Name: 골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 3D 바이오프린팅용 결정성 나노셀룰로오스/아가로즈 하이드로겔 생물재료 잉크를 제조하여 골수 유래 마스트 세포의 생물학적 적합성을 평가하는 방법. 이 프로토콜은 면역 세포에 대한 세포독성을 신속하게 선별할 수 있습니다.

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CNC/아가로즈/D-mannitol 매트릭스를 준비할 때 CNC와 켄 해리스, 조재영에게 기술적 조언을 해주신 알버타 이노베이트에게 감사드립니다. 우리는 또한 벤 호프만, 헤더 윈첼과 니콜 디아만타이드의 기술적 조언과 INKREDIBLE + 3D 바이오 프린터의 설정 및 교정에 대한 지원에 감사드립니다.

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이 작품은 캐나다 국립 연구 위원회와 앨버타 혁신에 의해 지원되었다.

3D 생체 mimetic 조직의 제조는 세포 외 매트릭스의 구성 요소를 모방하는 바이오 잉크의 성공적인 합병을 필요로하며, 세포 구성 요소 (들)와 함께 생체 내 조직의 생리적 유사체를 생성합니다. 이것은 생리적인 생물역학 조직을 제조할 때 1 차적인 세포의 사용을 필요로 하고, 세포를 변형시키지 않습니다. 그러나 비만 세포와 같은 1차 면역학적 세포는 특히 생잉크 매트릭스 자체에 의해 유도될 수 있는 세포독성 효과 및 현상적 변화에 취약하며, 이는 바람직하지 않다. 따라서, 마스트 세포의 생존가능성 및 표현형(표면 수용체 발현)에 대한 후보 생체물질 잉크의 효과를 신속하게 평가하는 능력은 특히 바이오잉크 매트릭스 내에 내장된 다른 세포 유형을 포함하는 복잡한 조직의 3D 바이오프린팅 이전에 매우 유리하며, 이는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요된다.
이 프로토콜의 접근은 BMMC를 배양하는 것을 포함합니다, 1 차성 마스트 세포의 예는, 미리 형성된 후보 하이...

