Name: 흑색종의 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 초고주파 초음파 이미징에 의한 림프절 부피 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 배우세요 초고주파 초음파 이미징을 이용하여 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 림프절 부피를 비침습적으로 측정하는 방법을. 이 기술은 전이성 흑색종 진행을 종단적으로 모니터링하고 약물 효능을 평가하는 데 이상적입니다.

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저자는 동물 절차에 대한 그녀의 도움에 대해 S. Burchielli (FTGM, Pisa)에게 감사하고 싶습니다. 이 작업은 ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica 기관 자금 조달에 의해 LP에 지원되었습니다. MFAG #17095는 AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro가 LP에 수여했습니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 이탈리아 보건부 (동물 프로토콜 # 754 / 2015-PR 및 # 684 / 2018-PR)의 승인을 받았습니다.
1. 흑색종 유도
참고: 여섯 주령의 Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox 마우스 [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ(Braf/Pten)]가 본 연구에 사용되었다(자료표 참조).
<ol><li>앞서 기술한 바와 같이 등 뒤의 면도된 피부의 ∼1 cm2 상에 3 μL의 5 mM 4-HT를 적용하여 마우스를 4-하이드록시타목시펜(4-HT)으로 3일 연속으로 치료한다. 참고 : 이것은 Cre 효소를 활성화시키고 wt Braf에서 BrafV600E로 전환하고 Pten의 손실을 일으 킵니다. 이 두 안타는 흑색종 형성을 유도하기에 충분합니다.</li>
	<li>원발성 종양이 2-3 주 안에 피부 페인팅 부위에서 발생하고 4 주 안에 50-100mm3의 부피에 도달한다는 것을 관찰하십시오. 또한이 시점에서 다른 피부 부위, 림프절 및 폐로의 전이를 관찰하십시오 (t0).</li>
	<li>캘리퍼를 사용하여 원발성 종양의 부피와 피하 전이를 측정하고 초음파 이미징을 사용하여 사타구니 림프절의 부피를 측정하십시오. 1 주 후 (t1, 스킨 페인팅 후 5 주)와 2 주 후 (t2, 스킨 페인팅 후 6 주) 이러한 측정을 반복하십시오.</li>
	<li>마지막 시점에서, 기체 세보란으로 과다 투여하여 마우스를 안락사시킨다.</li>
	<li>육안 검사로 원발성 종양과 림프절을 분석 한 다음 조직 학적 연구를 위해 절제하십시오.16.</li>
</ol>2. 영상 촬영 절차
<ol><li>마우스를 가스 마취를 위한 유도 챔버에 놓고 동물이 완전히 마취될 때까지 순수한 산소에 3% 이소플루란을 공급한다. 발 꼬집음에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오.</li>
	<li>동물을 UHFUS 이미징 스테이션의 구성 부분 인 가열 된 보드로 옮기면 동물을 수핀 위치에 고정시킵니다. 석유 젤리로 윤활 된 직장 프로브를 사용하여 체온을 측정하십시오. 보드 온도를 조정하여 마우스의 체온을 생리적 범위(36± 1°C)로 유지합니다.</li>
	<li>마취 중 건조를 방지하기 위해 수의사 연고로 마우스의 눈을 적시십시오. 마우스의 코 마스크를 통해 마약 가스 (순수 산소의 1.5 % 이소플루란)를 공급하십시오. 마취의 정확한 깊이를 유지하기 위해 이소플루란의 비율을 조정하십시오.</li>
	<li>앞발과 뒷발을 전도성 페이스트로 코팅하고 보드에 내장 된 ECG 플레이트 전극에 테이프로 붙입니다. 생리적 파라미터(심박수, 호흡 신호 및 코어 체온)가 올바르게 수집되고 표시되는지 확인합니다.</li>
	<li>탈모제를 바르면 두 사타구니 부위에서 머리카락을 제거하고 음향 결합 매체로 코팅하십시오.</li>
	<li>UHFUS 선형 프로브(40MHz 중심 주파수)를 UHFUS 이미징 스테이션에 내장된 특수 3D 모터에 클램핑하여 프로브를 자동으로 단계적으로 이동할 수 있습니다.</li>
	<li>초음파 프로브의 위치를 적절하게 조정하고 조정하여 사타구니 림프절 (왼쪽 / 오른쪽)의 단축 이미지를 얻고 관심 영역을 초점 영역에 배치하십시오.</li>
	<li>앞서 설명한 바와 같이 사타구니 림프절의 전체 부피를 2D B 모드 이미지의 시퀀스로 스캔합니다.18. 마이크로미터 스케일의 스텝 크기를 갖는 트랜스듀서의 선형 이동에 의해 림프절의 여러 레벨에서 이미지를 획득하여, 자동 호흡 및 심장 게이트 시네 루프의 관점에서 3D 데이터를 생성합니다.</li>
	<li>다음 매개 변수로 이미지 녹화를 설정하십시오 : 2 ~ 5mm 사이의 스캔 거리 (림프절 크기에 따라 다름); 단계 크기 44 μm, 46-114 스텝 스텝/림프절 슬라이스의 결과와 동물 당 1-3 분의 획득 시간. 추가 오프라인 분석을 위해 획득한 이미지를 원시 형식(DICOM)으로 디지털 방식으로 저장합니다.</li>
