Name: RNA 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법: 림마, EdgeR, DESeq2 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 학습하세요 RNA 시퀀싱 데이터의 차동 발현 분석을 위한 limma, EdgeR, DESeq2 방법론을 RStudio에서 활용하는 전체 프로토콜. 담관암 데이터를 활용하여 세 가지 방법의 비교 분석과 차등 발현 유전자 식별 과정을 상세히 다룹니다.

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이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81860276 보조금)과 국가 핵심 R&D 프로그램의 주요 특별 기금 프로젝트(보조금 2018YFC1003200)의 지원을 받았습니다.

참고: R-스튜디오 프로그램을 열고 R 파일 "DEGs.R"을 로드하면 추가 파일/스크립트에서 파일을 얻을 수 있습니다.
1. 데이터 다운로드 및 사전 처리
<ol><li>암 게놈 아틀라스(TCGA)에서 콜린고이오사르키노마(CHOL)의 고처리량 시퀀싱(HTSeq) 카운트 데이터를 다운로드한다. 이 단계는 다음 R 코드로 쉽게 수행할 수 있습니다.<ol>
<li>R 패키지를 설치하려면 실행을 클릭합니다.</li>
		<li>R 패키지를 로드하려면 실행을 클릭합니다. if(!requireNamespace("BiocManager", 조용히=TRUE)) + 설치.패키지 ("바이오 매니저") 바이오매니저::설치(c("TCGAbiolinks", "요약실험"))</li>
		<li>작업 디렉터리 설정합니다. 라이브러리 (TCGAbiolinks) 라이브러리(요약실험) setwd("C:/사용자/류시이/데스크탑")</li>
		<li>암 유형을 선택합니다. 암 <- "TCGA-CHOL"</li>
		<li>"GDCquery.R" 파일에서 R 코드를 실행하여 데이터를 다운로드합니다. 파일 "GDCquery.R"은 보충 파일 / 스크립트에서 수집 할 수 있습니다 : 소스("추가 파일/스크립트/GDCquery.R") 헤드(cnt) ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##ENSG00000000003 4262 ##ENSG00000000005 1 ##ENSG00000000419 1254 ##ENSG00000000457 699 ##ENSG00000000460 239 ##ENSG00000000938 334 참고: 실행 후 CHOLHTSeq 카운트 데이터를 다운로드하여 "cnt"라고 명명하여 행은 앙상블 유전자 ID를 나타내고 컬럼은 샘플 ID를 나타냅니다. 샘플 아이디에서 위치 14-15의 숫자를 주의하십시오. 01에서 09까지의 숫자는 종양을 나타내고 10에서 19까지오는 것은 정상 조직을 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>앙상블 유전자 ID를 유전자 기호로 변환합니다.<ol>
<li>저장 경로에 따라 어반으로 가져와서 R으로 가져옵니다. 추가 파일(gencode.v22.annotation.gtf)은 보충 파일에서 획득할 수 있습니다. gtf_v22 <-rtracklayer::import('보충 파일/gencode.v22.annotation.gtf')</li>
		<li>"gtf_v22"에서 R 코드를 실행합니다. 보충 파일 / 스크립트에서 획득 할 수있는 R"파일 : 출처("보충 파일/스크립트/gtf_v22. R")</li>
		<li>앙상블 유전자 ID를 유전자 기호로 변환하는 기능 "ann"을 적용합니다. cnt=ann (cnt,gtf_v22)</li>
	</ol>
</li>
	<li>저발현 유전자 필터링<ol>
<li>실행을 클릭하여 R 패키지 "edgeR"을 설치합니다. 바이오매니저::설치("edgeR")</li>
		<li>달리기를 클릭하여 R 패키지 "edgeR"을 로드합니다. 라이브러리(에지R)</li>
		<li>다음 R 코드를 실행하여 백만 개당 개(CPM) 값을 가진 유전자를 두 개 이상의 샘플중 하나보다 큰 것으로 유지합니다. <-rowSums(cpm(cnt)>1)>=2유지 cnt <- as.matrix (cnt[keep,]) 참고: 100만(CPM) 값은 읽기 수 대신 사용되며, 다양한 시퀀싱 깊이로 인한 편차를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. "림마"를 통한 차분식 분석
<ol><li>달리기를 클릭하여 R 패키지 "림마"를 설치합니다. 바이오매니저:설치("림마")</li>