최근 3D 배양 시스템과 3D 바이오프린팅에 대한 관심은 하이드로겔 과 하이드로겔 복합재에 주목하고 있습니다. 이러한 복합체는 점성 아직 다공성 생물미약제의 역할을 하며 생물학적 조직에 필적하는 중량별 최대 99%의 수분 함량으로 구성될 수 있다1,2,3. 하이드로겔 복합재의 이러한 특징은 생존력과 기능에 영향을 미치지 않으면서 세포의 성장을 허용합니다. 이러한 복합체중 하나는 하이드로겔 복합재, 세포 스캐폴드, 2차원(2D) 및 체외세포 배양에서 보강재료로 사용되어 온 결정성 나노셀룰로오스(CNC)이다4,5. 대부분의 경우, CNC로 구성된 행렬은 인간 각막 상피 세포6, 장 상피 세포7, 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포8 또는 뉴런과 같은 세포9에 지나치게 세포독성이 없습니다. 그러나, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 대사 활동 및 증식은 목재 계 나노셀룰로오스 복합체의 점도와 상관관계가 감소하며, 매트릭스의 조성물은 세포 기능에 대한 해로운 영향에 대해 신중하게 테스트되어야 함을 시사한다8.
유사하게, CNC는 3D 면역 세포 배양 체계에 있는 심각한 결과를 초래할 수 있던 내화시 대식세포에 있는 선동적인 반응을 유도할 수 있습니다10,11. 사실, CNC가 다른 면역 세포 반응, 특히 비만 세포에 의해 시작되는 알레르기 성 염증 반응에 영향을 미칠 수있는 방법에 사용할 수있는 데이터가 거의 없습니다. 마스트 세포는 알레르겐에 염증 반응을 활성화하는 책임이 있는 높은 친화성 IgE 수용체, FceRI를 표현하는 과립백구체입니다. 그들의 증식 및 분화는 의존형 줄기 세포 인자 (SCF), 티로신 수용체를 결합, 키트. 마스트 세포는 혈액 순환을 입력하고 이후에 모든 인간 조직에서 유비쿼터스로 분산하기 위해 말초로 이동하는 골수 전구 세포에서 파생됩니다12. 비만 세포는 3D 조직 환경에서 기능하기 때문에 체외 3D 조직 모델에서 면역 학적 과정을 연구하기위한 이상적인 면역 세포 후보입니다. 그러나, 현재까지, 비만 세포를 포함하는 시험관 내 3D 조직 모형에는 실행 가능한 없습니다.
유방 세포의 매우 민감한 특성과 외부 자극에 대한 염증 반응을 유도하는 성향으로 인해 3D 매트릭스 성분과 3D 스캐폴드로 마스트 세포를 도입하는 생체 인쇄 방법을 신중하게 고려해야 합니다. 조직 구조는 생체 재료, 즉 바이오 잉크 및 생체 재료 잉크의 두 가지 범주에서 생체 제작 될 수 있습니다. 바이오잉크는 세포가 함유된 하이드로겔 복합재이며, 생체 재료 잉크는 Groll et al.13,14에 의해 정의된 바와 같이 세포가 없는 하이드로겔 복합재라는 사실에 있습니다. 따라서 바이오잉크로 인쇄된 3D 구조에는 하이드로겔 매트릭스 내에 미리 내장된 셀이 포함되어 있는 반면, 생체 재료 잉크로 인쇄된 3D 구조는 포스트 프린팅 셀로 시드되어야 합니다. 하이드로겔 기반 바이오 잉크/생체 재료 잉크로부터의 배양 스캐폴드의 생체 제작은 압출 3D 바이오 프린터를 사용하여 가장 일반적으로 수행되며, 이는 공압 또는 기계적 으로 구동되는 피스톤14를 통해 압력을 받는 마이크로 스케일 노즐을 통해 바이오잉크/생체 재료 잉크를 압다하는 것입니다. 압출 바이오 프린터는 '상향식' 접근법으로 서로 순차적으로 쌓인 2D 단면 패턴으로 바이오잉크를 증착하여 3D 스캐폴드를 제작합니다.
압출 바이오프린팅과 호환되려면 하이드로겔 기반 바이오잉크/바이오머티리얼 잉크는 티조트로픽(전단-숱이) 특성을 소지해야 하며, 이에 따라 전단 응력을 받을 때 마이크로채널 노즐을 통해 유체와 같은 생체잉크/생체재료 잉크의 성분 하이드로겔 폴리머가 구약, 젤과 같은 상태로 되돌릴 수 있으나, 전단 응력의 제거 시 젤과 같은 상태로 되돌아갑니다. . 수분 함량이 높기 때문에 하이드로겔 기반 바이오잉크/생체 재료 잉크의 폴리머는 3D 생체 인쇄 구조의 아키텍처 및 구조적 무결성을 유지하기 위해 물리적으로 또는 동적으로 교차연결되어야 합니다. 세포가 함유된 바이오잉크의 경우, 세포는 교차 연결 과정에서 화학적 스트레스를 직접 받습니다. 바이오잉크 하이드로겔 매트릭스 내에 캡슐화된 세포를 압출하는 과정은 또한 세포를 전단 응고하여 생존가능성 및/또는 세포 사멸을 감소시킬 수 있다. 일단 3D 조직 모형이 생체 인쇄되면, 하이드로겔 매트릭스 자체및 압출 및 교차 연결 프로세스에 의해 유도된 세포 독성의 수준을 구별하기 어렵다. 이것은 세포가 하이드로겔 매트릭스 안에 미리 내장되어 있는 3D 스캐폴드의 맥락에서 특히 도전적입니다, 따라서 마스트 세포의 생존에 해악할 것이다 후속 분석을 위한 세포를 제거하는 것을 어렵게 만듭니다.
마스트 세포를 포함하는 3D 조직 구조물을 생성하는 온화한 접근은 세포 배양 정지에서 미리 인쇄된, 다공성 생물 물질 잉크 3D 발판으로 세포를 종착하는 것을 관련시킵니다, 이는 말모 세포의 타고난 능력을 활용하여 말초 조직으로 순환에서 이동하는 것을 관련시킵니다. 이 세포 파종 접근법의 장점은 두 배입니다: (i) 마스트 세포는 압출 및 교차 연결 공정으로부터 전단 및 화학적 스트레스를 각각 받지 않으며, (ii) 세포는 그들의 생존가능성에 악영향을 미치지 않고 분석을 위해 부드럽게 세척하여 노출 후 3D 스캐폴드에서 쉽게 제거될 수 있다. 2D 하이드로겔 디스크가 아닌 3D 생체 인쇄, 다공성 하이드로겔 스캐폴드에서 돛대 세포의 세포 생존가능성을 파종하고 분석하는 추가적인 이점은 3D 바이오프린트 하이드로겔 스캐폴드가 대량으로 존재하지 않는 생체 내 조직의 미세 스케일 지형 특징을 회수한다는 것입니다. 이 접근법은 비용이 많이 드는 3D 조직 공학 실험에 투자하기 전에 마스트 세포뿐만 아니라 다른 면역 세포에 대한 후보 생잉크 하이드로겔 행렬의 잠재적으로 치명적인 세포 독성 효과를 결정하는 적당하고 빠르며 비용 효율적인 접근 방식입니다.