	<li>이미징 세션이 끝나면 가스 마취를 중단하고 동물이 흉골 잔해의 가열 보드에서 회복 할 수 있도록하십시오. 경향이있는 위치를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 돌보십시오.</li>
</ol>3. 초음파 이미지의 후처리
<ol><li>초음파 이미지 사후 처리를 위해 소프트웨어 플랫폼에서 왼쪽 / 오른쪽 사타구니 림프절의 DICOM 3D 이미지 데이터 세트를 엽니 다.</li>
	<li>세분화:<ol>
<li>다중 슬라이스 방법을 선택하여 3D 획득 중에 캡처된 각 이미지에 해당하는 모든 프레임의 현재 프레임과 축소판을 모두 시각화합니다.</li>
		<li>첫 번째 프레임의 축소판을 선택하여 윤곽선 보기로 로드합니다. 윤곽선 보기에서 마우스를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 림프절의 경계를 따라 점을 드롭합니다. 원하는 점 수(범위 10-15)가 설정되면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 윤곽선을 완성합니다.</li>
		<li>첫 번째 윤곽선이 완료된 후 축소판 보기를 사용하여 윤곽을 그릴 다음 이미지를 선택합니다. 필요한 경우 윤곽선 사이에 여러 이미지(평균 3프레임)를 건너뜁니다. 각 3D 볼륨에 필요한 수동 트레이스 수를 줄입니다. 참고: 초음파 이미지 후처리를 위한 소프트웨어 플랫폼은 수동 추적 사이의 윤곽선을 자동으로 생성하므로 분석 시간이 단축됩니다.</li>
		<li>전체 볼륨이 윤곽선이 표시될 때까지 이 과정을 반복합니다. 완료되면 마침을 클릭하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D 와이어프레임 및 볼륨 측정의 생성:<ol>
<li>3D 모드 창 작업 영역에서 이미지 표시 영역 아래의 볼륨 측정 아이콘을 클릭하여 표면 보기를 활성화합니다. 참고: 서피스 뷰는 사용자가 생성한 볼륨을 획득한 이미지에 매핑하는 컴파일 뷰를 만듭니다. 서피스 뷰는 원하는 위치로 회전할 수 있습니다.</li>
		<li>큐브 보기의 왼쪽 아래 모서리에 나열된 볼륨 측정값을 기록해 둡니다. 참고: 세분화 및 3D 볼륨 생성은 일반 이미지 처리를 위해 맞춤 개발된 소프트웨어 및/또는 자유롭게 사용할 수 있는/상용 소프트웨어를 사용하여 얻을 수도 있습니다. 수동 세분화부터 시작하여 소프트웨어는 림프절 윤곽선에 대한 수학적 및/또는 픽셀 수준 설명을 제공해야 합니다. 이러한 윤곽선은 림프절의 외부 표면을 렌더링하기 위해 3D 공간에서 결합됩니다. 이미징 절차 및 초음파 이미지의 사후 처리에 설명된 모든 단계는 그림 2에 요약되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Schvartsman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+metastatic+cutaneous+melanoma%3A+updates+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).</li>
<li>Blum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+examination+of+regional+lymph+nodes+significantly+improves+early+detection+of+locoregional+metastases+during+the+follow-up+of+patients+with+cutaneous+melanoma+-+Results+of+a+prospective+study+of+1288+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients.</a> Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).</li>
<li>Olmedo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lymph+node+ultrasound+prior+to+sentinel+lymph+node+biopsy+in+384+patients+with+melanoma%3A+a+cost-effectiveness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Actas+Dermo-Sifiliograficas%22%5BJournal%5D)">Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis.</a> Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).</li>
<li>Voit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+morphology+criteria+predict+metastatic+disease+of+the+sentinel+nodes+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).</li>
<li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+cohort+study+of+ultrasound+surveillance+of+regional+lymph+nodes+in+patients+with+intermediate-risk+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma.</a> British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).</li>
