필요한 곤충 세포 발현을 필요로 합니다. 전반적으로, PRMT4, 5, 6, 7 및 9에 대한 표준화된 중간 처리량 메틸트랜스퍼라제 소약은 곤충 세포6에서BEVS를 이용하였다. 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 생화학, 생물리, 구조연구에 필수적인 번역 후 변형을 가능하게 하는 진핵발현 기계를 필요로 하는 재조합 단백질을 생산하는 다목적 플랫폼이다10,11,12. 몇몇 BEVS는 단백질 발현(13)을위해 1983년에 바쿨로바이러스의 처음 보고된 사용 이후 상업적으로 유효하게 되었습니다. 이러한 프로토콜의 대부분은 곤충 세포로 플라스미드 발현의 전송을 위한 다른 전략을 채택합니다. 여기에는 박-투-박, 플래시박, 바쿨로골드 브라이트, 바벡터-3000, 바매직, 박팍 등이 포함됩니다. 우리의 프로토콜은 BEVS에서 가장 일반적으로 사용되는 시스템을 기반으로, Bac-to-Bac시스템(14)은관심있는 단백질(POI, 여기 PRMT)을 사이트별전도를통해 대장균의 특수한 균주로 유지되도록 설계된 유전자/cDNA를 전관하도록 설계되었다.
간단히, 관심 있는 유전자를 함유하는 플라스미드 전달 벡터는 재조합 바이러스 박미드 DNA를 생성하기 위해 DH10Bac E. 대장균 유능한 세포로 변형되었다. 부착Sf9 세포는 그 때 박미드 DNA로 감염되었다. 4~5일 후, 세포배양 배지로 분비된 초기 재조합 바큘로바이러스는 P1 바이러스로 회수및 표지되었다. P1 바큘로바이러스 주식은 바이러스 증폭(즉, P2 바쿨로바이러스 주식의 생성) 및 단백질 발현 스크리닝에 사용하였다. 발현 스크리닝 결과에 기초하여, 단백질의 최상의 발현 구조를 위한 P2 바이러스를 확인하여 대규모 단백질 생산을 위한 바쿨로바이러스 감염 곤충 세포(SCBIIS)의 현탁액 배양을 생성하는 데 사용되었다. 여기에서는 당사의 상세한 프로토콜을 설명하고 시약 및 배양 용기 선택의 근거를 설명하여 원하는 재조합 단백질을 충분한 수량을 얻기 위해 보다 시간 효율적이고 비용 효율적이며 확장 가능한 방법론을 개발하는 전략을 지원합니다.