<table><tbody><tr><td>A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid (glacial)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX0074-6</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (OmniPur)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>2125-500GM</td><td></td></tr><tr><td>아르메니아 햄스터 IgG Isotype Control, APC (clone: eBio299Arm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-4888-82</td><td></td></tr><tr><td>B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-메르캅토에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>b-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 나트륨염(NAD)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>BD 5mL 주사기(Luer-Lok 팁)</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 바늘 26G x 1/2인치</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 24웰 멀티디쉬</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>930-186</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96 웰 멀티디쉬</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130-188</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 175 cm2 플라스크 통풍</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130-191</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet Class II</td><td>Microzone Corp., Canada</td><td>BK-2-6-B3</td><td></td></tr><tr><td>BSA, Fraction V (OmniPur)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>2930-100GM</td><td></td></tr><tr><td>C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK BIOINK (3 x 3 mL 카트리지)</td><td>CELLINK LLC</td><td>IK1020000303</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td>CL1010006001</tr><tr><td>CELLINK 빈 카트리지 3cc(엔드 캡 및 팁 캡 포함)</td><td>CELLINK LLC</td><td>CSC0103000102</td><td></td></tr><tr><td>PC용 CELLINK HeartWare</td><td>CELLINK LLC</td><td>버전 2.4.1</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D 바이오프린터</td><td>CELLINK LLC</td><td>S-10003-001</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK 멸균 표준 원추형 바이오프린팅 노즐 22G</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td> NZ4220005001</tr><tr><td>CELLINK 멸균 표준 원뿔형 바이오프린팅 노즐 25G</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td></tr> NZ4250005001 <tr><td>CELLINK 멸균 표준 원뿔형 바이오프린팅 노즐 27G</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td></tr> NZ4270005001<tr><td>세포 증식 키트 II (XTT) (Roche)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11465015001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (Benchtop)</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>코닝 코스타&nbsp; 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3370</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Binder GmbH, Germany</td><td>9040-0113</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>A00-1-1102</td><td></td></tr><tr><td>D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-390-7100GM</td><td></td></tr><tr><td>F</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 폴리스티렌 코니컬 튜브, 멸균</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 폴리스티렌 코니컬 튜브, 멸균</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FceR1 alpha 단클론 항체, APC (클론: MAR-1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS), 적격, 열 비활성화된</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12484028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>Becton Dickinson & Co. USA</td><td>버전 10.6.2</td><td></td></tr><tr><td>G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, LLC</td><td>버전 8.4.3</td><td></td></tr><tr><td>H</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacyometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)</td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 나트륨 염</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodonitrotetrazolium chloride (INT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I10406-5G</td><td></td></tr><tr><td>L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>리튬 L-젖산염</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L2250-100G</td><td></td></tr><tr><td>M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 100 mL 100x (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸 설페이트(MPMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8640</td><td></td></tr><tr><td>마이크로튜브(1.7 mL 투명)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>마이크로튜브(2.0 mL 투명)</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Academic(MilliQ 초순수 생산용)</td><td>Millipore</td><td>ZMQS60001</td><td></td></tr><tr><td>N</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 주사기 필터(0.2mm PES, 25mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>725-2520</td><td></td></tr><tr><td>P</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 100mL(Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4, 칼슘/마그네슘 없음, 500mL(Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (클론: eB149/10H5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-3</td><td>PeproTech, Inc.&nbsp;</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 미디엄 1X + 2.05 mM L-글루타민(HyClone)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sarstedt 96 웰 라운드 베이스 PS 투명 마이크로 테스트 플레이트(82.1582.001)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9913213</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨, 500g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 (100 mM) 100X (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>V</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VARIOSKAN LUX 마이크로플레이트 분광 광도계 (유형: 3020)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td></td></tr></tbody></table>

