성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를위한 랑엔도르프 방법의 수정
May 13th, 2021
이 프로토콜은 성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를 위한 대동맥 통조림의 깊이를 포함하는 Langendorff 방법의 변형을 설명합니다.
이 프로토콜은 번거로워짐에 따라 심방 수율을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 심방 및 심실 심근세포가 동일한 소화 상태에서 동시에 격리될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 세포 및 세포 외 수준에서 심장 질환의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
8-10주 된 남성 C57 검은 6 마우스를 안락사 한 후, 조직 집게를 사용하여 xiphoid의 피부를 들어 올립니다. 그런 다음 조직 가위를 사용하여 피부를 통해 경미한 측면 절개를합니다. 피부와 근막 사이에 무딘 해부를 수행합니다.
양쪽의 V 모양으로 축실아쪽으로 피부 절개를 확장하고 흉곽을 통해 절개를 계속합니다. 그런 다음 조직 집게를 사용하여 흉골을 고정하고 흉곽을 위쪽으로 편향하여 심장과 폐를 완전히 노출시하십시오. 구부러진 집게를 사용하여 심낭을 벗깁니다.
흉선이 큰 혈관을 덮는 경우, 두 개의 구부러진 집게를 사용하여 양쪽으로 흉선을 찢어 내고 대동맥과 분기 동맥이 Y 자형 혈관으로 보일 때까지 심장의 기초를 꼬리쪽으로 부드럽게 당깁니다. 왼쪽 일반적인 경동맥에서 대동맥을 분리한 다음 브라치오셉할릭 동맥을 자른다. 심장을 절제하고 티로드의 용액이 들어 있는 페트리 접시에 즉시 담그고 잔류 혈액을 씻어내시면 됩니다.
그런 다음 하트를 용액이 들어 있는 다른 페트리 접시로 옮습니다. 스테레오 현미경에서, 미세 홍채 가위를 사용하여, 잉여 조직을 손질. 주사기에서 기포를 추방합니다.
그런 다음 두 개의 직선 묶는 집게의 도움으로 역행 대동맥 캐닝을 수행하여 전체 캐닝 과정이 액체 표면 에서 수행되는 것을 주의하십시오. 캐뉼라 팁이 오름차순 대동맥에 있도록 캐뉼레이션 깊이를 조정하여 대동맥 판막을 관통하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 매듭 3-O 봉합사를 사용하여 대어타를 캐뉼라 노치로 장식합니다.
주사기에서 용액을 부드럽게 주입하여 잔류 혈액을 씻어냅니다. 그런 다음 심장에 기포를 도입하지 않도록주의하여 랭엔도르프 장치에 캐누클 된 심장을 연결합니다. 칸엔도르프 장치에 캐뉼레이션 된 심장을 연결 한 후, 약 2 분 동안 1 개의 용액으로 심장을 견딜 수 있습니다.
일회용 멸균 폴리에틸렌 파이펫을 사용하여 용액 3의 약 2.5 밀리리터를 끌어 올려 나중에 사용하기 위해 수조에 예동을 유지합니다. 그런 다음 조직을 소화하려면, 약 11 12 분 동안 나머지 용액 3으로 심장을 perfuse. 용액 3과 관류의 처음 2 분 후, 소화가 완료 될 때까지 재사용을 위해 연동 펌프에 의해 perfusate 저수지에 퍼플 솔루션을 재활용.
심장이 부어지면 약간 창백하고 플릿산으로 변하며 이빨이 있는 집게를 사용하여 심근을 부드럽게 꼬집습니다. 각인이 보이는 경우 소화를 종료하고 장치에서 심장을 분리합니다. 동맥 및 심실 근세포를 분리하려면 집게를 사용하여 심실과 아트리아를 제거하고 다른 페트리 요리에 넣습니다.
그런 다음 미리 데워진 용액을 두 요리에 3개 추가합니다. 무딘 집게를 사용하여 조직을 탁탁 질감으로 삼각한 다음 기포를 도입하지 않고 소화를 위해 조직을 부드럽게 피펫합니다. 나머지 효소 활성을 체포하기 위해, 파이펫을 사용하여, 용액 4로 탁탁구 조직을 전송한 다음, 192회 G.에서 20초 동안 원심분리기를 실시하였다.
칼슘 역설과 칼슘 과부하를 피하기 위해, 점차적으로 세포 현탁액에 리터 칼슘 염화칼슘 당 100 밀리리터의 총 50 마이크로 리터를 추가하여 단계적으로 칼슘을 다시 소개합니다. 모든 염화 칼슘이 첨가되면 패치 클램프 연구를 위해 Tyrode의 용액에 세포를 저장하십시오. 캐니어레이션 깊이는 아리아와 그 부속물의 관류와 관련이 있습니다.