<li>Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+surveillance+of+lymph+nodes+following+lymphoscintigraphy+without+sentinel+node+biopsy%3A+a+useful+and+safe+strategy+in+elderly+or+frail+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).</li>
<li>Jayapal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+benign+and+metastatic+cervical+lymph+nodes+using+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).</li>
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<li>Damsky, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-catenin+signaling+controls+metastasis+in+Braf-activated+Pten-deficient+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas.</a> Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).</li>
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<li>Kohler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cutaneous+melanoma+induced+by+mutant+BRaf+arises+from+expansion+and+dedifferentiation+of+mature+pigmented+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).</li>
<li>Yuan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenformin+enhances+the+therapeutic+benefit+of+BRAF%28V600E%29+inhibition+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).</li>
<li>Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+AKT+dependency+displayed+by+mouse+models+of+BRAFV600E-initiated+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).</li>
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<li>Steinberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+inhibition+alleviates+immune+suppression+in+murine+autochthonous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).</li>
<li>Vitiello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumoral+effects+of+attenuated+Listeria+monocytogenes+in+a+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).</li>
<li>Moon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li>
<li>Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+2-and+3-dimensional+assessment+of+tumor+volume+and+vascular+density+by+ultrasonography+in+a+transgenic+mouse+model+of+mammary+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasound+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 연구에서 얻은 데이터는 전이성 흑색종의 Braf / Pten 마우스 모델의 사타구니 림프절의 전이성 관여를 모니터링하는 초음파 이미징의 능력을 증명합니다. 앞서 보여진 바와 같이16, 이 기술은 약물 치료의 효능을 평가하는데 특히 유용하다. 이는 t1 andt2 에서 수집된 측정치와 t0에서 수집된 측정값을 비교함으로써 시간에 따른 동일한 동물에서 림프절 부피의 변화를 모니터링할 수 있기 때문이다. 이것은 차례로 획득 된 결과의 견고성 증가에 기여하는데, 이는 마우스 간 가변성 및 기저 림프절 크기에 영향을 줄 수있는 다른 요인이 모두 설명되기 때문입니다. 또한 초음파 이미징은 실험군 당 동물 수를 줄임으로써 3R 원칙을 준수 할 수 있습니다.
Braf / Pten 마우스에서 사타구니 일뿐만 아니라 상완 및 겨드랑이 림프절도 전이성 확산 부위입니다. 그러나...

