Name: 1차 섬모 평가에 대한 인공 지능 접근 방식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 학습하세요 인공지능 기반 1차 섬모 자동 식별 및 정량 분석 방법을. 다양한 세포 유형과 조직에서 섬모 길이, 형광 강도, 공동국소화를 고속 재현 가능하게 측정하여 세포생물학 연구의 엄격성과 신뢰성을 높입니다.

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이 작품은 NFB에 당뇨병과 소화 및 신장 질환 R01 DK114008및 RB에 #18PRE34020122 미국 심장 협회 펠로우십 보조금의 국립 연구소에 의해 투자되었다. 니콘 소프트웨어, 멜리사 벤틀리, 코트니 헤이크래프트, 테레사 마스트라치의 리치 그루스킨 총괄 매니저에게 원고에 대한 통찰력 있는 의견을 감사드립니다.

1. 원시 이미지 획득
<ol><li>필요에 따라 수정 및 면역 라벨 샘플20.<ol>
<li>Nyquist 해상도와 동일한 픽셀 크기를 사용하여 최대 비트 깊이에서 공초점 현미경을 사용하는 이미지 섬모.</li>
		<li>이미지를 흑백 태그 이미지 형식(.tif) 파일로 내보냅니다. 참고: 이 프로토콜은 NIS Elements 소프트웨어 내에서 특히 Ai 모듈을 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이미지를 .nd2 파일로 획득한 경우 이미지를 .tif 파일로 내보낼 필요가 없으며 사용자는 2.3단계로 직접 진행할 수 있습니다. 다른 시스템에서 이미지를 획득한 경우 NIS Elements 라이선스를 별도로 구매할 수 있으며 다음 단계에서 설명된 대로 파일을 변환할 .tif 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 섬모를 식별하기 위해 Ai를 훈련
<ol><li>교육 데이터 집합을 엽니다.<ol>
<li>프레임당 최소 하나의 실슘이 있는 약 50개의 샘플 이미지를 선택하여 소프트웨어를 학습하고 단일 폴더에 복사합니다. 이 폴더는 이미지를 열 때 소프트웨어를 지시하는 데 사용됩니다. 프레임당 하나 이상의 실슘이 있는 단일 ND2 문서 내에서 이 50프레임을 엽니다. 파일 > 가져오기/내보내기 > 파일 시퀀스에서 ND 파일 만들기를 선택합니다.</li>
		<li>교육 데이터 집합이 포함된 폴더를 선택합니다. 이렇게 하면 대화 창 중앙에 있는 파일 목록이 열립니다. 위의 드롭다운 메뉴에서 하나 이상의 옵션을 사용하여 파일 구성을 수동으로 정의합니다. 옵션은 멀티포인트(여러 최대 투영 파일의 경우), Z 시리즈(z 스택 이미지의 경우), 시간(시간 경과 이미지용), 파장(여러 채널의 파일)입니다.</li>
		<li>선택한 각 옵션 아래에 해당 숫자 값을 입력합니다. 옵션을 선택하지 않는 경우 없음을 선택합니다. 변환을 클릭하여 ND 문서를 엽니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지를 보정합니다.<ol>
<li>이미지의 왼쪽 아래 모서리에 있는 픽셀 크기를 입력 > >합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>섬모를 식별합니다.<ol>
<li>이진 도구 모음에서자동 감지 또는 그리기 오브젝트를 사용하여 열린 모든 프레임에서 개별 섬모 구조를 정확하게 추적하여 섬모를 손으로 식별합니다. 이렇게 하면 관심 있는 개체에 이진 마스크를 그립니다. 이러한 바이너리는 향후 실험 이미지 분석에서 픽셀 기반 특성에 대한 섬모를 식별하도록 소프트웨어를 학습하기 위한 샘플 개체역할을 합니다. > 분석 컨트롤 보기 > 이진 도구 모음 > 그리기 개체를 선택합니다. 참고: 열린 모든 프레임에서 바이너리를 감지하지 않는 한 소프트웨어가 교육을 시작하지 않으므로 바이너리가 없는 프레임을 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ai 를 훈련하십시오.<ol>
<li>소프트웨어 교육을 시작합니다. 이 Segment.ai 기차를 엽니 다. NIS.ai > 기차 Segment.ai선택합니다.</li>
		<li>기차 Segment.ai 상자에서 훈련에 사용할 소스 채널을 선택합니다. 여러 채널의 파일이 열려 있는 경우 하나의 채널만 소스 채널로 선택합니다. 그런 다음 Ai를 훈련할 적절한 지상 진실 바이너리를 선택하십시오. 마지막으로 바이너리의 크기와 분포에 따라 Ai를 훈련하는 데 필요한 반복 수를 선택합니다. 참고: 바이너리를 주변에서 쉽게 감지하고 이미지 전체에 잘 분산되어 있는 경우 이미지를 식별하기 위해 교육을 받으려면 1,000회 미만의 반복이 필요할 수 있습니다. 이미지에 신호 대 잡음 비율이 낮은 경우 Ai가 높은 확신을 가지고 테스트 샘플에서 섬모를 식별할 수 있도록 훈련하는 동안 최소 1,000회 반복을 실행하는 것이 이상적입니다.</li>
		<li>대상 폴더를 선택하여 숙련된 Ai 파일(.sai)을 저장하고 Train을 클릭하여 소프트웨어를 학습합니다. 이 소프트웨어는 이제 추적 된 바이너리에 따라 섬모를 식별하기 위해 자신을 훈련하기 위해 진행됩니다. 이 프로세스는 몇 시간이 걸립니다. 참고: 교육을 받을 때 소프트웨어에는 교육 손실을 보여주는 그래프가 표시됩니다. 그래프는 처음에 이상적으로 약 1 % 손실로 가시화하기 전에 스파이크를 표시합니다 어디 그것은 훈련의 나머지 부분에 대한 고원. 기차 Segment.ai 상자(보충 도 1)에서 그래프 화면 저장 상자에 대한 상자를 선택하여 향후 참조를 위해 그래프를저장합니다.</li>