캐뉼라 팁이 오름차순 대어타에있을 때, 두 심방 부속기는 충분한 atria 관류를 나타내는 팽창된다. 그러나 캐뉼라 팁이 대동맥 뿌리에 있을 때 심방 부속술이 모두 바이젠되어 관류가 충분하지 않습니다. 상승 대동맥에서 캐너레이션에 의해 격리 된 심방 심근은 칼슘 재도입 전후대동맥 뿌리에서 캐닝에 의해 격리 된 것보다 더 높은 생존율을 보였습니다.
대조적으로, 상승대동맥 또는 대동맥 근충에 의해 격리된 심실 근세포의 생존율에 차이가 없었다. 상기 전세포 패치 클램프 는 고립된 심방 및 심실 심근세포에서 나트륨 전류의 기록뿐만 아니라, 현재 밀도는 고립된 세포의 품질이 전기생리학적 실험에 대한 요구 사항을 충족하는지 확인한다. 대동맥을 대복할 때는 결찰을 위해 충분한 선랜드를 유지해야 합니다.
그렇지 않으면, 캐뉼라는 결찰 후에 대동맥 판막을 관통할 수 있다.
개요
이 프로토콜은 성체 마우스의 심방 및 심실 근세포를 동시에 분리하기 위한 Langendorff 방법의 수정에 대해 설명합니다. 이 방법은 전기생리학적 연구를 위해 분리된 세포의 품질을 유지하면서 심방 근세포의 수율을 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 심혈관 생리학
- 세포 생물학
- 전기생리학
배경
- Langendorff 방법은 심장 관류에 널리 사용되는 기술입니다.
- 심방 및 심실 근세포를 동시에 분리하면 심장 기능에 대한 더 나은 통찰력을 제공할 수 있습니다.
- 근세포의 행동을 이해하는 것은 심장 질환을 연구하는 데 매우 중요합니다.
- 심장 질환의 정확한 실험 결과를 위해 심방 근세포의 수율을 개선하는 것이 필수적입니다.
연구 목적
- 마우스 심장에서 심방 근세포의 수율을 향상시키기 위함입니다.
- 심방 및 심실 근세포의 동시 분리를 가능하게 하기 위함입니다.
- 심장 질환의 기저에 있는 세포 메커니즘을 조사하기 위함입니다.
사용된 방법
- 성체 수컷 C57BL/6 마우스는 심장 추출을 위해 안락사되었습니다.
- 역행 대동맥 관누공이 관류를 위해 수행되었습니다.
- 심장은 소화를 위해 특정 용액으로 관류되었습니다.
- 근세포는 분리되어 전기생리학적 연구를 위해 준비되었습니다.
주요 결과
- 수정된 방법으로 분리된 심방 근세포는 더 높은 생존율을 보였습니다.
- 동시 분리는 심실 근세포의 품질에 영향을 미치지 않았습니다.
- 전기생리학적 기록은 분리된 세포의 생존성을 확인했습니다.
- 최적의 관누공 깊이는 효과적인 심방 관류에 중요했습니다.
결론
- 수정된 Langendorff 방법은 심방 근세포 수율을 개선합니다.
- 동시 분리는 심장 생리학 연구 능력을 향상시킵니다.
- 이 프로토콜은 심장 질환 메커니즘에 대한 더 나은 이해를 촉진할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Simultaneous isolation of atrial and ventricular myocytes using a modified Langendorff method addresses a critical bottleneck in cardiac target validation and mechanistic de-risking. This protocol enables high-quality, reproducible cell preparations essential for predictive electrophysiological assays and translational cardiac research. The approach supports robust early discovery and preclinical workflows by ensuring reliable access to both atrial and ventricular cell types from a single preparation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of atrial and ventricular mechanisms in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by providing viable myocytes for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in cardiac safety and efficacy assessments.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability cardiomyocytes for downstream electrophysiological assays.
- Improves assay reproducibility by controlling for cell source and preparation conditions.
- Enables scalable preparation of both atrial and ventricular cells for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular models with disease-relevant atrial and ventricular pathologies.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical cardiac safety studies.
- Reduces biological risk by validating cell quality for patch clamp and functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical cardiac research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and safety de-risking.
- Discovery Biology: Provides robust cellular substrates for mechanistic hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for electrophysiological assay development.
- Analytics: Enables direct measurement of sodium currents and cell viability for comparative studies.
- Translational Research: Bridges cellular findings to preclinical cardiac models by ensuring cell quality and relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for consistent cardiomyocyte isolation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in cardiac dissection and Langendorff perfusion.
- Needs access to specialized perfusion apparatus and patch clamp infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of cannulation and digestion steps.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or cardiac disease models.
- Careful control of cannulation depth is critical for optimal atrial cell yield and viability.