<table><tbody><tr><td>2.8L 날진&nbsp; Fernbach 배양 플라스크, 폴리카보네이트,</td> <td>Nalgene</td><td>29171-854</td><td>Sf9 세포의 현탁 배양의 대규모 유지 관리를 위한</td></tr><tr><td>24-Well Blocks RB</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td>현탁액 4ml의 인큐베이션을 위해&nbsp; Sf9 세포&nbsp; 단백질을 위해&nbsp; 발현 스크리닝</td></tr><tr><td>4-20 Criterion TGX 젤 26W 15 ul</td><td>Biorad</td><td>5671095</td><td>정제된 단백질의 SDS-PAGe 분석을 위해</td></tr><tr><td>50ml 시약 저장소</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229290</td><td>&nbsp; 희석된 형질주입 시약에 사용되는 저장소&nbsp; 및 Sf9 세포 현탁</td></tr>액 <tr><td>96웰 캡 매트, 정사각형 웰과 함께 사용, 2mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>381080</td> 96웰 블록 96웰 PCR 플레이트<td>를 커버하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>30129300</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>BD</td><td>214010</td><td>LB-한천 선택 팔레트용 Airpore</td></tr><tr><td>테이프 시트</td><td>Qiagen</td><td>19571</td><td>단백질 발현 스크리닝</td></tr><tr><td>을 위한 24웰 블록 커버Allega X-15R 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>항생제 항진균제 (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240112</td><td></td></tr><tr><td>Bacmid DNA</td><td>사내</td><td>비카탈로그 아이템</td><td>Bacmid DNA for baculovirus production</td></tr><tr><td>Bluo-Gal, 1g</td><td>Thermo Fisher</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>Beckman JLA 8.1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Plates, 24-Well, with 뚜껑, 평평한 바닥, 멸균</td><td>Eppendorf</td><td>30722116</td><td>Tissue&nbsp; 배양 처리된 플레이트</td></tr><tr><td>세포 재현탁 용액 0.5&nbsp; L</td><td>Millipore 시그마</td><td>LSKCRS500</td><td>Bacmid DNA 추출</td></tr><tr><td>셀&nbsp; 용해 용액 0.5&nbsp; L</td><td>Millipore 시그마</td><td>LSKCLS500</td><td>Bacmid DNA 추출용</td></tr><tr><td>CELLSTAR&nbsp; 조직 배양 플레이트, 96 웰</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td>트랜스펙션 믹스</td></tr>용 <tr><td>ClipTip 1250, 필터 재장전, 멸균</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>94420818</td><td>팁 &nbsp; 프로그래밍 가능하고 조절 가능한 다채널 피펫</td></tr><tr><td>dNTP 믹스 (각각 25 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1121</td><td></td></tr><tr><td>E1-ClipTip; 전자 조절 가능한 팁 간격 다중 채널 이퀄라이저 피펫, 15 to 1250 &mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4672090BT</td><td>프로그래밍 가능하고 조절 가능한 다채널 피펫</td></tr><tr><td>E4&nbsp; XLS 간격 조절용 6채널 피펫, 20-300 &mu; L</td><td>Ranin</td><td>LTS EA6-300XLS</td><td>Ranin 조절 가능한 다중 채널 피펫</td></tr><tr><td>필터 마이크로플레이트, 96-웰, 폴리프로필렌, 25 &마이크로; m 초고분자량 폴리에틸렌 멤브레인</td><td>Agilent</td><td>201005-100</td><td>발현 스크리닝에서 단백질 정제용</td></tr><tr><td>전체 배플 플라스크 키트 Tunair, 2.5L</td><td>IBI Scientific</td><td>SS-6003C</td><td>SF9 세포의 현탁 배양에서 대규모 단백질 생산용</td></tr><tr><td>Gentamicin 10x10ml</td><td>BioShop</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청</td><td>Wisent Biocenter</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>I-Max 곤충 매체 W/ L-글루타민, 1 L</td><td>Wisent Biocenter</td><td>301-045-LL</td><td>무혈청 곤충 세포 성장 매체</td></tr><tr><td>InstantBlue, 초고속 단백질 염색</td><td>Expedeon 단백질 솔루션</td><td>ISB1L-1L</td><td>단백질 젤(SDS-PAGE) 염색용</td></tr><tr><td>Iptg, 울트라 퓨어, 다이옥산 프리, 최소 99.5%</td><td>BioShop</td><td>IPT001.100</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME 트랜스펙션 시약&nbsp; 제공&nbsp; jetPRIME 완충액</td><td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td><td>114-01</td><td>Sf9 세포 형질주입으로 바큘로바이러스</td></tr><tr><td>카나마이신 모노설페이트</td><td>생성 