골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

3차원(3D) 바이오프린팅은 패턴으로 증착되는 하이드로겔 기반 복합체(또는 생체재료 잉크)를 활용하여 어떤 세포가 증착되는지기판으로 형성한다. 많은 생체 재료 잉크는 잠재적으로 1 차 세포에 세포 독성이 될 수 있기 때문에, 비용이 많이 드는 3D 조직 엔지니어링 프로세스에서 그들의 활용 하기 전에 이러한 하이드로겔 복합체의 생체 적합성을 결정 하는 데 필요한. 바이오프린팅을 포함한 일부 3D 배양 방법은 세포가 3D 매트릭스에 내장되어 기계적 손상을 유도하지 않고 생존력 및 바이오마커 발현의 변화를 추출하고 분석하기 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜은 개념증명으로서, 결정성 나노셀룰로오스(CNC) 내장아가로즈 복합체의 생체 적합성을 평가하는 방법으로, 24웰 배양 시스템으로 제조되었으며, 마우스 골수 유래 마스트 세포(BMMC)는 세포 생존가능성 및 바이오마커 발현에 대한 유동 세포측정 분석법을 사용하여 한다.
CNC/아가로즈/D-매니톨 매트릭스에 18h의 노출 후, BMMC 생존력은 프로피듐 요오드(PI) 투과성에 의해 측정된 바와 같이 변경되지 않았습니다. 그러나, CNC/아가로즈/D-mannitol 기판상에서 배양된 BMMCs는 고친화 IgE 수용체(FcθRI) 및 줄기 세포 인자 수용체(Kit; CD117), 이는 바이오잉크 복합체에서 CNC의 양에 의존하는 것으로 보이지 는 않지만. BMMC의 생존가능성은 또한 3D 압출 바이오 프린터를 사용하여 피릴라 나노 셀룰로오스 (FNC)와 나트륨 알기네이트로 구성된 상업용 생체 재료 잉크에서 제조 된 하이드로겔 스캐폴드에 시간 과정 노출 에 따라 평가되었다. 6-48h의 기간 동안, FNC/alginate 기판은 유동 세포측정및 미세titer 분석(XTT 및 젖산 탈수소효소)에 의해 결정된 바와 같이 BMMC의 생존가능성에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 이 프로토콜은 마스트 세포와의 포스트 인쇄 시드를 위한 3D 스캐폴드로 유틸리티에 대한 후보 생체 재료 잉크의 생화학적 호환성을 신속하게 선별하는 효율적인 방법을 설명합니다.