	<li>달리기를 클릭하여 R 패키지 "림마", "edgeR"을 로드합니다. 도서관(림마) 라이브러리(에지R)</li>
	<li>다음 R 코드를 실행하여 설계 행렬을 만듭니다. 그룹 <- substring(colnames(cnt),14,15) # Extract group information 그룹[그룹 %인% "01"] <- "Cancer" # set '01' as tumor tissue 그룹[그룹%인% "11"] <- "Normal" # set '11' as normal tissue 그룹 <- factor (group, levels = c("Normal","Cancer"))
	<ol><li>디자인 행렬을 만듭니다. 설계 <-model.matrix(~그룹) <-콜네임(cnt)</li>
		<li>DGEList 개체를 만듭니다. dge <-DGEList(카운트 = cnt, 그룹 = 그룹)</li>
		<li>데이터를 정규화합니다. dge <- calcNormFactors (dge, 방법 = "TMM")</li>
		<li>다음 R 코드를 실행하여 림마 추세 메서드 기반 차동 식 해석을 수행합니다. dge #클래스의 #An 객체 "DGEList" ##$counts ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##TSPAN6 4262 ##DPM1 1254 ##SCYL3 699 ##C1orf112 239 ##FGR 334</li>
		<li>CPM 값을 계산합니다. 로그지 <-cpm(dge, log=TRUE, 이전.count=3)</li>
		<li>선형 모델에 맞게 실행을 클릭하여 데이터를 예측하거나 변수 간의 관계를 추론합니다. 핏 <-lmFit (로지, 디자인)</li>
		<li>베이지안을 기준으로 T 값, F 값 및 로그 배당률을 계산합니다. <- 이베이즈(적합, 트렌드=TRUE)</li>
		<li>결과 테이블을 추출합니다. res_limma<-as.data.frame(topTable(적합,n=Inf)) 헤드(res_limma) ## 로그FC AveExpr t P.Value adj. P.Val B ##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823 ##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656 ##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001 ##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056 ##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704 ##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543 #The 차분발 분석 결과는 유전자 id, log2 접이식 변화값(logFC), 실험에서 유전자의 평균 로그2 발현 수준(AveExpr), 수정된 t 통계(t), p.값(P.Value), 거짓 발견률(FDR) 수정된 p값(adj)을 포함하는 "res_limma"에 저장된다. P.Val) 및 차별화된 발현 유전자의 로그 확률(B) 참고: "edgeR"의 함수 "calcNormFactors()"는 샘플 준비 또는 라이브러리 구성 및 시퀀싱으로 인한 영향을 제거하기 위해 데이터를 정규화하는 데 사용되었습니다. 설계 매트릭스의 시공에서, 매트릭스의 ID를 샘플링하기 위해 실험 설계(예를 들어, 조직 유형: 정상 또는 종양 조직)를 일치시켜야 한다. 림마 추세는 시퀀싱 깊이가 동일하는 데이터에 적합하며 림마 붐은 적합합니다: (i) 샘플 라이브러리 크기가 다른 경우; (ii) TMM에 의해 정규화되지 않은 데이터; (iii) 데이터에는 많은 "노이즈"가 있습니다. 양성 로그FC는 유전자가 실험에서 업 규제된다는 것을 의미하며, 음수수는 유전자가 다운 규제된다는 것을 의미합니다.</li>
		<li>DEGs를 식별합니다. res_limma$sig <- as.factor( ifelse (res_limma $ adj. P.Val < 0.05 및 복근(res_limma$logFC) > 2, ifelse (res_limma $logFC > 2,''up','down'),'not')) # adj.p 값 < 0.05 및 |log2FC| >= 2는 DEG를 식별하는 임계값입니다. 요약(res_limma$sig) ##down ##1880 ​17341 1443</li>
		<li>결과 테이블을 파일에 출력합니다. 쓰기.csv(res_limma, 파일 = 'result_limma.csv')</li>