BioShop</td><td>KAN201.100</td><td></td></tr><tr><td>Lb Broth (Lennox), 분말 미생물 Gro&</td><td>Sigma</td><td>L3022-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Masterblock 96 딥 웰 2.4mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780285-FD</td><td>형질전환 및 발현 스크리닝 절차에 사용</td></tr><tr><td>최대 효율 DH10Bac 유능한 세포, 0.5ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>10361012</td><td>bacmid DNA 생성을 위한 유능한 세포</td></tr><tr><td>mLINE 12채널 피펫, 조정 가능한 30 - 300 uL</td><td>Sartorius</td><td>Sartorius 725240</td><td>12 채널 피펫</td></tr><tr><td>중화 용액, 0.5&nbsp; L</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSKNS0500</td><td>바미드 DNA 추출용</td></tr><tr><td>뉴브런즈윅&nbsp; Innova 44R, 120V, 궤도 2.5 cm (1 in)</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td>Sf9 세포의 현탁액 인큐베이터</td></tr>, <tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td>단백질 정제를 위한</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>LS15140122</td><td></td></tr><tr><td>PYREX&nbsp; Delong Shaker Erlenmeyer 플라스크 배플, Corning&nbsp; 500ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-500</td><td>Sf9 세포의 현탁 배양</td></tr><tr><td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer 플라스크와 배플, Corning&nbsp; 125ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-125</td><td>Sf9 세포의 현탁 배양</td></tr><tr><td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer 플라스크와 배플, Corning&nbsp; 250ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-250</td><td>Sf9 세포</td></tr><tr><td>의 현탁 배양용레드세이프&nbsp; 핵&nbsp; 산&nbsp; 염색&nbsp; 솔루션</td><td>Froggabio</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 0.9&nbsp; mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSKPMRN30</td><td>bacmid DNA 추출을 위한 현탁액 완충액</td></tr><tr><td>Roll & 구형 유리 도금 비즈</td><td>MP Biomedicals</td>를 성장시키<td>115000550</td><td>한천 플레이트의 표면을 가로질러 박테리아&nbsp; 세포를 퍼뜨립니다.</td></tr><tr><td>RT-LTS-A-300&뮤; L-768/8 (팁)</td><td>Ranin</td><td>30389253</td><td>팁 라닌 멀티채널 피펫</td></tr><tr><td>S.O.C. 매체</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>세럼, 세포 배양, 태아 소 혈청(FBS), 하이클론, 특성화된 캐나다</td><td>cytivalifesciences</td><td>SH3039602</td><td>transfected cells</td></tr><tr><td>Sf9 cells</td><td>Thermo Fisher</td><td>12659017</td><td>Insect에 대한 무혈청 medim 추가 세포</td></tr><tr><td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td><td>Cytiva (이전 GE Healthcare Life Sciences)</td><td>SH3027802</td><td>무혈청 곤충 세포 성장 매체</td></tr><tr><td>테이프 패드</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>테이프 패드</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소 with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hcl</td><td>BioShop</td><td>TET701.10</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.4% 솔루션</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>세포 생존율 평가</td></tr><tr><td>VITLAB&nbsp; 시약 병, 나사 캡이 있는 PP, PP, BrandTech, 5L</td><td>VITLAB</td><td>V100889</td><td>Sf9 세포의 현탁 배양에서 대규모 단백질 생산을 위한</td></tr><tr><td>VWR&nbsp; 디지털 미니 인큐베이터</td><td>VWR</td><td>10055-006</td><td>접착성 Sf9 세포용 인큐베이터</td></tr><tr><td>VWR&nbsp; </td><td>24 웰 블록에서 Sf9 세포의 현탁 배양을 위한 인큐베이</td>팅 마이크로플레이트 <td>쉐이커 VWR</td><td>97043-606</td> 인큐베이터</tr><tr><td>VWR 페트리 디쉬</td><td>VWR</td><td>CA73370-037</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGene 9 DNA&nbsp; 트랜스펙션 시약&nbsp; 1.0 M</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>Sf9 세포 transfection을 통해 재조합 baculovirus 생성</td></tr></tbody></table>