흑색종은 종종 다른 피부 부위 (피하 전이)뿐만 아니라 림프절, 폐, 간, 뇌 및 뼈로 퍼지는 공격적인 형태의 피부암입니다1. 지난 십 년 동안 신약이 임상 실습에 도입되었으며 전이성 흑색종 환자의 기대 수명을 향상시키는 데 기여했습니다. 그러나 반응의 가변적 인 시간과 정도, 심각한 부작용 및 후천적 인 저항의 반란을 포함하여 한계가 남아 있습니다1. 따라서 초기 단계, 즉 국소 림프절에 도달 할 때 전이성 확산을 감지하는 것이 중요합니다.
국소 림프절 (센티넬 림프절)의 생검은 일반적으로 흑색종 세포의 존재를 확인하기 위해 수행됩니다. 그러나 초음파 영상은 임상 평가를 능가하고 불필요한 생검을 피하는 데 도움이 될 수 있기 때문에 전이성 개입을 탐지하는 비 침습적 방법으로 자리 잡고 있습니다2,3,4. 또한, 초음파 영상은 림프절 감시, 특히 고령 및/또는 합병증의 경우5,6에 적합한 것으로 보인다. 초음파 분석에 의해 검출되고 정상 림프절과 전이성 림프절 사이의 분화를 허용하는 특징은 크기 (부피) 증가, 타원형에서 둥글게의 모양 변화, 불규칙한 여백, 변경된 echogenic 패턴 및 변경된 (증가된) 혈관화7를 포함한다.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox 유전자 조작 마우스(Braf/Pten 마우스)는 최근 전이성 흑색종에 대한 조직 특이적이고 유도성 모델로서 과학계에 제공되었다8. 이 동물 모델에서 원발성 종양은 매우 빠르게 발달합니다 : 야생형 (wt) Braf에서 BrafV600E로의 전환 유도 후 2-3 주 이내에 볼 수 있으며 Pten의 손실은 4 주 이내에 50-100mm3의 부피에 도달합니다. 다음 2 주 동안, 원발성 종양의 성장은 다른 피부 부위, 림프절 및 폐에서 전이성 부담의 점진적 증가를 동반한다.
Braf/Pten 마우스는 흑색종 발생9,10에 관여하는 신호전달 경로의 해부, 기원의 흑색종 세포의 확인11,12,13, 표적 요법과 면역요법 모두에서 새로운 치료 옵션의 시험을 포함하여 여러 목적으로 광범위하게 사용되어 왔습니다.8,14,15,16 . 특히, 우리는 Braf / Pten 마우스를 사용하여 약독화 된 리스테리아 단세포 유전자 (Lmat)가 항 흑색종 백신으로 작용한다는 것을 입증했습니다. 치료 환경에서 전신적으로 투여될 때, Lmat은 종양 부위에 선택적으로 축적되기 때문에 전반적인 독성과 관련되지 않는다. 또한, 원발성 흑색종 질량의 현저한 감소와 림프절과 폐의 전이성 부담의 감소를 일으킨다. 분자 수준에서, Lmat은 흑색종 세포의 사멸을 일으키는데, 이는 적어도 부분적으로는 비세포-자율적 활동(CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 현장 모집)16에 기인한다.
Braf/Pten 마우스가 흑색종 모델링에 사용될 때, 원발성 종양 및 피하 전이의 성장은 캘리퍼 측정에 의해 모니터링될 수 있다. 그러나 림프절과 폐의 개입은 대체 기술을 사용하여 조사해야하며, 연구자가 시간이 지남에 따라 동일한 동물을 따라갈 수있게 해주는 비 침습적 일 수 있습니다. 이 논문은 사타구니 림프절의 크기 (부피) 증가의 종방향 모니터링을 위해 획득 된 데이터의 후속 3D 체적 분석과 결합 된 초음파 이미징 (그림 1)의 사용을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>종양 유도</td>B6에 사용되는 <td>4-하이드록시타목시펜</td><td>Merck</td><td>H6278</td> 약물</tr><tr><td>. Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ(Braf/Pten) 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013590</td><td></td></tr><tr><td>Blu gel</td><td>Sooft Ialia</td><td></td><td>점안액 젤</td></tr><tr><td>BRAFV600E 항체</td><td>Spring Bioscience Corporation</td><td>E19290</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlo(isoflorane)</td><td>Zoetis</td><td></td><td>액체 기체 마취용</td></tr><tr><td>MLANA 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M2-7C10</td><td></td></tr><tr><td>시그마 젤</td><td>파커</td><td></td><td>전극 젤</td></tr><tr><td>천음속 젤 투명</td><td>Telic SAU</td><td></td><td>초음파 젤</td></tr><tr><td>Veet</td><td>Reckitt Benckiser IT</td><td></td><td>탈모 크림</td></tr><tr><td>컴팩트 이중 마취 시스템</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>노즈콘과 인덕션 챔버 MX550S를 장착한 이소플루란 기반 마취 시스템</td></tr><tr><td></td><td>, Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>UHFUS 선형 프로브</td></tr><tr><td>Vevo 3100</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>UHFUS 시스템</td></tr><tr><td>Vevo 이미징 스테이션</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>UHFUS 이미징 스테이션 및 전진 생리학적 모니터링 장치(Advancing Physiological Monitoring Unit)에는 가열 보드가 구비된</td></tr><tr><td>Vevo Lab</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>초음파 이미지 후처리를 위한 소프트웨어 플랫폼</td></tr></tbody></table>