성공적인 생체 재료 잉크 또는 배양 기판의 가장 중요한 특성 중 하나는 생체 적합성입니다. 주로, 기판은 세포 사멸을 유도해서는 안됩니다. 세포 생존력과 괴사를 정량화하는 몇 가지 미세량 계 및 유극성 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 하이드로겔 매트릭스 내에 포함된 세포를 분석할 수 없습니다. 이 프로토콜에서, 상기 언급한 제한은 BMMC를 하이드로겔 기질 또는 생체 인쇄 스캐폴드에 시드함으로써 회피된다. 특정 인큐베이션 기간(이 연구에서 6-48h)이 발생한 후, BMMC는 하이드로겔 기판 또는 생체 인쇄 스캐폴드의 기계적 중단 또는 가수분해 없이 마이크로파이프팅에 의해 쉽게 수확되며, 이는 그렇지 않으면 세포에 물리적 손상을 입힐 수 있다. 그런 다음 BMMC의 생존가능성은 유동 세포측정법을 통해 PI 투과성 방법을 사용하여 빠르게 분석된다. PI는 DNA16의 염기 쌍 사이 를 상호 작용하는 경우에만 그대로 세포막 과 형광을 가진 실행 가능한 세포에서 제외되는 막 불굴의 염...

이 프로토콜은 결정성 나노셀룰로오스(CNC)/아가로즈 복합 하이드로겔 생체재료 잉크를 마우스 골수 유래 마스트 세포와 함께 세포 표면 수용체의 세포 생존성 및 표현성 발현, 키트(CD117) 및 고친화도 이에 수용체(FcθRI)의 생체 적합성을 신속하게 평가하는 방법을 강조한다.