		<li>교육에 대한 추가 개선이 필요한 경우 동일한 데이터 집합에 대한 교육을 계속합니다. 또는 동일한 매개 변수를 사용하여 새 데이터 집합을 학습합니다. 이미 훈련된 Ai를 서로 다른 매개 변수 또는 다양한 관심 있는 개체가 있는 새 데이터 집합에 교육하는 것은 바람직하지 않습니다. 훈련된 ai 파일을 선택하기 > 훈련을 계속하기 segment.ai > 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 숙련된 Ai를 사용하여 섬모를 식별
<ol><li>실험 데이터 집합을 엽니다.<ol>
<li>샘플 .tif 파일을 2.1 단계와 유사한 .nd2 파일로 변환하여 소프트웨어에서 섬모의 실험적 공초점 이미지를 엽니다. 파일 > 가져오기/내보내기 > 파일 시퀀스에서 ND 파일 만들기를 선택합니다. 참고: 이미지는 Ai 교육에 사용되는 이미지와 동일한 픽셀 크기여야 합니다. 이미지가 이미 ND2 형식인 경우 3.3단계로 건너뜁니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지를 보정합니다.<ol>
<li>이미지의 왼쪽 아래 모서리에 픽셀 크기를 입력합니다. 픽셀 크기를 > 문서를 보정할 > 보정해제를클릭하려면 마우스 오른쪽 단추를 클릭합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열린 파일에서 학습된 Ai를 실행합니다.<ol>
<li>Ai를 사용하여 섬모를 식별하기 시작합니다. 이 소프트웨어는 이제 이전 단계에서 받은 교육에 따라 섬모에 바이너리를 그립니다. 이 프로세스는 몇 초 정도 걸릴 것입니다. NIS.ai > Segment.ai선택합니다. 참고: 여러 채널이 열려 있으면 소프트웨어가 채널을 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 채널은 해당 이름으로 나열됩니다. 그렇지 않은 경우 'Mono'로 표시된 상자가 자동으로 선택됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>잘못 식별된 바이너리에 대한 이미지를 확인합니다.<ol>
<li>Ai가 섬모와 그려진 바이너리를 확인하면 실수로 식별된 개체가 이미지를 확인합니다. 원하는 경우 잘못 식별된 바이너리를 수동으로 삭제합니다. 개체 삭제 > 이진 도구 모음> > 분석 컨트롤 보기 를 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 섬모 길이와 강도 측정
<ol><li>새로운 일반 분석 3(GA3) 레시피를 만듭니다.<ol>
<li>이제 섬모가 식별되고 세분화되었으므로 GA3 도구를 사용하여 길이 및 강도와 같은 섬모의 다양한 매개 변수를 분석합니다. 이렇게 하면 분석이 정의될 중앙에 빈 공간이 있는 새 창이 열립니다. 새로운 GA3 레시피> 이미지를선택합니다.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석할 바이너리를 선택합니다.<ol>
<li>섬모는 이미 Segment.ai 사용하여 분할되어 있기 때문에 GA3는 Ai에 따라 적절하게 표시된 바이너리를 자동으로 감지하고 노드를 포함합니다. '바이너리 > 자동 Detect_AI' 또는 '바이너리 > Object_AI 그리기'를선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석에 필요한 채널을 선택합니다. GA3는 또한 이미지의 채널을 자동으로 감지하고 채널아래에 탭을 표시합니다.</li>
	<li>프레임 의 테두리에 닿는 오브젝트를 제거합니다.<ol>
<li>Ai는 프레임의 오브젝트처럼 모든 섬모를 분할하므로 프레임 가장자리를 따라 불완전한 섬모를 감지합니다. 이러한 개체는 3.4 단계에서 수동으로 제거하거나 GA3에서 자동으로 제거할 수 있습니다. 터치 테두리> 개체를 제거할 > 바이너리 처리를 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>섬모를 측정하기 위해 매개 변수를 선택합니다.<ol>
<li>항문길이(길이)및강도(합계 개체 강도)와같은 측정매개변수를 드래그앤드롭한다. 노드를 적절한 이진 노드(연결 A) 및 채널 노드(연결 B)에 연결합니다. 도구 설명에 대한 노드 연결 위로 마우스를 가져가노드에 속한 연결을 표시합니다. 개체 크기 > 길이 및 측정 > 개체 강도 > 합계 Obj 강도를 > 측정을 선택합니다. 참고: 노드 길이는 이진 노드에만 연결되지만 Sum Obj Intensity는 바이너리 노드와 채널 노드 모두에 연결됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단일 테이블에 측정값을 더합니다.<ol>
<li>노드 부록 열을 분석 흐름 차트에 드래그하고 떨어뜨려 단일 출력 테이블에 모든 측정값을 결합하고 측정 노드, 길이 및 Sum Obj 강도에연결합니다. 기본 > 부록 을 > 데이터 관리선택</li>
	</ol>
</li>
	<li>섬모를 측정합니다.<ol>
<li>실행을 클릭하여 섬모를 측정합니다. 이 프로세스는 실험 이미지의 모든 섬모를 측정하는 데 몇 분 정도 걸립니다. 길이와 강도는 새 분석 결과 창에 나타납니다. 참고: 테이블에는 Ai가 섬모로 인식되었지만 인간의 눈에 의해 감지되지 않고 3.4 단계에서 제거하기에는 너무 작아진 마스크의 데이터가 포함될 수 있습니다. 이러한 개체는 통계 분석 전에 필터를 사용하여 데이터 집합에서 제거할 수 있습니다. 여기서, 생체 내 실리아용 도 2 및 2 μm에서 체외 실리아 길이 측정에 1 μm의 필터가 사용되었다. 이 작업은 아래 경로를 사용하여 데이터를 내보내기 전에 수행할 수 있습니다. 분석 결과 창을 선택하고 > 필터를 정의> 필터 를 입력 > 필터를 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>통계 분석을 위해 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>5. 지역화 연구