흑색종의 braf/pten 유전자 조작 마우스 모델에서 초고주파 초음파 이미징에 의한 림프절 부피 분석

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+, BrafCA/+,Ptenlox/lox 유전자 조작 마우스(Braf/Pten 마우스)는 전이성 흑색종의 생체내 모델로 널리 사용됩니다. 일단 원발성 종양이 타목시펜 처리에 의해 유도되면, 유도 후 4-6 주 이내에 전이성 부담의 증가가 관찰됩니다. 이 논문은 UHFUS(Ultra-High-Frequency UltraSound) 이미징을 활용하여 부피의 증가를 측정하여 사타구니 림프절의 전이성 관여 증가를 모니터링하는 방법을 보여줍니다.
UHFUS 시스템은 UHFUS 선형 프로브 (22-55 MHz, 축 분해능 40 μm)로 마취 된 마우스를 스캔하는 데 사용됩니다. 사타구니 림프절 (왼쪽과 오른쪽 모두)의 B 모드 이미지는 짧은 축보기로 수집되어 동물을 등쪽 난해부에 배치합니다. 초음파 기록은 전동 기계식 암에 44 μm 스텝 크기를 사용하여 수집됩니다. 그 후, 2차원(2D) B 모드 획득은 초음파 이미지 후처리를 위한 소프트웨어 플랫폼으로 가져오고, 획득한 횡단면 2D 이미지에서 사타구니 림프절을 반자동으로 식별하고 분할합니다. 마지막으로, 3차원(3D) 부피의 전체 재구성은 림프절 부피의 렌더링과 함께 자동으로 얻어지며, 이는 또한 절대 측정으로 표현된다.
이러한 비침습적 생체내 기술은 매우 잘 견디며, 2주에 걸쳐 동일한 실험 동물에 대한 다수의 이미징 세션의 스케줄링을 허용한다. 따라서 약리학 적 치료가 전이성 질환에 미치는 영향을 평가하는 것이 이상적입니다.

Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox 마우스의 4-HT를 사용한 피부 페인팅 후, Cre 활성이 유도되며, 이로 인해 게놈 수준에서 wt Braf에서 BrafV600E 로 전환되고 Pten은 손실됩니다(그림 3A). 2-3 주 안에 마우스는 100 % 침투력으로 현장 원발성 종양을 일으 킵니다. 4-HT 치료 (t0)로부터 4 주 후, 원발성 종양은 50-100 mm3의 부피에 도달하고, 그들의 성장은 추가 2 주 동안 캘리퍼에 의해 측정 될 수있다 ((t1 및 t2; 도 3B, 상부 패널). 종양이 너무 커져서 생쥐가 안락사를 필요로하기 때문에 나중에 시점에 도달 할 수 없습니다.
전이성 부담에 관...

흑색 종은 다른 장기로 빠르게 퍼지는 매우 공격적인 질병입니다. 이 프로토콜은 전이성 흑색종의 Braf/Pten 마우스 모델에서 사타구니 림프절의 부피를 모니터링하기 위해 3D 렌더링과 결합된 초고주파 초음파 이미징의 적용을 설명합니다.

흑색종의 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 초고주파 초음파 이미징에 의한 림프절 부피 분석