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 prmt 단백질 생산

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

단백질 아르기닌 메틸 전달효소 (PRMTs) 메틸레이트 아르기닌 잔류물은 수많은 세포 과정에서 역할을 하는 다양한 단백질에 대한 잔류물. PRMT는 대칭 또는 비대칭으로 아르기닌 구니디노 그룹을 모노 또는 유정 할 수 있습니다. 이 단백질의 효소학은 고품질 재조합 단백질의 밀리그램 양을 요구하는 복잡하고 강렬하게 조사된 지역입니다. 이 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 사인폴리오폴리에드로바이러스(AcMNPV) 및 스포드옵테라 검거다 9(Sf9) 곤충 세포를 채택하여 PRMT 1, 2, 4를 포함한 많은 PRMT의 발현 선별 및 생산에 사용되어 왔다. 도메인 및 잘린 단편뿐만 아니라 전신 단백질을 포함한 이러한 단백질의 여러 구조의 발현을 동시에 선별하기 위해 24- 및 96 웰 플레이트 및 블록과 결합된 조정 가능하고 프로그래밍 가능한 멀티채널 파이펫을 활용하는 확장 가능한 방법을 적용했습니다. 전반적으로, 이러한 방법 조정은 박미드 DNA, 재조합 바이러스 및 단백질 발현 스크리닝의 대규모 생성을 가능하게 했다. Sf9 세포 현탁액의 높은 채우기 볼륨배양 용기를 사용하여 단일 배치 대규모 단백질 생산을 위한 생산 파이프라인의 공간 한계를 극복하는 데 도움이 되었습니다. 여기에서는 생화학, 생물리학적 및 구조 연구를 위한 기능PRMT의 효율적이고 비용 효율적인 발현을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