		<li>달리기를 클릭하여 R 패키지 "ggplot2"를 설치합니다. 설치.패키지("ggplot2")</li>
		<li>달리기를 클릭하여 R 패키지 "ggplot2"를 로드합니다. 라이브러리(ggplot2)</li>
		<li>"화산"에서 R 코드를 실행합니다. R"화산 플롯을 만들 수 있습니다. 파일 "화산. R"은 보충 파일에서 획득할 수 있습니다. 출처("보충 파일/스크립트/화산. R") 화산 (res_limma"로그FC","adj. P.Val",2,0.05) 참고: 유전자는 log2FC 및 adj-p 값에 따라 서로 다른 위치에 매핑할 수 있으며, 상향 조절 된 DEG는 빨간색으로 칠하고, 하향 조절 된 DEG는 녹색으로 칠해로 표시됩니다.</li>
		<li>화산 플롯을 저장하려면 내보내기를 클릭합니다. 참고: 화산 플롯은 다양한 형식(예: PDF, TIFF, PNG, JPEG 형식)으로 생성되고 다운로드할 수 있습니다. 유전자는 그들의 log2FC 및 adj p 값에 따라 다른 위치로 매핑될 수 있고, 상향 조절 DEGs (log2FC > 2, adj p < 0.05)는 빨간색으로 칠하게되며, 다운 규제 DEGs (log2FC < -2, adj p < 0.05)는 녹색으로 착색되고 비 DEG는 회색으로 채색됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. "edgeR"을 통한 차동 식 분석
<ol><li>달리기를 클릭하여 R 패키지 "edgeR"을 로드합니다. 라이브러리(에지R)</li>
	<li>다음 R 코드를 실행하여 디자인 행렬을 만듭니다. 그룹 < 서브스트링(콜네임(cnt),14,15) 그룹[그룹%인% "01"] <- "암" 그룹[그룹%인% "11"] <- "보통" 그룹 =인자(그룹, 레벨 = c("정상","암")) 설계 < 모델.매트릭스(~그룹) 로네임(디자인) = 콜네임(cnt)</li>
	<li>실행을 클릭하여 DGEList 개체를 만듭니다. dge <- DGEList (카운트 = cnt)</li>
	<li>데이터를 정규화합니다. dge <- calcNormFactors (dge, 방법 = "TMM")</li>
	<li>실행을 클릭하여 유전자 발현 값의 분산을 추정합니다. dge <-추정Disp (dge, 디자인, 견고한 = T)</li>
	<li>실행을 클릭하여 모델을 사용하여 데이터를 계산합니다. 핏 <-glmQLFit (dge, 디자인)</li>
	<li>통계 테스트를 수행합니다. 핏 <-glmQLFTest(적합)</li>
	<li>결과 테이블을 추출합니다. 결과는 로그 폴드 변경 값, 로그 CPM, F, p 값 및 FDR 수정 p 값을 포함하는 "res_edgeR"에 저장됩니다. res_edgeR=as.data.frame(topTags(적합, n=Inf)) 헤드(res_edgeR) ## 로그FC 로그CPM F PValue FDR ##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21 ##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R ##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20 ##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20 ##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20 ##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19 #The 결과는 로그 폴드 변경 값(logFC), 로그 CPM, F, p 값 및 FDR 수정 p 값을 포함하는 "res_edgeR"에 저장됩니다.</li>
	<li>DEGs를 식별합니다. res_edgeR$sig = as.factor( ifelse(res_edgeR$FDR < 0.05 및 복근(res_edgeR$logFC) > 2, ifelse (res_edgeR$logFC > 2,'up','down'),'''하지 않음)) 요약(res_edgeR$sig) ##down ##1578 15965 3121</li>
	<li>결과 테이블을 파일에 출력합니다. 쓰기.csv(res_edgeR, 파일 = 'res_edgeR.csv')</li>
	<li>화산 플롯을 만듭니다. 화산(res_edgeR"로그FC",FDR",2,0.05)</li>
	<li>화산 플롯을 저장하려면 내보내기를 클릭합니다.</li>
</ol>4. "DESeq2"를 통한 차분 식 분석
<ol><li>실행을 클릭하여 R 패키지 "DESeq2"를 설치합니다. 바이오매니저:설치("DESeq2")</li>