참고: 지역화 분석은 섬모 길이 및 강도 분석 의 측정에 사용되는 동일한 GA3 레시피에 포함될 수 있습니다. 아래에 설명된 것과 동일한 레시피를 사용하는 경우 파일을 열고 동일한 분석 파이프라인의 지역화 계수와 함께 두 채널의 길이와 강도를 측정합니다.
<ol><li>실험 데이터 집합을 엽니다.<ol>
<li>샘플 .tif 파일을 .nd2 파일로 변환하여 소프트웨어에서 섬모의 실험적 공초점 이미지를 엽니다. 파일 > 가져오기/내보내기 > 파일 시퀀스에서 ND 파일 만들기를 선택합니다.</li>
		<li>팝업 창에서 팝업 창의 첫 번째 열에 있는 창 탐색기의 모든 관심 채널에서 16비트 깊이 흑백 파일을 선택합니다. 첫 번째 드롭다운 메뉴에서 멀티포인트 또는 Z 시리즈를 선택하고 총 이미지 또는 스택 수에 해당하는 값을 각각 입력합니다.</li>
		<li>두 번째 드롭다운 상자에서 파장을 선택하고 값을 폴더의 총 채널 수로 변경합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 팝업 창의 오른쪽 하단에있는 파장 선택 창의 잠금을 해제합니다. 색상 드롭 다운 메뉴를 사용하여 각 채널의 색상을 선택합니다. 각 채널에 이름 열 아래에 다른 이름을 제공합니다. 모든 정보가 업데이트되면 변환을클릭합니다. 이 소프트웨어는 선택한 모든 채널의 모든 개별 이미지와 오버레이된 모든 이미지 파일을 자동으로 생성합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미지를 보정합니다.<ol>
<li>이미지의 왼쪽 아래 모서리에 픽셀 크기를 입력합니다. 픽셀 크기를 > 문서를 보정할 > 보정해제를클릭하려면 마우스 오른쪽 단추를 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>첫 번째 채널에서 숙련된 Ai를 실행합니다.<ol>
<li>열린 채널 중 하나에서 섬모 를 식별하기 시작하십시오 (예 : ACIII; 그림 5A) Ai를 사용하더라. 이 소프트웨어는 이제이 채널에 대해 받은 교육을 기반으로 ACIII 라벨 섬모에 바이너리를 그릴 것입니다. 이 프로세스는 몇 초 정도 걸릴 것입니다. NIS.AI > SEGMENT.AI > 원본 채널을 > ACIII를 선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>두 번째 채널에서 숙련된 Ai를 실행합니다.<ol>
<li>다른 열린 채널(예: MCHR1)에서 섬모 식별을 시작합니다. 그림 5B) Ai를 사용하더라. 이 소프트웨어는 이제이 채널에 대해 받은 교육을 기반으로 MCHR1 라벨 섬모에 바이너리를 그릴 것입니다. 이 프로세스는 잠시 걸릴 것입니다. MCHR1> NIS.ai > Segment.ai > 소스 채널을 선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>잘못 식별된 바이너리에 대한 이미지를 확인합니다.<ol>
<li>Ai가 섬모와 그려진 바이너리를 확인하면 이미지가 잘못 식별된 개체에 대해 확인합니다. 필요한 경우 잘못 식별된 바이너리를 수동으로 삭제합니다. 개체 를 삭제하기 > 바이너리 도구 모음> > 분석 컨트롤 보기를 선택합니다.
</li>
	</ol></li>
	<li>새로운 GA3 레시피를 만듭니다.<ol>
<li>이제 섬모가 식별되고 세분화되었으므로 GA3 도구를 사용하여 공동 지역화 분석을 진행합니다. 이렇게 하면 분석이 정의될 중앙에 빈 공간이 있는 새 창이 열립니다. 식별된 모든 바이너리 및 채널이 있는 창이 생성됩니다. 분석에 필요한 모든 원하는 채널과 바이너리가 존재하고 선택되었는지 확인합니다. 새로운 GA3 레시피> 이미지를선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프레임 의 테두리에 닿는 오브젝트를 제거합니다.<ol>
<li>Ai는 프레임의 모든 섬모와 같은 오브젝트를 분할하므로 프레임 가장자리를 따라 불완전한 섬모를 감지합니다. 이러한 개체는 5.5 단계에서 수동으로 제거하거나 GA3에서 자동으로 제거할 수 있습니다. 접기 테두리를 > 개체를 제거할 > 바이너리 처리를 선택합니다.
</li>
	</ol></li>
	<li>GA3에 지역화 경로를 설정합니다.<ol>
<li>섬모 내의 두 채널의 중복을 측정하려면 Mander의 계수 상관 관계를 사용합니다. Manders 계수 노드를 GA3 레시피의 빈 공간으로 드래그하고 놓고 적절한 바이너리 및 채널에 연결합니다. 여기서 '연결 A'는 ACIII 바이너리, MCHR1 채널과 '연결 B', ACIII 채널과 '연결 C'를 연결하여 ACIII 바이너리 내에서 MCHR1의 중복을 결정합니다. 측정 > 오브젝트 비율 측정 > 만더계수를 선택합니다. 참고: 이 소프트웨어는 이프로토콜(40)에설명된 것과 동일한 단계를 사용하여 Pearson 계수 상관관계를 사용하여 지역화를 측정할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>단일 테이블에 측정값을 더합니다.<ol>
<li>모든 측정값을 단일 출력 테이블에 결합합니다. 기본 > 부록 을 > 데이터 관리선택</li>
	</ol></li>
	<li>공동 지역화를 측정합니다.<ol>
<li>실행을 클릭하여 섬모를 측정합니다. 이 프로세스는 실험 이미지의 모든 섬모를 측정하는 데 몇 분 정도 걸립니다. 데이터는 새 분석 결과 창에 나타납니다.</li>
	</ol></li>
	<li>통계 분석을 위해 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>