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

이 프로토콜은 복잡한 3D 바이오 프린팅 실험 전에 민감한 1 차 및 면역 세포에 대한 잠재적 인 세포 독성 효과에 대한 후보 생체 물질 잉크를 선별하는 쉽고 신속한 접근 방식을 제공합니다. 생체 물질 잉크 구조에 면역 세포의 배양 후, 세포는 하류 세포 독성 또는 바이오 마커 분석을 수행하기 위해 부드러운 세척에 의해 구조에서 쉽게 검색 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이식을 위해 향하는 생체 인쇄 조직이 1 차 세포 및 생체 적합성 생체 재료 잉크로 구성되어야하는 조직 공학과 직접 관련이 있습니다.시작하려면 INKREDIBLE+3D 바이오 프린터에 설치할 바이오 잉크 카트리지를 준비합니다. 먼저, 3밀리리터 생체 재료 잉크 카트리지에서 파란색 엔드 캡을 제거하고 멸균 22 게이지 원식 생체 인쇄 노즐을 바이오 잉크 카트리지의 Luer 잠금 단말에 부착합니다. 인쇄헤드 하나 또는 PH1용 기압 공급 튜브를 카트리지의 반대쪽 끝에 연결하고 연결된 원뿔형 생체 인쇄 노즐을 PH1의 수직 슬롯에 삽입합니다.다음으로, 인쇄물 아래에 확장된 원물 생체 인쇄 노즐로 PH1의 카트리지를 단단히 고정합니다. PH1의 나사를 손가락이 단단히 고정하여 생체 잉크 카트리지를 제자리에 고정할 때까지 시계 방향으로 조입니다. 3D 바이오프린팅은 PH2가 비어 있으면 수행할 수 있습니다.바이오 프린터의 전원을 켜고 USB 2.0 케이블을 통해 3D 바이오 프린터에 연결된 PC에서 바이오 프린터 소프트웨어를 실행합니다. 소프트웨어에서 연결 버튼을 클릭하여 3D 바이오 프린터와 동기화합니다. 3D 바이오 프린터의 메인 컨트롤 메뉴에서 세 가지 옵션을 관찰하십시오.첫째, 바이오 프린트를 준비합니다. 둘째, 유틸리티 메뉴. 셋째, 상태 화면.준비 된 생체 인쇄 옵션을 선택한 다음 아래로 스크롤하여 홈 축 옵션을 선택합니다. XYZ 축을 성공적으로 보정한 후 인쇄 베드의 높이가 약간 낮아지고 인쇄 헤드가 인쇄 베드의 중심점 위로 이동합니다. 24웰 플레이트에서 바이오프린팅을 위한 시작점 보정을 진행하려면 밀봉된 플라스틱 래핑에서 멸균 24웰 배양판을 제거하고 영구 마커로 플레이트 밑면의 잘 D1의 중심점에 점을 표시한다.플레이트 커버를 제거하고 인쇄 침대의 왼쪽 왼쪽 모서리에 잘 D1이있는 인쇄 침대에 24 웰 문화 판을 놓습니다. 주 컨트롤 메뉴에서 유틸리티 메뉴를 선택한 다음 축을 이동합니다. PH1의 원물 생체 인쇄 노즐이 잘 D1 아래에 표시된 점 위에 직접 올라갈 때까지 X 및 Y 축을 따라 인쇄 헤드를 1밀리미터 단위로 이동합니다. 필요한 경우 인쇄 헤드를 0.1밀리미터 단위로 이동하여 원물 바이오 프린팅 노즐의 위치를 도트 위에 미세 조정합니다.3D 바이오 프린터의 제어판 화면에 표시된 대로 잘 D1의 중앙을 직접 위에 있을 때 원물 생체 인쇄 노즐의 X 및 Y 좌표를 기록하고 좌표를 표시합니다. 다음으로, 잘 D1의 바닥이 거의 인쇄 헤드 하나에 설치된 원뿔 형 바이오 프린팅 노즐을 만질 때까지 1 밀리미터 단위로 인쇄 침대를 올립니다. 필요한 경우 인쇄 베드의 움직임을 0.1밀리미터 단위로 미세 조정합니다.유틸리티 메뉴에서 Z 축 보정 옵션을 선택하고 추가로 Z 보정 옵션을 선택하고 확인합니다. 메인 메뉴로 돌아가 준비 된 바이오 프린트 옵션을 선택합니다. 아래로 스크롤하여 교정 Z 옵션을 선택합니다.올바른 시작점 좌표로 24웰 플레이트 기하학적 코드 또는 G 코드를 업데이트합니다. 바이오 프린트 소프트웨어에서 제공된 24웰 G 코드 파일을 엽니다. 