BEVS 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에설명되어 있습니다. 상사 전략에 따라 전신, 도메인 및 잘린 단편을 포함한 PRMT의 다중 발현 구조는 상대적으로 높은 발현 수준7,9로수용성 및 안정적인 단백질을 식별하는 성공률을 높이기 위한 시도로 사내 전략에 따라 생성되었다. 관심 있는 독자는 표현 클론에 통합된 유전자 서열의 세그먼트로서 "단편"을 설계하는 SGC의 정의 및 방법론, PFAM-인음응구조 영역으로 "도메인", 표현 벡터에 복제된 단편으로 "구성"을 검토하는 것이좋습니다. 본 프로토콜에 제시된 PRMT의 발현 구조는 pFBOH-MHL 벡터로 복제된 폴리히스티딘 태그 단백질의 생산을 위한 것으로, 이는 pFASTBac1 벡터의 유도체이다. 도 4에서는,Sf9 세포에서 4mL의 생산 후 수집된 펠릿으로부터 정제된 PRMT1, 2, 4-9의 그의 태그된 용용 구조에 대한 SDS-PAGE 분석을 제시한다(단계 3.1.4). FL PRMT1은 대장균에서생산되었기 때문에 전체 길이(FL) PRMT1 및 PRMT9는 이 젤에 제시되지 않으며, BEVS에서 생산된 FL PRMT9는 플래그 태그6에의해 정제되었다. PRMT1, FL PRMT4 및 모든 PRMT8 구조의 잘린 구조는 상대적으로 높은 수율을 나타내지만 단백질 용출에는 정수된 오염 물질의 분수를 함유하고 있습니다. 이러한 구조는 정화 프로토콜의 추가 최적화가 필요합니다. 따라서 추가 접근법은 이러한 단백질의 순도를 개선하여 명확한 용액을 가진 배양 단계에서 니켈 구슬의 양을 감소하는 등의 스케일 업 생산에서 이러한 단백질의 순도를 향상시키는 데 필요합니다. 세척 버퍼에서 이미다졸 농도의 증가; TEV 프로테아제와 그의 태그의 분열, Ni-선호도 수지에 응용 프로그램 다음; 및, 크기 배제 및 이온 교환 크로마토그래피와 같은 추가 정화 단계. PRMT2의 구조는 강한 오염 물질 밴드를 동반다른 단백질과 전체 길이 PRMT2 단백질에 비해 상당히 낮은 수율을 보여줍니다. 스케일업 생산 및 IMAC 및 크기 배제와 같은 2단계의 정제는 FL 단백질에 대한 공동 정화 오염물질의 지속적인 존재와 함께 이 구조에 대한 낮은 발현 수준을 확인하였다. 순수 단백질은 의무결합 파트너인 MEP50을 통해 제조 및 정제된 PRMT5 복합체를 위해 수득되었습니다. PRMT9의 잘린 구조는 다른 PRMT에 비해 거의 2 배 또는 3 배 낮은 발현 수준을 가지고, 1.5 mg / L에 가까운. 그럼에도 불구하고, 본 구조의 재조합 바이러스주들은 스케일업 생산에 사용되어 왔으며, 변형 결정이 얻어졌으며, 이 단백질에 대해 PRMT4, 6,7(도 5)과함께 구조가 해결되었다.
스케일업 생산을 위해, 해당 P2 바이러스는 Sf9 곤충 세포의 현탁액 배양을 감염시키기 위하여 이용되었다. 이 단계는 상체에 감염된 세포 및 P3 바이러스를 포함하는 바쿨로바이러스 감염한 세포의 50/100/200 mL를 생성합니다. 대규모 단백질 생산을 위해, 2L의 Sf9 세포는 각각 2.8 L Fernbach 쉐이크 플라스크에서 150 rpm, 27°C(도6)에서배양되었다. 생산 당일, Sf9 세포의 2L (세포 생존가능성 &gt; 97%) 2.5 L Tunair 쉐이크 플라스크 또는 5 L 시약 병에 4 L에서4 L은 4 x 10 6/mL의 세포 밀도로 희석되었다. 이들 세포는 바쿨로바이러스감염 곤충 세포의 현탁액 배양 10-12mL/L에 직접 감염되었고, 145rpm에서 25°C의 낮은 온도에서 배양되었다. 바쿨로바이러스감염곤충세포의 현탁액 배양으로 직접 생산 배치의 감염은 감염된 세포의 추가 처리를 제외하고 바이러스 부피 증폭의 힘들고 시간이 많이 소요되는 단계를 현저히 감소시키고, 티터 및 바이러스 분해감소를 피하였다. SF9 세포 배양 유지 및 스케일업 생산은 1배치(도6)에서대규모 단백질 생산을 채택하기 위해 고용량의 배양용기에서 수행되었다.