공동 저자 웨슬리 루이스는 니콘의 직원입니다. 재정 적 공개는 없습니다.

길이 및 강도 측정은 1차 섬모를 분석하는 일반적인 방법이지만, 현장에서 사용되는 표준화된 종래의 방법은 없다. ImageJ와 같은 소프트웨어를 사용하여 기본 섬모를 식별하고 정량화하는 것은 시간이 많이 걸리며 사용자 편향및 오류가 발생하기 쉽습니다. 따라서 대규모 데이터 집합을 정확하게 분석하기가 어렵습니다. 여기서 우리는 Ai 프로그램을 사용하면 1 차 섬모의 높은 처리량 분석을 달성 할 수있는 이러한 도전의 대부분을 극복 할 수 있음을 보여줍니다. 여기서 우리는 기본 섬모를 인식하고 길이와 강도를 분석하는 데 필요한 단계를 설명하기 위해 Ai 기반 응용 프로그램을 교육하는 절차를 설명합니다.
Cilia를 인식하는 Ai의 초기 교육은 사용자의 상당한 시간이 필요하지만 완료되면 동일한 매개 변수로 획득한 모든 데이터 집합에 사용할 수 있습니다. Ai에 의해 생성된 이진 마스크는 수정할 수 있도록 모든 오류를 수정할 수 있습니다. 그러나 cilia 식별오류는 Ai가 추가 이미지로 더 자세히 교육되어야 한다는 신호를 사용자에게 표시해야 합니다. 이 방법의 한 가지 주요 장점은 Ai가 2D 및 3D 모두에서 다른 샘플 유형에서 섬모를 인식하도록 훈련될 수 있다는 것입니다. 실험실 내에서 생성된 이전 분석 방법은 세포 밀도가 높은 조직 섹션에서 이미지된 섬모를 식별하는 식별 및 식별을 위한 수동 임계값을 요구하는 것을 포함하여 다양한 한계를 갖는다36,46,47. 이러한 방법은 CIlia 분석을 전문으로 하는 반면 NIS Elements 소프트웨어를 사용한 분석은 이미지의 여러 측면을 동시에 평가할 수 있습니다. 여기에 설명된 Ai는 NIS Elements 소프트웨어 패키지의 일부이기 때문에 니콘 현미경을 사용하여 획득한 이미지는 분석을 통해 쉽게 계속될 수 있습니다. 그러나, Nikon와 화상 진찰은 이 방법의 사용을 위해 필요하지 않습니다. 캡처된 원시 데이터 파일 형식에 관계없이 NIS Elements에서 ".tif" 파일을 열어 Ai에서 사용할 수 있습니다.
NIS Elements 내의 이 Ai 응용 프로그램은 기본 섬모를 연구하는 실험실에서 사용할 수 있는 이미지 분석 소프트웨어의 일부로 널리 사용되고 있습니다. Ai 기술의 보급이 확대되면서 다른 이미징 소프트웨어는 유사한 Ai 모듈을 포함하도록 분석 옵션을 확장할 수 있습니다. 섬모 식별에 Ai 분석을 적용하는 것은 섬모 분석의 여러 가지 측면에 사용할 수 있습니다. 길이(도 2 및 3),강도(도4)및 지역화(도5)와같은 몇 가지 간단한 분석을 위한 방법을 설명했지만, 도 6에서와 같이 GA3 분석 워크플로우에 보다 정교한 분석을 추가할 수 있다. 예를 들어 완전한 실륨의 강도를 측정하는 대신, 실륨의 하위 영역 내의 강도 차이는 하위 섬 지역화를 평가하는 데 관심이 있을 수 있습니다. 실륨의 하위 영역 내의 강도 차이는 글리단백질이섬모(48)의끝에서 어떻게 농축되는지 와 같은, 질륨의 끝 또는 기저에 단백질이 축적되고 있음을 나타낼 수 있다. 또한, 본 Ai 응용 프로그램은 유전자형 또는 치료 단 간의 차이를 쉽게 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 실험실은 주로 뇌 섹션 또는 신경 배양에서 이미지 된 섬모를 분석하기 위해이 방법을 사용하는 동안, 그것은 다양한 세포주 또는 다른 조직 유형에서 획득 된 이미지에 적용 할 수 있습니다. 이 응용 프로그램에서 사용할 수 있는 샘플 유형의 유연성은 미토콘드리아, 핵 또는 ER와 같이 평가되는 1 차적인 섬모 또는 임의의 개별 기관을 공부하는 많은 다른 단에 대한 분석의 이 방법을 가치 있게 만듭니다.