	<li>R 패키지 "DESeq2"를 로드하려면 실행을 클릭합니다. 라이브러리(DESeq2)</li>
	<li>다음 R 코드를 실행하여 그룹화 계수를 결정합니다. 그룹 < 서브스트링(콜네임(cnt),14,15) 그룹[그룹%인% "01"] <- "암" 그룹[그룹%인% "11"] <- "보통" 그룹 =인자(그룹, 레벨 = c("정상","암"))</li>
	<li>DESeqDataSet 개체를 만듭니다. dds <-DESeqDataSetFromMatrix (cnt, DataFrame(그룹), 디자인 = ~그룹) dds ##class: 데세크데이터세트 ##dim: 20664 45 ##metadata(1): 버전 ##assays(1): 카운트 ##rownames (20664): TSPAN6 DPM1 ... RP11-274B21.13 LINC01144 ##rowData 이름(0): ##colnames (45): TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ... ##colData 이름(1): 그룹</li>
	<li>분석을 수행합니다. dds <- DESeq (dds)</li>
	<li>결과 테이블을 생성합니다. res_DESeq2 <-data.frame(결과(dds)) 헤드(res_DESeq2) ## 베이스평균 로그2폴드변경 lfcSE 통계 표판 패드 ##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02 ##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03 ##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01 ##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03 ##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01 ##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11 참고: 결과는 정규화된 읽기 수(baseMean), 로그 폴드 변경 값(log2FoldChange), 로그 폴드 변경 표준 오류(lfcSE), Wald 통계(통계), 원본 p값(pvalue) 및 수정된 p 값(padj)의 평균을 포함하는 "res_DESeq2"에 저장됩니다.</li>
	<li>DEGs를 식별합니다. res_DESeq2$sig = as.factor( ifelse (res_DESeq2$ padj < 0.05 및 복근 (res_DESeq2 $log2FoldChange) > 2, ifelse(res_DESeq2$log2FoldChange > 2,'up','down'),''하지 않음')) 요약(res_DESeq2$sig) ##down ##1616 16110 2938</li>
	<li>결과 테이블을 파일에 출력합니다. 쓰기.csv(res_DESeq2, 파일 = 'res_DESeq2.csv')</li>
	<li>화산 플롯을 만듭니다. 화산 (res_DESeq2,"log2FoldChange","padj",2,0.05)</li>
	<li>화산 플롯을 저장하려면 내보내기를 클릭합니다.</li>
</ol>5. 벤 다이어그램
<ol><li>실행을 클릭하여 R 패키지 "VennDiagram"를 설치합니다. 설치.패키지("벤다이어그램")</li>
	<li>R 패키지 "VennDiagram"를 로드하려면 실행을 클릭합니다. 라이브러리(벤다이어그램)</li>
	<li>최대 규제 된 DEGs의 벤 다이어그램을 확인합니다. grid.newpage () grid.draw(venn.다이어그램(목록(림마=로네임(res_ 림마[res_limma$sig="up",]), edgeR=로네임(res_edgeR[res_edgeR$sig=="up",]), DESeq2=로네임(res_DESeq2[res_DESeq2$sig== "위로",)) NULL, 높이 = 3,너비 = 3,단위 = "in", col="블랙", lwd=0.3,fill=c("#FF6666","#FFFF00", "#993366"), 알파=c(0.5, 0.5, 0.5), 메인 = "최대 규제 DEGs"))</li>
	<li>내보내기를 클릭하여 Venn 다이어그램을 저장합니다.</li>
	<li>다운 규제 DEGs의 벤 다이어그램을 확인합니다. grid.newpage () grid.draw(venn.다이어그램(목록(림마=로네임(res_ 림마[res_limma$sig="down",]), edgeR=행이름(res_edgeR[res_edgeR$sig== "아래로",]), DESeq2=로네임(res_DESeq2[res_DESeq2$sig=="down",]))) NULL, 높이 = 3,너비 = 3,단위 = "in", col="블랙", lwd=0.3,fill=c("#FF6666","#FFFF00", "#993366"), 알파=c(0.5, 0.5, 0.5), 메인 = "다운 규제 DEGs"))</li>