전체 길이 PRMT 4, 5 (MEP50복합체), 바쿨로바이러스 매개 생산 플랫폼에서 생성된 6, 7 및 9단백질은 SGC6에서운동 특성화 및 억제제 화합물 스크리닝에 사용되어 왔다. 결정 구조는 다양한 화학 프로브 및 억제제와 함께 PRMT 4, 6, 7 및 9의 단백질의 전체 길이 또는 잘린 형태에 대해 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 해결및 증착되었다. 이러한 PRMT에 대한 발현 플라스미드는 Addgene plasmid 저장소에 증착되었다(Addgene은 SGC, https://www.addgene.org/ 의 분배 파트너) 연구커뮤니티(도 5)에사용할 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> 그림 1: 바쿨로바이러스 발현 프로세스의 단계에 대한 회로도 개요는 이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> 그림 2: 바쿨로바이러스 감염 및 감염되지 않은 Sf9 세포. 감염의 징후는 세포 직경의 25-50% 증가, 확대된 세포 핵, 균일하게 둥근 모양, 증식 의 손실 및 배양 접시 표면에 대한 준수와 같은 곤충 세포의 구조적 변화뿐만 아니라 세포 생존도의 감소입니다. 흰색 스케일 바 200 μm. 여기에 제시된 감염의 표시는 전염 시약, JetPrime 및 X-tremeGene 9를 둘 다 사용하여 전염된 세포에 대해 동일합니다. 표시된 특정 예는 JetPrime 트랜스펙트 시약용입니다. (A)감염되지 않은 Sf9 세포를 대조군으로 한다. (B)바쿨로바이러스 감염 Sf9 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> 도 3: 시험 발현 단백질의 신속한 정제를 위한 결합 플레이트 어셈블리. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오, 단계 3.2.1-2이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> 그림 4: 단백질 발현 스크리닝 결과. 다른 PRMT 및 PRMT5-MEP50 복합체에 대한 상응하는 P1 재조합 바이러스에 감염된 Sf9 서스펜션 배양의 4mL에서 바쿨로바이러스 매개 단백질 생산의 단백질 발현 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> 그림 5: 토론토(SGC)의 구조 적유학 컨소시엄에서 결정 구조 연구에 사용되는 PRMT4, 6, 7 및 9에 대한 발현 구조요약. 결정 구조는 다양한 화학 프로브 및 억제제와 함께 전체 길이 또는 잘린 형태의 단백질 PRMT 4, 6, 7 및 9에 대해 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 해결및 증착되었다. 이러한 PRMT에 대한 발현 플라스미드는 Addgene plasmid 저장소에 증착되었고 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다 (Addgene은 SGC의 유통 파트너입니다, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> 도 6: Sf9 곤충 세포 유지 및 단백질 생산은 상이한 배양 용기에서: (A)2.8 L Fernbach 플라스크 세포 유지 및 단백질 생산을 위한. 72%의 충진볼륨을 사용하면 하나의 흔들림 플랫폼에서 처리량 비율이 2.5배 증가합니다. (B)Tunair 쉐이크 플라스크(이 그림에 10점 만9플라스크만 제시)와 80%의 필볼륨이 있는 시약병은 흔들림 플랫폼의 생산 능력을 크게 증가시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 생화학, 생물리, 구조 연구에 사용되는 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제(PRMT)의 발현 선별 및 생산을 위한 견고한 플랫폼이다. 밀리그램 수량의 물질은 대부분의 PRMT 및 진핵 발현 플랫폼을 요구하는 관심있는 다른 단백질을 위해 생성될 수 있다.