1차 섬모는 대부분의 포유류 세포 유형1,2,3,4로부터튀어나온 감각 세포입니다. 그(것)들은 일반적으로 세포외신호5,6,7를통합하여 다양한 세포 신호 통로를 조정하기 위한 중요한 고독한 부속체입니다. 1 차 적인 cilia 는 배아 발달 과 성인 조직 항상성 도중 중요한 역할을 하고, 그들의 기능 또는 형태학의 중단은 통칭하게 ciliopathies에게 불린 몇몇 유전 무질서와 연관됩니다. 섬모의 근해 특성으로 인해, 섬광병증은 모든 장기 시스템에 영향을 미칠 수있는 광범위한 임상 기능과 연관되어8,9,10,11,12. 섬광증의 동물 모델에서, 섬모 구조 또는 신호 용량의 손실은 과식증 관련 비만3,13,14,15를포함하는 몇몇 임상적으로 관련표현형에서 나타난다. 많은 모델 시스템에서, 섬모 길이 변화는 신호 용량 및 기능에 영향을 미치는 것으로 나타났다16,17,18,19. 그러나 섬모 길이와 구성을 정확하고 재현적으로 평가하는 데 는 몇 가지 시간이 걸리고 기술적 인 문제가 있습니다.
성인 포유류 중추 신경계 (CNS)는 섬모와 기능을 이해하는 데 어려움을 제기 한 생물학적 맥락입니다. CNS 를 통해 뉴런과 세포가 섬모를 소유하고 있는 것처럼 보이지만, 이러한 섬모를 관찰하고 분석하는 제한된 도구와 능력으로 인해 이러한 기능에 대한 이해는20으로여전히 애매합니다. 예를 들어, 프로토타입 섬모 마커, 아세틸화된 α-튜룰린은 뉴런섬모(20)에라벨을 붙이지 않는다. 이러한 섬모를 연구하는 어려움은 부분적으로 여러 G 단백질 결합 수용체 (GPCR), 신경 섬모의 막에 농축되는 기계 및 막 관련 단백질의 발견과 함께 해결되었다21,22. 이러한 간단한 기본 관찰의 모든 지금까지 다른 조직에 의해 비교할 수없는 나타납니다 CNS 섬모의 중요성과 다양성을 암시한다. 예를 들어, 섬모 길이 및 GPCR 국소화의 변화는 다른핵(19,23)과비교할 때 특정 뉴런 핵의 길이가 다른 뇌 전체에서 관찰될 수 있다. 유사하게, 그들의 GPCR 함량 및 신호 기계 칭찬은 신경 해부학 적위치와 신경 형2,24,25,26,27,28,29에기초한 다양성을 보여줍니다. 이러한 간단한 관측은 포유류 CNS 섬모 길이와 조성이 클라미도모나스 레인하르트티이와같은 모델 유기체와 마찬가지로 엄격하게 조절되어 있지만, 이러한 길이 차이가 섬모 기능에 미치는 영향, 신호 및 궁극적으로 동작은16,30,31,32로불분명하다는 것을 보여준다.
섬모 길이와 구성을 정확하게 측정하는 것은 사용자 오류 및 불굴의 성에 취약한 기술적 과제임을 입증합니다. 현재 생체 내 및 체외에서 섬모는 모분 단백질 또는 섬모가 풍부한 형광 기자 알레임33,34,35에라벨을 붙이는 면역 형광 접근법을 사용하여 가장 자주 확인된다. 이러한 형광 태그 된 섬모의 길이는 ImageJ36과같은 이미지 분석 프로그램에서 라인 측정 도구를 사용하여 2 차원 (2D) 이미지에서 측정됩니다. 이 과정은 지루하고 노동 집약적일 뿐만 아니라 편견과 오류가 발생하기 쉽습니다. 이러한 동일한 장애물은 섬모구조(37)의변화를 나타내는 데 도움이 되는 섬모 강도를 측정할 때 발생합니다. 이러한 유형의 이미지 분석에서 불일치를 최소화하기 위해 인공 지능(Ai) 프로그램이 점점 더 널리 퍼지고 저렴한옵션(38)이되고 있다.
Ai는 컴퓨터 알고리즘과 프로그래밍의 이점을 사용하여 일반적으로 인간의지능(39)이필요한 작업을 실행하는 컴퓨터 시스템의 발전입니다. Ai 장치는 반복되는 패턴, 매개 변수 및 특성을 인식하고 성공적인 결과를 창출할 확률을 극대화하기 위한 조치를 취하는 방법을 가르칩니다. Ai는 다재다능하며 섬모와 같은 특정 개체 또는 관심 구조를 인식한 다음 식별된 개체에 대한 다양한 분석을 실행하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 따라서 Ai38에의해 복잡한 이미지 데이터를 신속하고 재현적으로 생성할 수 있다. 캡처된 이미지의 자동화 및 Ai 분석은 잠재적인 인간의 오류와편견(39)을제한하면서 효능과 효율성을 높일 것이다. Cilia 식별을 위한 Ai 기반 방법론을 구축하면 모든 연구 그룹이 cilia 데이터를 분석하고 해석할 수 있는 일관된 방법이 만들어집니다.
여기서 우리는 Ai 모듈을 사용하여 생체 내 및 2D 이미지의 시험관 내 섬모를 식별합니다. Ai는 샘플 이미지 세트를 사용하여 섬모를 식별하는 데 훈련됩니다. 훈련이 완료되면 지정된 Ai는 이미지에서 Ai 식별 된 섬모 위에 바이너리 마스크를 적용하는 데 사용됩니다. Ai가 적용한 바이너리는 필요한 경우 이미지의 모든 섬모가 제대로 식별되고 비특이적 식별이 제거되도록 수정할 수 있습니다. Ai를 활용하여 섬모를 식별한 후, 맞춤형 일반 분석(GA) 프로그램은 섬모 길이 및 형광 강도 측정과 같은 다양한 분석을 수행하는 데 사용됩니다. 수집된 데이터는 쉽게 읽고 해석하며 통계 분석에 사용할 수 있는 테이블로 내보내지며(그림1). 자동화 된 기술과 Ai를 사용하여 섬모를 식별하고 실험 그룹 간의 특정 측정을 얻는 것은 CNS 섬모 기능과 세포 통신 및 행동에 대한 형태학의 영향을 이해하는 것을 목표로하는 향후 연구에 도움이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td><td>Intel Corporation</td><td>W-2123</td><td>프로세서는 NIS 요소를 실행하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>니콘 엘리먼트 소프트웨어</td><td>니콘 인스트루먼트 Inc.</td><td>-</td><td>AI 및 GA3 소프트웨어</td></tr><tr><td>, Quadro RTX 4000, 그래픽 카드</td>, <td>NVIDIA Corporation</td><td>, Quadro RTX 4000</td><td></td></tr>, <tr><td>Windows 10 Professional, 64비트</td>, <td>Microsoft, Inc.</td><td>-</td>NIS Elements Workstation HP Development Company, L.P.<td>를 실행하는 데 사용되는 운영 체제</td></tr><tr><td></td><td></td><td>홈페이지&nbsp; Z4G4</td><td>워크스테이션은 NIS 요소를 실행하는 데 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