	<li>내보내기를 클릭하여 Venn 다이어그램을 저장합니다.</li>
</ol>

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<li>Reeb, P. D., Steibel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+statistical+analysis+models+for+RNA+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluating statistical analysis models for RNA sequencing experiments.</a> Frontiers in Genetics. 4, 178(2013).</li>
<li>Rocke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+False+Positive+Rates+in+Methods+for+Differential+Gene+Expression+Analysis+using+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Excess False Positive Rates in Methods for Differential Gene Expression Analysis using RNA-Seq Data.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC genomics. 11, 383(2010).</li>
<li>Leng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBSeq%3A+an+empirical+Bayes+hierarchical+model+for+inference+in+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 29, Oxford, England. 1035-1043 (2013).</li>
</ol>

원고는 이전에 출판되지 않았으며 다른 곳에서 출판될 것으로 간주되지 않습니다. 모든 저자는 중요한 지적 콘텐츠에 대한이 원고의 작성에 기여하고 읽고 최종 원고를 승인했다. 우리는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

암에 있는 풍부한 수차성 전사체는 RNA-seq 차동 분석에 의해 쉽게 확인할 수 있습니다5. 그러나, RNA-seq 차동 발현 분석의 적용은 R 언어와 적절한 방법을 선택할 수 있는 특정 능력을 필요로 하기 때문에 종종 제한됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 RNA-seq 차동 발현 분석을 적용하기위한 세 가지 가장 잘 알려진 방법 (limma, EdgeR 및 DESeq2)에 대한 자세한 소개및 자습서를 제공합니다. 이를 통해 세 가지 방법 모두에 걸쳐 유사점과 차이점을 쉽게 이해하고 개별 데이터에 적합한 방법을 선택할 수 있으며 복잡한 동적 생물학적 과정을 이해할 수 있습니다.
여기서, 우리는 각각 리마, EdgeR 및 DESeq2를 통해 RNA-seq 차동 발현 분석을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다: (i) 데이터의 다운로드 및 사전 처리, (ii-iv) 리마를 통한 차동 발현 분석, (ii-iv) 리마, 에지R 및 DE...

RNA-시퀀싱(RNA-seq)은 많은 장점(예를 들어, 높은 데이터 재현성)을 가진 전사학에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나이며, 복잡한 생물학적 과정의 기능 및 역학에 대한 이해를 크게증가시켰습니다 1,2. 다른 생물학적 맥락에서 비정상적인 전사체의 식별은 또한 분화 유전자 (DEGs)로 알려져 있으며, RNA-seq 분석에서 중요한 단계입니다. RNA-seq는 병인과 관련된 분자 메커니즘 및 생물학적 기능에 대한 깊은 이해를 얻을 수 있게 합니다. 따라서, 차동 분석은종양의진단, 예후 및 치료에 귀중한 것으로 간주되어 왔다3,4,5. 현재, RNA-seq 차동 발현 분석, 특히 림마, DESeq2 및 EdgeR1,6,7을위해 더 많은 오픈 소스 R/바이오 컨덕터 패키지가 개발되었다. 그러나, 차등 분석은 R 언어와 특정 기술과 의료 교육의 교육 과정에서 부족한 적절한 방법을 선택하는 능력이 필요합니다.