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 발현 플랫폼 S, baculovirus 발현 벡터 시스템의 커버리지에서 생체 화학, 생물리및 구조 연구를 위한 단백질의 밀리그램 양을 얻기 위해 대규모 생산에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제의 다중 분면 선별이다. 알마 세이토바 박사는 다음 단계를 발표할 예정입니다. 기하급수적으로 성장하는 SF9 세포를 혈청 이없는 곤충 매체에서 밀당 0.4 백만의 최종 세포 밀도로 희석하고 멸균 시약 저장소에 부어 넣습니다.24웰 플레이트의 각 웰에 희석된 SF9 세포의 0.5 mils를 시드하는 프로그래밍 가능한 다중 채널 파이펫을 사용합니다. 이 볼륨은 우물의 작동 표면의 커버리지를 보장하기에 충분합니다. 동시에, 그것은 형질 응고 효율을 가능하게 너무 많이 희석하지 않습니다.플레이트의 우물을 세포로만 라벨로 지정하고, 감염의 잠재적 징후를 평가하기 위해 전감염 및 비트랜스감염 된 세포의 비교를 위한 대조군으로 사용하십시오. 세포가 세포 배양 판에 부착할 수 있도록 필요한 때까지 약 1시간 동안 플레이트를 27도에서 배양합니다. 잘 혼합된 형질전환 시약을 보충되지 않은 곤충 배지와 멸균 시약 저장소에 희석하고 10초 동안 부드럽게 섞습니다.12채널 파이펫을 사용하여 희석된 트랜잭션 시약102마이크로리터를 멸균 96 MicroWell 플레이트로 전송합니다. 재조합 바미드 DNA의 마이크로리터 당 0.2 마이크로리터 10마이크로리터를 96웰 마이크로웰 플레이트의 해당 우물로 옮기고 부드럽게 흔들어 서 양면에서 플레이트를 두드리십시오. 복잡한 형성을 위해 15-20 분 동안 형체 혼합물을 배양합니다.96과 24웰 플레이트 사이의 전송을 위해 설계된 조정 가능한 6채널 파이펫을 사용하여, 트랜스페션 플레이트의 해당 우물에서 세포 낙하 구슬에 경질 혼합물을 오버레이하고, 27도에서 4시간 동안 배양한다. 세포의 단층 위에 배분 믹스의 분포를 보장하기 위해, 부드럽게 배양 시간 동안 앞뒤로 여러 번 접시를 흔들어. 트랜스펙트 시간 후 4~5시간 후에 는 1.5밀의 혈청 없는 곤충 매체를 추가합니다.열 불활성 태아 소 혈청과 1 % 항생제 및 항마이코틱의 10 % 최종으로 보충하십시오. 72~96시간 동안 27도 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 가능하면 하루에 한 번 부드럽게 전환 판을 흔들어 주세요.72 시간에서 96 시간 후 트랜스 페트 시간에 전염 된 세포에서 분명 감염의 표시를 찾습니다. 형질 전환 후 4~5일 후에, 감염의 표시는 반전된 현미경의 밑에 대조군 세포와 비교하여 전염된 세포에서 분명해야 하고, 세포 배양 배지로 분비되는 초기 재조합 바쿨로바이러스는 수집할 준비가 되어 있어야 합니다. P1 바이러스의 수집을 동시에 허용하기 위해 프로그래밍 가능한 전자 멀티 채널을 사용하여 P1 바이러스의 150 마이크로 리터가있는 24 개의 잘 블록에서 서스펜션 세포의 감염에서 갓 시드 된 SF9 세포의 감염.15 분 동안 집단 P1 바이러스 주식의 나머지 부분을 스핀 다운, AirPore 시트와 감염된 SF9 세포의 현탁액 문화와 24 잘 블록을 커버. 24웰 블록을 27도에서 72~96시간 동안 245°C에서 흔들어 보배합니다. 예정된 생산 시간 4일 전에, 기하급수적으로 성장하는 SF9 세포를 밀당 200만 개의 최종 세포 밀도에서 Erlenmeyer 유리로 분할하여 1%의 최종 항생제 및 항mycotic을 함유한 혈청 없는 곤충 매체의 배플로 치실을 흔들었다.이 단계는 생산 배치에서 새로운 세포의 감염을 위해 상신체에서 감염된 곤충 세포 및 P2 바이러스의 현탁액 배양을 생성합니다. 해당 P2 바이러스를 추가하고 감염된 세포를 25도 의 낮은 온도에서 배양하여 세포 성장을 늦추고 1 인치 스트로크가있는 궤도 셰이커에서 165 RPM에서 흔들립니다. 예정된 생산 시간 4일 전에, 2.8리터 Fernbach 쉐이크 플라스크에서 곤충 혈청 프리 미디어에서 기하급수적으로 성장하는 SF9 세포의 2리터를 밀당 100만 개의 세포 밀도로 한다.150 명의 RPm에서 흔들림으로 플라스크를 흔들어 150 개의 연구 과학자 애슐리 허친슨 (Ashley Hutchinson)은 다음과 같은 프로토콜을 시연 할 것입니다. 기하급수적으로 성장하는 SF9 세포와 곤충 혈청 프리 미디어 4리터를 밀당 400만 개의 최종 세포 밀도로 나누어 큰 5리터 시약병으로 나눕니다.바쿨로바이러스 감염 곤충 세포의 현탁액 배양10~12마일을 추가한다. 72~96시간 동안 섭씨 25도의 낮은 온도에서 145 RPM을 흔들어 셰이커에서 SF9 세포의 감염된 배양을 배양한다. SF9 세포에서 바쿨로바이러스 즉각적인 생산에서 PRMT 가족에서 발현되는 여러 재조합 단백질의 밀리그램 양은 5그림에서 볼 수 있듯이 생화학적 생물리학적 교육 연구에 사용된다.SGC에서, 결정 구조는 다양한 화학 프로브 및 억제제와 함께 PRMT4, 6, 7 및 9단백질의 전체 길이 또는 잘린 형태에 대한 단백질 데이터 뱅크에 증착되었다. 이러한 PRMTs에 대한 발현 플라스미드는 SGC에 의해 유전자 수집을 추가하기 위해 증착되었고 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서는 바쿨로바이러스 발현 시스템에서 대규모 생산에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제의 다중 구조의 성공적인 탐험 스크리닝을 위한 핵심 요소를 강조했습니다.정기적인 조절 가능하고 프로그래밍 가능한 멀티 채널 파이펫을 사용하면 전체 프로세스가 효율성보다 더 빠르게 증가했습니다. 세포에 대한 고성능 및 독성이 적고 재조합 바이러스 생성을 위한 트랜스페트 시약의 사용은 비용 효율적이고 이 세포 처리 형질 전환 프로토콜을 주도했습니다. 6개의 세포에 감염된 바쿨로바이러스의 현탁액 배양을 가진 단백질 생산을 위한 대규모 배치의 감염은 중요한 스타터 증폭에 있는 시간 소모적인 단계에서 노동을 현저하게 감소시다.예를 들어, 감염된 세포의 특별한 배양으로 원심분리. 그것은 물론 바이러스 저하에 있는 그들의 단단한에서 피하기에 있는 감염된 세포의 추가 취급을 제외합니다. 배양용기에서 의대규모 생산에서 현탁액 배양세포 유지보수는 높은 현장 부피로 생산량의 한계를 극복하고 대규모 플랫폼을 채택하는 데 도움이 되었다.이는 생물 반응기 또는 생산 파이프라인의 공간이 제한된 실험실에 매우 유용합니다. 우리의 프로토콜은 단백질 아르기닌 메틸 전달기 가족의 단백질에 대해 설명되었지만, 동일한 접근법은 생화학적 생물 물리학 연구를 위한 단백질의 충분한 양을 얻기 위하여 발현 플랫폼을 요구하는 그밖 단백질 가족에 적용될 수 있습니다.