1차 섬모 평가에 대한 인공 지능 접근 방식

Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

Cilia는 많은 포유류 세포 모형에 있는 신호 통로의 다양성을 위한 신호 센터로 작동하는 microtubule 기지를 둔 세포 부속물입니다. Cilia 길이는 매우 보존되고 엄격하게 조절되며 다른 세포 유형과 조직마다 다르며 신호 용량에 직접 적으로 영향을 미칩니다. 예를 들어, 섬모 G 단백질 결합 수용 체의 활성화에 대 한 응답으로 그들의 길이 변경 표시 되었습니다. 그러나 수많은 섬모의 길이를 정확하고 재현적으로 측정하는 것은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 절차입니다. 현재 접근 방식도 오류및 편향이 발생하기 쉽습니다. 인공 지능(Ai) 프로그램은 광범위한 데이터 세트의 동화, 조작 및 최적화를 허용하는 기능으로 인해 이러한 많은 과제를 극복하기 위해 활용할 수 있습니다. 여기서는 생체 내 및 체외 샘플 모두에서 이미지에서 Cilia를 인식하도록 Ai 모듈을 학습할 수 있음을 입증합니다. 훈련된 Ai를 사용하여 섬모를 식별한 후, 길이, 형광 강도 및 공동 지역화를 위해 단일 샘플에서 수백 개의 섬모를 분석하는 응용 프로그램을 설계하고 신속하게 활용할 수 있습니다. 이 편견없는 접근은 동물 내의 다른 두뇌 지구와 동물 사이뿐만 아니라 시험관내의 다른 1 차적인 신경 준비에서 견본을 비교할 때 우리의 신뢰그리고 엄격을 증가했습니다. 더욱이, 이 기술은 여러 샘플 및 치료 단에 걸쳐 고처리량 방식으로 임의의 세포 유형 및 조직에서 섬모 역학을 안정적으로 분석하는 데 사용될 수 있다. 궁극적으로 대부분의 필드가 이미지 수집 및 분석을 위해 편향적이고 재현 가능한 접근 법으로 이동함에 따라 Ai 기반 접근 방식이 표준화될 수 있습니다.

이미지를 분석하기 위해 인공 지능(Ai)을 사용하는 것은 일반적으로 사용되는 방법에 비해 강력하고 편향이 적으며 빠른 접근 으로 부상하고 있습니다. 여기서 우리는 Ai가 세포 세포, 1차 섬모를 인식하고 길이 및 염색 강도와 같은 특성을 엄격하고 재현 가능한 방식으로 분석하도록 훈련했습니다.