본 프로토콜에서, 암 게놈 아틀라스(TCGA)로부터 추출된 담랑고카르시노마(CHOL) RNA-seq 카운트 데이터를 기반으로, 가장 공지된 방법 중 3개(림마8,EdgeR9 및 DESeq210)가각각 R프로그램에 의해 CHOL과 정상 조직 간의 DEGs를 식별하였다. limma, EdgeR 및 DESeq2의 세 가지 프로토콜은 유사하지만 분석 프로세스 마다 다른 단계가 있습니다. 예를 들어, 정규화된 RNA-seq 카운트 데이터는 EdgeR 및 limma8,9에필요하며, DESeq2는 자체 라이브러리 불일치를 사용하여정규화(10)가아닌 데이터를 수정한다. 더욱이, edgeR은 RNA-seq 데이터에 특히 적합하며, 림마는 마이크로어레이 및 RNA-seq에 사용된다. 선형 모델은 LIMma에 의해 채택되어DEGs(12)를평가하고, edgeR의 통계는 경험적 베이추정, 정확한 테스트, 일반화선형 모델 및 준가능성 시험9을포함한 음수 이난 분포를 기반으로 한다.
요약하자면, 우리는 각각 림마, DESeq2 및 EdgeR을 사용하여 RNA-seq 차동 발현 분석의 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 문서를 참조함으로써 사용자는 RNA-seq 차동 분석을 쉽게 수행하고 데이터에 적합한 차동 분석 방법을 선택할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>R</td><td></td><td>버전 3.6.2</td><td>자유 소프트웨어</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td>자유 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

rna 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법: 림마, edger, deseq2

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA 시퀀싱 (RNA-seq)은 유전 적 변경과 복잡한 생물학적 과정 사이의 관계를 밝힐 수 있으며 종양의 진단, 예후 및 치료에서 큰 가치를 가지고 있기 때문에 전사학에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. RNA-seq 데이터의 차동 분석은 비정상적인 전사를 식별하는 데 매우 중요하며 림마, EdgeR 및 DESeq2는 차동 분석을 위한 효율적인 도구입니다. 그러나, RNA-seq 차동 분석은 R 언어를 가진 특정 기술과 의학 교육의 교과 과정에서 부족한 적당한 방법을 선택하는 기능이 필요합니다.
본 명세서에서는, 당사는 각각 림마, DESeq2 및 EdgeR을 통해 담랑고아르시노마(CHOL) 및 정상 조직 간의 분화유전자(DEGs)를 식별하고, 그 결과는 화산 플롯및 벤 다이어그램에 도시된다. limma, DESeq2 및 EdgeR의 세 가지 프로토콜은 유사하지만 분석 프로세스 마다 다른 단계가 있습니다. 예를 들어 선형 모델은 림마의 통계에 사용되는 반면 음수 이비알 분포는 edgeR 및 DESeq2에서 사용됩니다. 또한, 정규화된 RNA-seq 카운트 데이터는 EdgeR 및 림마에 필요하지만 DESeq2에는 필요하지 않습니다.
여기서는 림마, EdgeR 및 DESeq2의 세 가지 차동 분석 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세 가지 방법의 결과는 부분적으로 겹칩니다. 세 가지 방법 모두 고유한 장점이 있으며 메서드 선택은 데이터에만 따라 다릅니다.