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

우리의 방법은 사타구니 림프절의 전이성 관여의 증가를 모니터링하여 부피의 증가를 측정 할 수 있습니다. 이 비침습적 방법은 매우 잘 견딜 수 있으므로 두 주 동안 동일한 실험 동물에 대해 여러 이미징 세션을 예약 할 수 있습니다. 이 방법은 전이성 질환에 대한 약리학 적 치료의 영향을 평가하는 데 이상적입니다.우리는이 방법을 Braf / Pten 흑색종 모델에 적용했지만 원칙적으로 전이성 암의 다양한 전임상 마우스 모델에서 다양한 약물의 효능을 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 후 의사 인 Marianna Vitiello 박사와 IFC-CNR의 동료 연구원 인 Claudia Kusmic 박사입니다. 흑색종 유도를 위해, 사흘 연속으로 등 위쪽의 면도 된 피부의 약 한 평방 센티미터에 5 밀리몰 4-hydroxytamoxifen의 세 마이크로 리터를 적용하십시오.피부 페인팅 후 육 주 후, 캘리퍼를 사용하여 원발성 종양의 부피를 측정하고 결국 피하 전이의 부피를 측정하십시오. 그런 다음 초음파 이미징을 사용하여 사타구니 림프절의 부피를 측정하십시오. 육안 검사로 원발성 종양과 림프절을 분석 한 후 조직 학적 연구를 위해 절제하십시오.마취를 확인한 후 동물을 초고주파 초음파 이미징 스테이션의 가열 보드로 옮겨 동물을 수핀 위치에 고정시킵니다. 석유 젤리로 윤활 된 직장 프로브를 사용하여 보드 온도를 조정하여 마우스의 체온을 생리 학적 범위로 유지하십시오. 앞발과 뒷발을 전도성 페이스트로 코팅하고 보드에 내장 된 ECG 플레이트 전극에 테이프로 붙입니다.생리적 매개 변수가 올바르게 획득되고 표시되는지 확인하십시오. 탈모제를 바르면 두 사타구니 부위에서 머리카락을 제거하고 음향 결합 매체로 코팅하십시오. 그런 다음 초고주파 초음파 선형 프로브를 이미징 스테이션에 내장된 특수 3D 모터에 클램프하여 프로브의 자동화 및 단계적 이동이 가능합니다.초음파 프로브의 위치를 적절하게 방향을 정하고 조정하여 사타구니 림프절의 짧은 액세스 이미지를 얻고 관심 영역을 초점 영역에 배치하십시오. 스캔 거리를 두 밀리미터에서 다섯 밀리미터 사이, 스텝 사이즈를 44마이크로미터로 설정하고, 림프절 슬라이스당 46~114개의 스캔 스텝 결과를 내고, 획득 시간을 동물당 1~3분으로 설정합니다. 사타구니 림프절의 전체 볼륨을 2D B 모드 이미지의 시퀀스로 스캔하고 마이크로미터 크기의 스텝 크기를 가진 트랜스듀서의 선형 이동으로 여러 레벨에서 이미지를 획득하여 호흡 및 심장 게이트 시네 루프 측면에서 3D 데이터를 생성합니다.이미징 후 추가 오프라인 분석을 위해 획득한 이미지를 원시 형식으로 디지털 방식으로 저장합니다. 초음파 이미지의 사후 처리를 위해 3D 사타구니 림프절 이미지의 데이터 세트를 열고 다중 슬라이스 방법을 선택한 다음 시작 버튼을 눌러 3D 획득 중에 캡처 된 각 이미지에 해당하는 모든 프레임의 현재 프레임과 썸네일을 시각화합니다. 림프절이 뚜렷한 첫 번째 프레임의 축소판을 선택하여 윤곽선 보기로 로드합니다.윤곽선 보기에서 마우스를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 림프절의 경계를 따라 점을 드롭합니다. 원하는 수의 포인트가 설정되면 오른쪽 핥아서 윤곽선을 완성하십시오. 첫 번째 윤곽선이 완료된 후 축소판 보기를 사용하여 윤곽을 그릴 다음 이미지를 선택합니다.필요한 경우 윤곽선 사이의 여러 이미지를 건너뜁니다. 각 3D 볼륨에 필요한 수동 트레이스 수를 줄입니다. 전체 볼륨이 윤곽이 그려질 때까지이 과정을 반복 한 다음 마침을 클릭하십시오. 3D 모드 창 작업 공간에서 이미지 표시 영역 아래의 볼륨 측정 아이콘을 클릭하여 림프절 볼륨의 숫자 값을 시각화하고 림프절 볼륨의 3D 렌더링으로 표면 뷰를 활성화합니다.마우스를 4-하이드록시타목시펜으로 처리하면 CreER 효소 활성이 유도되어 게놈 수준에서 야생형 Braf에서 돌연변이된 Braf V600E로 전환되는 반면, Pten은 소실됩니다. 4-하이드록시타목시펜 치료 후 4주 후, 원발성 종양은 50 내지 100입방 밀리미터의 부피에 도달하고 이들의 성장은 추가로 2주 동안 캘리퍼에 의해 측정될 수 있으며, 이로써 사타구니 림프절에서 관찰되는 색소침착의 점진적인 증가를 보여준다. 멜라닌 침착은 흑색종 항원 MelanA 및 Braf V600E의 면역조직화학적 염색에 의해 확인된 바와 같이 전이된 흑색종 세포의 존재로 인해 변함없이 존재하기 때문이다.세분화 단계가 끝나면 모든 절편은 림프절의 외부 윤곽선의 오버레이를 보여주었습니다. 4-HT 치료 후 4, 5, 6 주에 분석 된 오른쪽 사타구니 림프절의 3D 렌더링이 여기에 나와 있습니다. 시간이 지남에 따라 동일한 동물의 왼쪽 및 오른쪽 사타구니 림프절의 부피 증가도 정량화되었습니다.초음파 이미징을 적절한 면역 조직 화학 염색과 결합하여 암세포의 존재를 분자 수준에서 확인하는 것이 좋습니다. 림프절 외에도 피하 전이의 양은 초음파 이미징을 사용하여 시간이 지남에 따라 모니터링 할 수 있습니다. 두 주 기간이 너무 짧아서 연구중인 약물의 효과를 이해할 수 없다면 말초 유도 부위 또는 종양이 발생하기 쉬운 유전자형을 선택하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