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

현재 의 섬모 분석 방법은 노동 집약적이며 오류와 편견에 취약합니다. 우리의 접근 방식은 잠재적인 오류를 완화하면서 시간과 노력을 간소화하고자 합니다. 이 기술이 제공하는 주요 장점은 엄격성과 재현성 및 정량적 이미지 분석이 증가한다는 것입니다.접근의 이 모형은 섬모 분석과 관련있을 뿐 아니라, 그밖 세포기관 및 cytoskeletal 단백질을 취급하는 그 포함하여 많은 세포 생물학 질문에 광범위하게 적용될 수 있습니다. 먼저 교육 데이터 집합을 열고 메뉴에서 파일을 선택하고 내보내기 가져오기를 클릭하고 파일 시퀀스에서 ND 파일 만들기를 선택합니다. 학습 데이터 집합이 포함된 폴더를 선택하고 대화 상자 창 중앙에서 파일 목록이 열립니다.드롭다운 메뉴에서 하나 이상의 옵션을 사용하여 파일 구성을 수동으로 정의합니다. 선택한 각 옵션 아래에 해당 숫자 값을 입력하고 옵션을 선택하지 않는 경우 를 선택하지 않습니다. 변환을 클릭하여 ND 문서를 엽니다.이미지를 보정하려면 이미지의 왼쪽 아래 모서리에 있는 보정되지 않은 옵션을 마우스 오른쪽으로 클릭합니다. 보정 문서를 클릭한 다음 픽셀 크기를 클릭하고 값을 입력하고 확인을 클릭합니다. 뷰 분석 컨트롤을 선택하고, 이진 도구 모음을 열고, 열린 모든 프레임에서 개별 섬모 구조를 정확하게 추적하여 손 식별 을 위해 자동 감지 또는 그리기 개체를 선택합니다.AI 교육을 위해 nis를 선택합니다. ai, 기차 세그먼트를 클릭합니다. ai는 기차 세그먼트를 엽니 다.ai box 를 선택한 다음 학습에 사용할 소스 채널을 선택합니다. AI를 훈련하기 위해 적절한 그라운드진실 바이너리를 선택합니다. 이진 크기 및 분포에 따라 AI를 학습하기 위해 필요한 반복 수를 선택한 다음 대상 폴더를 선택하여 학습된 AI 파일을 저장하고 기차를 클릭하여 소프트웨어를 학습합니다. 이 프로세스는 몇 시간이 걸립니다.샘플을 변환하여 전에 설명한 것과 같이 섬모의 실험적 공초점 이미지를 엽니다. ND2 파일에 대한 TIF 파일입니다. 팝업 창에서 첫 번째 드롭다운 메뉴에서 멀티 포인트를 선택하고 총 이미지 수에 해당하는 값을 입력합니다.두 번째 드롭다운 상자에서 파장을 선택하고 값을 폴더의 총 채널 수로 변경합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 팝업 창의 오른쪽 끝에있는 파장 선택 창의 잠금을 해제합니다. 파장 선택 창에서 색상 드롭다운 메뉴를 사용하여 각 채널의 색상을 선택합니다.각 채널에 이름 열 아래에 다른 이름을 제공합니다. 모든 정보가 업데이트되면 변환을 클릭합니다. 앞에서 설명한 대로 이미지를 보정합니다.실험 데이터 집합의 픽셀 크기가 학습 데이터 집합의 픽셀 크기와 일치하는지 확인합니다. 이전 단계에서 숙련된 AI를 사용하여 첫 번째 채널에서 섬모를 식별합니다. 니스를 엽니다.메뉴에서 ai, 세그먼트를 선택합니다. ai는 소스 채널에서 AC3를 선택합니다. 그런 다음 소스 채널에서 MCHR1을 선택하여 두 번째 채널의 섬모를 식별합니다.이 소프트웨어는 라벨이 붙은 섬모에 바이너리를 그립니다. 다음 이미지를 잘못 식별한 바이너리에 대해 확인합니다. 이진 도구 모음에서 개체 삭제를 선택하여 잘못 식별된 바이너리를 수동으로 삭제합니다.섬모가 확인되고 세분화되면 일반 분석 세 도구를 사용하여 길이 및 강도와 같은 다른 섬모 매개 변수를 분석합니다. 메뉴에서 이미지를 선택하고 새 GA3 레시피를 클릭합니다. 중앙에 빈 공간이 있는 새 창이 열립니다.GA3는 AI에 따라 적절하게 표시된 바이너리를 자동으로 감지하고 해당 노드를 포함합니다. GA3는 또한 이미지의 채널을 자동으로 감지하고 채널 아래에 탭을 표시합니다. AI는 프레임의 오브젝트처럼 모든 섬모를 분할하고 프레임 가장자리를 따라 불완전한 섬모를 감지합니다.이를 제거하려면 바이너리 처리를 선택하고 개체를 제거한 다음 터치 테두리 노드를 빈 공간으로 드래그한 다음 노드를 적절한 바이너리에 연결합니다. 섬모 길이를 측정하려면 측정 오브젝트 크기를 선택한 다음 길이를 선택합니다. 매개 변수를 중앙에 드래그 앤 드롭하고 적절한 이진 노드에 연결합니다.섬모 강도를 측정하려면 일부 개체 강도를 선택합니다. 매개 변수를 중앙에 드래그 앤 드롭하고 적절한 이진 노드 및 관심 채널에 연결합니다. 측정 메뉴에서 개체 비율계로 이동하여 Mander의 계수를 선택하여 개별 섬모 내에서 두 채널의 중복을 측정하여 GA3에서 지역화 경로를 설정합니다.빈 공간에서 맨더의 계수 노드를 드래그앤드롭하고 적절한 바이너리 및 채널에 연결합니다. 데이터 관리 메뉴를 열어 측정값과 단일 테이블을 EnEn합니다. 기본 범주에서 ApEn 열을 선택한 다음 지금 실행을 클릭하여 섬모를 측정합니다.모든 측정값은 단일 출력 테이블에 나타납니다. 대표적인 이미지는 훈련된 AI가 IMCD 세포, 1차 시상하계 배양 및 해마 배양의 이미지에서 체외에서 제대로 섬모를 확인했지만 사이토카인 브리지와 같은 다른 비섬모성 구조는 없음을 보여줍니다. 섬모의 길이는 IMCD 세포에서 0.5 내지 4.5 마이크로미터, 시상 하및 해마 배양에서 2 내지 12 마이크로미터 사이였다.AI는 아크루아테 핵, 정맥핵 및 각막 암모의 한 부위의 이미지에서 생체내에서 AC3 라벨이 부착된 섬모의 길이를 측정했습니다. 분석에 따르면, 생체 내의 시상 하 부 섬모는 흰색과 갈색 막대에서 볼 수 있듯이 1에서 15 마이크로 미터까지 다양했습니다. 섬모와 각막 암모니스 지역은 회색 막대에서 볼 수 있듯이 1에서 10 마이크로미터까지 다양했습니다.흥미롭게도, 섬모 MCHR1의 강도는 아크에이트 핵에서보다 심방 핵에서 더 강했다. AC3에 대한 MCHR1의 강도는 중복을 측정하기 위해 플롯되었다. 일부 섬모는 AC3 또는 MCHR1에 대 한 긍정적인 동안 섬모의 대부분은 두 마커에 대 한 긍정적인 했다.AC3 내에서 MTHR1의 군산화를 정량화하기 위해 Mander의 중첩 계수를 측정하고 아크퀴아테 핵보다 심혈핵의 중첩이 크게 증가했습니다. 섬모의 길이를 따라 강도를 측정하기 위해, 섬모 극성은 기초 바디 마커로 Centrin2-GFP를 사용하여 정의되었습니다. 이것은 ARL13B-M 체리 양성 분모의 끝과 섬모의 기초를 구별 할 수 있었습니다.Cilia의 길이를 따라 ARL13B 강도의 변화는 ARL13B 강도가 왼쪽에 보이는 아크추아테 핵의 실륨 의 끝보다 기지에서 더 높은 곳뿐만 아니라 PVN, 오른쪽에 볼 수 있듯이 관찰되었다. 이 접근 방식을 사용하여 데이터를 분석할 때 실험 데이터 집합의 품질과 해상도가 AI를 학습하는 데 사용되는 데이터와 일치하는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 방법의 주요 유틸리티는 AI에 의해 섬모를 감지 한 후, 사용자는 소프트웨어 내에 통합 된 분석 워크플로우를 사용자 정의하여 분석되는 속성에 대해 크리에이티브 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