이전 단계에서 얻은 값으로 줄에 X 및 Y 좌표를 업데이트하고 새 이름으로 파일을 저장합니다.공압 펌프가 INKREDIBLE+3D 바이오 프린터의 후방 공기 섭취 포트에 단단히 연결되어 있는지 확인하고 켭니다. INKREDIBLE+3D 바이오 프린터의 오른쪽에 있는 전방 제어 노브를 꺼내십시오. 바이오 프린터 전면에 위치한 PH1 및 PH2용 디지털 압력 게이지가 각각 0킬로파스칼에 가깝게 읽히도록 합니다.PH1의 왼쪽 게이지에 표시된 압력이 12킬로파스칼에 도달할 때까지 전방 제어 노브를 시계 방향으로 천천히 회전합니다. 접힌 티슈 페이퍼 나 설치된 카트리지의 인쇄 노즐 아래에 방수 밀봉 필름 을 놓고 인쇄 노즐을 만지지 않도록주의하십시오. 3D 바이오 프린터의 주요 제어 메뉴에서 생체 인쇄를 준비하십시오.PH1로 이동하여 켜기를 선택합니다. 바이오 잉크가 인쇄 노즐에서 돌출되기 시작합니다. 필요한 경우, 바이오 잉크가 연속 필라멘트에서 압출될 때까지 제어 노브를 시계 방향으로 회전시켜 압출 압력을 증가시키고 새로운 압력 설정을 기록한다.바이오 잉크의 압출을 중지하려면 PH1을 끄십시오. 인쇄 침대에서 압출 된 바이오 잉크가 들어있는 티슈 페이퍼 또는 필름을 제거하고 바이오 프린터 문을 닫습니다. 24웰 플레이트 형식으로 직선 하이드로겔 기판의 3D 바이오프린팅을 수행하려면 메인 컨트롤 메뉴에서 유틸리티 메뉴를 선택한 다음 바이오 프린터 소프트웨어가 인쇄를 위해 G 코드 파일을 3D 바이오 프린터로 전송할 수 있도록 사용하지 않도록 설정합니다.바이오 프린터 소프트웨어의 로드 버튼을 클릭하고 업데이트된 24웰 플레이트 G 코드 파일을 선택합니다. 소프트웨어의 오른쪽 제어판에서 인쇄 미리 보기 탭을 선택하고 인쇄 버튼을 클릭하여 잘 D1에서 바이오 프린팅을 시작합니다. 직선 구조의 바이오 프린팅이 완료되면 뚜껑으로 24웰 플레이트를 덮고 클래스 II 생물 안전 캐비닛으로 이동합니다. 각 직사각형 구조에 멸균 50 밀리몰라 칼슘 염화 칼슘 용액 2방울을 담그고 실온에서 5분간 배양합니다.각 우물에서 염화물 칼슘 용액을 조심스럽게 흡인시키고 1X PBS의 1밀리리터에 한 번 헹구어 염화칼슘을 제거합니다. 생체 인쇄 하이드로겔 구조의 탈수를 방지하기 위해 골수 유래 돛대 세포가 구문에 시드될 때까지 3D 생체 인쇄 직사각형 구조를 신선한 1X PBS로 유지합니다. 유동 세포측정에 의해 분석된 BMMC의 전방 및 측면 산란 파라미터에 기초하여, CNC 농도가 가장 높은 하이드로겔 기판은 CNC 아가로즈 D-mannitol 하이드로겔 기판이 없는 경우 배양된 BMMC와 비교하여 BMMC의 원모 크기 또는 세분성을 변경하지 않은 것으로 관찰되었다.BMMC의 투과성 유동 분석에서 요오드데를 프로비티드화하는 것은 CNC 농도 중 어느 것도 BMMC 생존가능성에 어떤 악영향을 미치지 않는다는 것을 입증했다. CNC 아가로즈 기판은 CNC 농도에서 마스트 세포 바이오마커의 발현을 2.5%보다 높거나 2.5%로 증가시켰지만, 이러한 수용체의 발현 수준은 2.5%와 12.5%CNC 사이에서 비교적 일관되게 유지되어 CNC의 농도와 무관하다는 효과를 시사한다. XTT 분석은 3D 생체 인쇄 하이드로겔 스캐폴드에서 배양된 BMMC의 대사 활성이 모든 테스트 된 시간 지점에서 약 100 %로 비교적 일관되게 유지되었다는 것을 입증했습니다.마찬가지로, LDH 릴리스 및 PI 염료 배제 아세서는 BMMC의 생존 가능성에 큰 변화가 없음을 밝혔습니다. 돛대를 회수할 수 있는 용이성은 세포 기능의 어떤 양상든지를 추가로 연구하기 위하여 생물학 적인 약서의 넓은 범위에 의해 탐구될 수 있습니다.

