흑색종의 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 초고주파 초음파 이미징에 의한 림프절 부피 분석

우리의 방법은 사타구니 림프절의 전이성 관여의 증가를 모니터링하여 부피의 증가를 측정 할 수 있습니다. 이 비침습적 방법은 매우 잘 견딜 수 있으므로 두 주 동안 동일한 실험 동물에 대해 여러 이미징 세션을 예약 할 수 있습니다. 이 방법은 전이성 질환에 대한 약리학 적 치료의 영향을 평가하는 데 이상적입니다.

우리는이 방법을 Braf / Pten 흑색종 모델에 적용했지만 원칙적으로 전이성 암의 다양한 전임상 마우스 모델에서 다양한 약물의 효능을 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 후 의사 인 Marianna Vitiello 박사와 IFC-CNR의 동료 연구원 인 Claudia Kusmic 박사입니다. 흑색종 유도를 위해, 사흘 연속으로 등 위쪽의 면도 된 피부의 약 한 평방 센티미터에 5 밀리몰 4-hydroxytamoxifen의 세 마이크로 리터를 적용하십시오.

피부 페인팅 후 육 주 후, 캘리퍼를 사용하여 원발성 종양의 부피를 측정하고 결국 피하 전이의 부피를 측정하십시오. 그런 다음 초음파 이미징을 사용하여 사타구니 림프절의 부피를 측정하십시오. 육안 검사로 원발성 종양과 림프절을 분석 한 후 조직 학적 연구를 위해 절제하십시오.

마취를 확인한 후 동물을 초고주파 초음파 이미징 스테이션의 가열 보드로 옮겨 동물을 수핀 위치에 고정시킵니다. 석유 젤리로 윤활 된 직장 프로브를 사용하여 보드 온도를 조정하여 마우스의 체온을 생리 학적 범위로 유지하십시오. 앞발과 뒷발을 전도성 페이스트로 코팅하고 보드에 내장 된 ECG 플레이트 전극에 테이프로 붙입니다.

생리적 매개 변수가 올바르게 획득되고 표시되는지 확인하십시오. 탈모제를 바르면 두 사타구니 부위에서 머리카락을 제거하고 음향 결합 매체로 코팅하십시오. 그런 다음 초고주파 초음파 선형 프로브를 이미징 스테이션에 내장된 특수 3D 모터에 클램프하여 프로브의 자동화 및 단계적 이동이 가능합니다.

초음파 프로브의 위치를 적절하게 방향을 정하고 조정하여 사타구니 림프절의 짧은 액세스 이미지를 얻고 관심 영역을 초점 영역에 배치하십시오. 스캔 거리를 두 밀리미터에서 다섯 밀리미터 사이, 스텝 사이즈를 44마이크로미터로 설정하고, 림프절 슬라이스당 46~114개의 스캔 스텝 결과를 내고, 획득 시간을 동물당 1~3분으로 설정합니다. 사타구니 림프절의 전체 볼륨을 2D B 모드 이미지의 시퀀스로 스캔하고 마이크로미터 크기의 스텝 크기를 가진 트랜스듀서의 선형 이동으로 여러 레벨에서 이미지를 획득하여 호흡 및 심장 게이트 시네 루프 측면에서 3D 데이터를 생성합니다.

이미징 후 추가 오프라인 분석을 위해 획득한 이미지를 원시 형식으로 디지털 방식으로 저장합니다. 초음파 이미지의 사후 처리를 위해 3D 사타구니 림프절 이미지의 데이터 세트를 열고 다중 슬라이스 방법을 선택한 다음 시작 버튼을 눌러 3D 획득 중에 캡처 된 각 이미지에 해당하는 모든 프레임의 현재 프레임과 썸네일을 시각화합니다. 림프절이 뚜렷한 첫 번째 프레임의 축소판을 선택하여 윤곽선 보기로 로드합니다.

윤곽선 보기에서 마우스를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 림프절의 경계를 따라 점을 드롭합니다. 원하는 수의 포인트가 설정되면 오른쪽 핥아서 윤곽선을 완성하십시오. 첫 번째 윤곽선이 완료된 후 축소판 보기를 사용하여 윤곽을 그릴 다음 이미지를 선택합니다.

필요한 경우 윤곽선 사이의 여러 이미지를 건너뜁니다. 각 3D 볼륨에 필요한 수동 트레이스 수를 줄입니다. 전체 볼륨이 윤곽이 그려질 때까지이 과정을 반복 한 다음 마침을 클릭하십시오. 3D 모드 창 작업 공간에서 이미지 표시 영역 아래의 볼륨 측정 아이콘을 클릭하여 림프절 볼륨의 숫자 값을 시각화하고 림프절 볼륨의 3D 렌더링으로 표면 뷰를 활성화합니다.

마우스를 4-하이드록시타목시펜으로 처리하면 CreER 효소 활성이 유도되어 게놈 수준에서 야생형 Braf에서 돌연변이된 Braf V600E로 전환되는 반면, Pten은 소실됩니다. 4-하이드록시타목시펜 치료 후 4주 후, 원발성 종양은 50 내지 100입방 밀리미터의 부피에 도달하고 이들의 성장은 추가로 2주 동안 캘리퍼에 의해 측정될 수 있으며, 이로써 사타구니 림프절에서 관찰되는 색소침착의 점진적인 증가를 보여준다. 멜라닌 침착은 흑색종 항원 MelanA 및 Braf V600E의 면역조직화학적 염색에 의해 확인된 바와 같이 전이된 흑색종 세포의 존재로 인해 변함없이 존재하기 때문이다.

세분화 단계가 끝나면 모든 절편은 림프절의 외부 윤곽선의 오버레이를 보여주었습니다. 4-HT 치료 후 4, 5, 6 주에 분석 된 오른쪽 사타구니 림프절의 3D 렌더링이 여기에 나와 있습니다. 시간이 지남에 따라 동일한 동물의 왼쪽 및 오른쪽 사타구니 림프절의 부피 증가도 정량화되었습니다.

초음파 이미징을 적절한 면역 조직 화학 염색과 결합하여 암세포의 존재를 분자 수준에서 확인하는 것이 좋습니다. 림프절 외에도 피하 전이의 양은 초음파 이미징을 사용하여 시간이 지남에 따라 모니터링 할 수 있습니다. 두 주 기간이 너무 짧아서 연구중인 약물의 효과를 이해할 수 없다면 말초 유도 부위 또는 종양이 발생하기 쉬운 유전자형을 선택하십시오.