본 연구에서는 초구조 분석을 위한 전자 현미경 방법과 함께 생체 외 CPEC 섬모의 움직임을 실시간 관찰 및 분석할 수 있도록 상세한 광학 현미경 기술을 최적화했습니다.

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측<em&gt; 전의 VIVO</em

일차 섬모 신경 전구 세포의 증식, 신경 세포 분화, 성인 신경 기능에 근본적으로 중요하다. 여기서 우리는 ciliogenesis 및 기본 neurosphere 문화를 사용하여 신경 줄기 / 전구 세포 및 분화 된 신경 세포의 섬모에 신호 단백질의 인신 매매를 연구하는 방법을 설명합니다.

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

1 차적인 섬모는 센티미터와 관련되었던 세포 외 구조물입니다. 면역 형광 염색에 의한 1 차 적인 섬모 검출은 매우 높은 품질의 심상을 초래하는 비교적 간단한 절차입니다. 이 프로토콜에서, 1 차적인 섬모를 표현하는 섬유아세포는 형광 또는 공초점 현미경으로 고정되고, 면역 염색되고, 심상화되었습니다.

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2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

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고속 비디오 현미경 분석은 비교적 수행하기 쉽고 빠르며 비용 효율적이며 숙련 된 손에는 원발성 섬모 운동 장애의 첫 번째 라인 진단을위한 상당히 신뢰할 수있는 도구로, 진단 및 중증 폐 질환 치료와 관련된 모든 센터에서 사용할 수 있어야합니다.

원발성 섬모 운동장애의 일선 진단을 위한 고속 비디오 현미경 분석

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이 방법은 조직 수집에서 섬모 조직 분석에 이르기까지 광물화된 조직의 넓은 영역에 걸쳐 원발성 섬모를 3차원으로 제 자리에서 이미지화하기 위해 ARL13B-CENTRIN-2 형질전환 마우스 모델에서 내인성 신호를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 유형의 조직에도 적용될 수 있습니다.

ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 사용한 근골격계 조직의 원발성 섬모의 체적 이미징 및 분석

통합 이미지 관리, 인공 지능(AI) 및 보고 시스템은 진단 병리학 진료에 혁명을 일으켰습니다. 이 백서에서는 AI가 병리학자가 조직병리학 이미지 평가를 수행하고 진단 보고서를 생성하는 데 도움을 줄 수 있도록 하는 최첨단 시스템인 FlexLIS를 소개합니다.

통합 병리학 영상 관리, 인공지능 및 보고 시스템 도입

학습하세요 인공지능 기반 1차 섬모 자동 식별 및 정량 분석 방법을. 다양한 세포 유형과 조직에서 섬모 길이, 형광 강도, 공동국소화를 고속 재현 가능하게 측정하여 세포생물학 연구의 엄격성과 신뢰성을 높입니다.

1차 섬모 평가에 대한 인공 지능 접근 방식

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