화산 플롯과 Venn 다이어그램이 특히 사용되는 차동 식 분석의 결과를 시각화하는 다양한 접근 방식이 있습니다. 림마는 |로그FC|≥2와 adj를 가진 CHOL과 정상 조직 사이 3323개의 DEG를 확인했습니다. P.Val&lt;0.05는 임계값으로, 그 중 1880은 CHOL 조직에서 하향 조절되었고 1443은 업규제(그림 1a)였다. 한편, EdgeR은 1578개의 다운 규제 DEGs와 3121개의 업 규제 DEGs(그림1b);를 확인했습니다. DESeq2는 1616개의 하향 규제 DEGs와 2938개의 UP-regulated DEGs(그림1c)를 확인했습니다. 이들 세 가지 방법의 결과를 비교하면, 1431개의 상향 조절 된 DEGs 와 1531 개의 다운 규제 DEGs가 겹쳐졌다(그림 2).
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RNA 시퀀싱을 위한 차동 발현 분석 방법의 상세한 프로토콜이 제공되었다: 림마, EdgeR, DESeq2.

RNA 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법: 림마, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

RNA 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법:림마, EdgeR 및 DESeq2. RStudio 프로그램을 열고 R 파일, DEG를 로드합니다. 파일은 보충 파일에서 얻을 수 있습니다. 1.데이터 다운로드 및 사전 처리.1. 암 게놈 아틀라스에서 Cholangiocarcinoma의 높은 처리량 시퀀싱 카운트 데이터를 다운로드합니다. 이 탭은 다음 코드로 쉽게 얻을 수 있습니다.달리기를 클릭하여 R 패키지를 설치합니다. R 패키지를 로드하려면 실행을 클릭합니다. 작업 디렉터리 설정합니다.암 유형을 선택합니다. 데이터를 다운로드하려면 GDCquery 파일에서 R 코드를 실행합니다. 파일 GDCquery는 추가 파일/스크립트에서 획득할 수 있습니다.실행 후 Cholangiocarcinoma RNA 시퀀싱 카운트 데이터를 다운로드하고 이름을 지정할 수 있으며, 여기서 행은 앙상블 유전자 ID를 나타내고 컬럼은 기호 ID를 나타냅니다. 기호 ID에서 위치 14 ~15의 숫자를 확인하십시오. 숫자 범위는 01에서 09까지 종양을 나타내고 10 에서 19사이 정상 조직을 나타냅니다.1.2.유전자 기호에 앙상블 유전자 ID의 대화. 해당 저장소 경로에 따라 어반으로 가져와야 합니다. 추가 파일에서 추가 파일을 수집할 수 있습니다.gtf v22 파일에서 R 코드를 실행합니다. 보충 파일 / 스크립트에서 획득 할 수 있습니다. 여관"기능을 적용하고 앙상블 유전자 ID를 유전자 기호로 변환합니다.1.3.낮은 발현 유전자를 필터링합니다. 패키지 edgeR을 설치하려면 실행을 클릭"R 패키지 edgeR을로드실행"R 코드 다음 실행은 적어도 두 샘플에서 하나 보다 큰 백만 값으로 유전자를 유지합니다. 2. limma를 통한 차분식 분석 "클릭 실행하여 R 패키지 림마를 설치합니다"클릭 실행하여 R 패키지 림마"edgeR"다음 R 코드를 실행하여 설계 매트릭스를 만듭니다.그룹 정보를 추출합니다. 종양 조직으로 01"을 설정합니다. 11"을 정상 조직으로 설정합니다.디자인 매트릭스를 만듭니다. DGEList 개체를 만듭니다. 데이터를 정규화합니다.다음 R 코드를 실행하여 림마 추세 메서드 기반 차동 식 해석을 수행합니다. CPM 값을 계산합니다. 