fabrication-crystalline-nanocellulose-embedded-agarose-biomaterial

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Arias, S. L. 외 산화철 나노입자를 이용한 기능화된 자성 박테리아 나노셀룰로오스 제조.  J. Vis. 경험 (2016년).이 영상은 만니톨이 포함된 영양 배지에서 셀룰로오스 생성 박테리아를 배양하여 나노셀룰로오스를 생산하는 과정을 시연합니다. 박테리아는 만니톨을 포도당으로 대사하고, 포도당은 중합되어 글루칸 사슬로 압출되어 셀룰로오스 시트로 결정화되어 공기-액체 계면에서 3차원 매트릭스를 형성합니다. 생성된 젤라틴성 펠리클은 수확하여 알칼리성 및 물 세척으로 정제한 후 오토클레이빙으로 멸균하여 추가 적용을 위해 사용한다.

셀룰로오스 생성 박테리아로부터 나노셀룰로오스 펠리클 제조

여기에서는 손상된 혈관 재건에 응용하기 위해 박테리아 나노셀룰로오스(BNC)를 자성화하는 프로토콜을 제시합니다. BNC는 G. xylinus 균주에 의해 합성되었습니다. 한편, BNC의 자화는 BNC 메쉬 내부의 Fe2+ 및 Fe3+ 철 이온의 현장 침전을 통해 실현되었습니다.

철 산화물 나노 입자와 기능화 자기 세균 Nanocellulose의 제작

연골과 피부 아날로그 bioprinted nanocellulose-alginate 근거한 bioink를 사용 하 여 했다. bioinks 번 수동 혼합 장치를 통해 인쇄 하기 전에 cellularized 했다. 구문 균일 하 게 cellularized, 높은 생존 능력, 그리고 차별화의 유리한 마커 전시를 시연 했다.

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

이 프로토콜 사용자 정의 3D 인쇄 하는 플라스틱 금형을 사용 하 여 변수 크기의 자기 조립된 조직 반지 날조를 위한 플랫폼을 설명 합니다. PDMS 원판 3D 인쇄 형;에 치료 된다 다음 agarose 치료 PDMS 원판에 캐스팅 됩니다. 세포는 그들은 조직의 반지로 집계 결과 agarose 우물에 시드.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

이 프로토콜의 3 개의 중요 한 단계는 i) 개발 올바른 구성 및 일관성 ii) 3D로 다양 한 장비의 인쇄 셀 루 로스 히드로 잉크의 기 공 구조 좋은 모양 충실도 및 치수와 iii)의 데모는 연골 재생에 대 한 시뮬레이션 된 신체 조건에서 기계적 속성.

3D 인쇄 다공성 셀 루 로스 나노 하이드로 겔 건설 기계

여기에 제시된 젤라틴 메타크릴로일의 3D 바이오프린팅을 위한 방법이다.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

여기서 우리는 중추 신경계에 있는 성상세포의 기능 및 신경질 세포와 관련시키는 기계장치를 연구하기 위하여 신경같이 조직을 biofabricating을 위한 3D 생물 인쇄 murine 피질 성상 세포의 방법을 보고합니다.

신경과 같은 조직을 위한 Murine 피질 성상 세포의 3D 생물 인쇄

이 프로토콜은 젤라틴 기반 과립 지지체에 인산 칼슘 잉크를 증착하여 뼈와 같은 구조를 제조하는 3D 프린팅 기술을 설명합니다. 인쇄된 뼈 유사체는 다상 구축물을 위한 살아있는 세포 매트릭스 내에서 인쇄물의 직접 수확 또는 가교를 위한 유연성과 함께 자유 형태로 증착됩니다.

뼈 유사체 생성을 위한 세포 함유 현탁액의 세라믹 전방향 바이오프린팅

하이드로겔 형성 중 전단 처리는 전단력이 제거된 후 전단이 얇지만 빠르게 재구성되는 마이크로겔 현탁액의 생성을 초래합니다. 이러한 물질은 바이오프린팅 복합체, 세포 함유 구조의 지지 매트릭스로 사용되었습니다. 여기서는지지 베드 및 호환 가능한 바이오 잉크를 제조하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.

부유 된 3D 바이오 프린팅을위한 겔화 동안 전단 처리에 의해 형성된 Agarose 유체 겔

이 연구는 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질 복합체 내부의 신경 줄기 세포의 자유형 임베디드 3D 프린팅을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 높은 충실도로 상호 연결된 인간 신경 조직 구조의 프로그래밍 가능한 패터닝을 가능하게 합니다.

인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

배우세요 3D 바이오프린팅용 결정성 나노셀룰로오스/아가로즈 하이드로겔 생물재료 잉크를 제조하여 골수 유래 마스트 세포의 생물학적 적합성을 평가하는 방법. 이 프로토콜은 면역 세포에 대한 세포독성을 신속하게 선별할 수 있습니다.

골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조

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