가까운 적외선 형광 (NIRF)를 사용하여 최근 개발 된 이미징 기술은 림프 시스템의 암 전이에서 활약 역할, 면역 반응, 상처 수리 및 기타 림프 - 관련 질병을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징

이 비디오에서는 초고주파 초음파 이미징을 사용하여 마우스 모델의 서혜부 림프절을 이미지화하는 기술을 보여줍니다. 이 비침습적 이미징 기술을 통해 시간 경과에 따른 동물의 림프절 용적 변화를 모니터링할 수 있습니다.

마우스 서혜부 림프절 부피 분석: 마우스 모델에서 서혜부 림프절의 부피를 결정하기 위한 초고주파 초음파 이미징 기법

이 프로토콜은 촬상 마우스 경부 림프절에 대한 고주파 초음파 (HFUS)의 애플리케이션을 설명한다. 이 기술은 시각화 및 경부 림프절 형태, 양 및 혈류의 정량을 최적화한다. 경부 림프절 조직 학적 평가를위한 림프 조직의 처리의 영상 유도 조직 검사도 설명된다.

마우스 경부 림프절의 고주파 초음파 이미징

환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 흑색종 분자 및 생물학적 특징을 보다 강력하게 회귀하고 기존의 플라스틱 조직 배양 계 세포 에 비해 치료 반응의 더 예측이다. 여기서는 새로운 PDX 모델 의 확립과 기존 PDX 모델의 특성화/실험에 대한 표준 운영 프로토콜에 대해 설명합니다.

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

이 프로토콜은 초음파 화상 진찰에 의하여 형성된 종양의 정량화뿐만 아니라 마우스에 있는 KRAS 폐 종양을 유도하기 위하여 취한 단계를 기술합니다. 작은 종양은 B 선으로 초기 시간대에 시각화됩니다. 이후 시점에서 상대 종양 부피 측정은 초음파 소프트웨어의 측정 도구에 의해 달성됩니다.

초음파 화상 진찰에 의하여 마우스에 있는 폐 종양 진행의 탐지

림프부종은 림프 기능 장애로 인한 사지 부종입니다. 우리는 림프부종의 만성 뮤린 꼬리 모델과 꼬리에 유전화물 전달을위한 조직 나노 트랜스펙션 기술 (TNT)의 새로운 사용을 설명합니다.

뮤린 테일 림프부종 모델

암세포와 섬유아세포를 공동 주입하고 시간 경과에 따른 종양 성장을 모니터링하는 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 종양 성장의 조절자로서 섬유아세포의 역할에 대한 분자적 기초를 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

종양 성장에서 암 관련 섬유아세포의 역할을 조사하기 위한 마우스 모델

현재 프로토콜은 전체 마우스 갑상선을 시각화하고 역형성 갑상선 암종의 성장을 모니터링하기 위한 고주파 초음파를 설명합니다.

유전자 조작 마우스 모델에서 동소 ATC 종양 분석을 위한 고해상도 초음파 검사

여기에 제시된 실험 설계는 림프절(LN) 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 연구에 유용한 생식 모델을 제공하며, 이는 방관자 CD8+ T 세포의 섭동을 배제합니다.

종양 형성 중 항원 특이적 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 배액 림프절 전이 모델

배우세요 초고주파 초음파 이미징을 이용하여 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 림프절 부피를 비침습적으로 측정하는 방법을. 이 기술은 전이성 흑색종 진행을 종단적으로 모니터링하고 약물 효능을 평가하는 데 이상적입니다.

흑색종의 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 초고주파 초음파 이미징에 의한 림프절 부피 분석

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