production-recombinant-prmt-proteins-using-baculovirus-expression

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

곤충 세포를 준비하고 mCD1d tetramers를 생성하는 재조합 mCD1d의 proteinand의 생산의 목적으로 baculovirus으로 그들을 감염하는 방법.

곤충 세포에서 재조합 단백질의 생산 mCD1d하는 방법.

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

본 프로토콜에서는, 고유 분해 가능한 GST-태그 및 그의 작은 태그를 조합하여 재조합 단백질의 정제를 허용하는 매우 효율적이고 비용 효과적인 소량의 단백질 정제 방법을 보여준다.

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

Kindlins는 인테그린을 ​​통해 세포 부착 해 기본적인 그러나 그들의 연구는 세균의 호스트에서 재조합을 표현에서 발생하는 어려움에 의해 방해되었다. 우리는 여기에서 배큘로 바이러스에 감염된 곤충 세포에서의 효율적인 생산 방법을 설명합니다.

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

이 프로토콜에서 잠재 Sf9 세포로 잠재 플라스 미드의 과도 transfection에 의해 생산 이며 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 증폭. 상쾌한 덤플링 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 하 고 ultracentrifugation에 의해 더 집중. 이 프로토콜은 생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화에 대 한 유용 합니다.

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

이온 채널의 정화는 종종 도전, 하지만 일단 달성, 그것은 잠재적으로 수 체 외에서 조사 기능 및 채널의 구조. 여기, 표현과 포유류 bestrophin 단백질, 캘리포니아2 +의 가족의 정화에 대 한 단계적 절차 설명-Cl- 채널을 활성화.

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

배우세요 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 PRMT 단백질 대규모 생산 방법입니다. SF9 세포에서 수밀리그램의 재조합 단백질을 효율적으로 얻어 생화학 및 구조생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산

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