선형 모델에 맞게 실행을 클릭하여 데이터를 예측하거나 변수 간의 관계를 추론합니다.베이지안을 기준으로 T 값, F 값 및 로그 배당률을 계산합니다. 결과 테이블을 추출합니다. 차동식 해석의 결과는 res_limma"로그2 접이식 변경 값을 포함하는 저장됩니다.실험에서 유전자의 평균 log2 발현 수준이다. 수정된 T 통계, P 값, 거짓 발견률이 p값과 차별화된 발현 유전자의 로그 확률을 보정했다. 차별화된 발현 유전자를 식별합니다.따라서 조정된 P값은 0.05 미만이며, 2보다 크거나 동등한 로그 거짓 변화의 절대값은 차별화된 발현 유전자를 선별하는 임계값이다. 결과 res limma는 일반적인 조직과 비교, 1, 443 유전자는 위로 통제되고, 1, 880 유전자는 Cholangiocarcinoma 조직에서 아래로 통제된다는 것을 보여줍니다. 결과 테이블을 파일에 출력합니다.R 패키지 ggplot2를 설치하려면 실행을 클릭 "R 패키지 ggplot2"화산 파일에서 R 패키지 ggplot2"실행 R 코드를로드하고 파일 화산은 보충 파일에서 획득 할 수 있습니다. 유전자는 그들의 log2 접기 변경 및 조정된 P 값에 따라 다른 위치에 매핑될 수 있습니다. 그래서 상이하게 조절된 분화유전자는 빨간색으로 착색됩니다.그리고 하향 조절 된 분화 유전자는 녹색으로 착색된다. 화산 플롯을 저장하려면 내보내기"를 클릭합니다. 3. edgeR을 통한 차동 식 분석"R 패키지 에지R을 로드하려면 실행을 클릭합니다"디자인 행렬을 만들기 위해 다음 R 코드를 실행합니다.실행을 클릭하여 DGEList 개체를 만들고 데이터를 정규화합니다. 실행을 클릭하여 유전자 발현 값의 분산을 추정합니다. 실행을 클릭하여 모델을 사용하여 데이터를 계산합니다.통계 테스트를 수행합니다. 결과 테이블을 추출합니다. 결과는 로그 폴드 변경 값, logCPM, F, p 값 및 잘못된 검색률수정 p 값을 포함하는 res edgeR"에 저장됩니다.차별화된 발현 유전자를 식별합니다. 결과 res edgeR"는 일반적인 조직과 비교하는 것을 보여줍니다, 3, 121 유전자는 위로 통제되고, 1, 578 유전자는 Cholangiocarcinoma 조직에서 아래로 통제됩니다. 결과 테이블을 파일에 출력합니다.화산 플롯을 만듭니다. 화산 플롯을 저장하려면 내보내기를 클릭합니다. 4. DESeq2를 통한 차동 식 분석.R 패키지 DESeq2를 설치하려면 실행을 클릭"R 패키지 DESeq2를 로드하려면 실행을 클릭"모색 계수를 결정하기 위해 다음 R 코드를 실행합니다. DESeq2 데이터 집합 개체를 만듭니다. 분석을 수행합니다.결과 테이블을 생성합니다. 결과는 정규화된 읽기 수, 로그 폴드 변경 값, 로그 폴드 변경 표준 화살표, 용접 통계, 원본 P 값 및 수정된 P 값의 평균을 포함하는 res DESeq2에 저장됩니다. DEGs를 식별합니다.결과 RES DESeq2는 일반적인 조직과 비교하는 것을 보여줍니다, 이천 아백 삼십8 유전자는 위로 통제되고, 1,000의 6백 및 16개의 유전자는 Cholangiocarcinoma 조직에서 아래로 통제됩니다. 결과 테이블을 파일에 출력합니다. 화산 플롯을 만듭니다.화산 플롯을 저장하려면 내보내기를 클릭합니다. 5. 벤 다이어그램. 실행을 클릭하여 R 패키지 벤 다이어그램을 설치합니다.달리기를 클릭하여 R 패키지 벤 다이어그램을 로드합니다. 최대 조절 된 분화 유전자의 벤 다이어그램을 만듭니다. 밴 다이어그램을 저장하려면 내보내기를 클릭하고, 하향 조절된 분화 유전자의 벤 다이어그램을 만듭니다.내보내기를 클릭하여 벤 다이어그램을 저장합니다. 6. 대표적인 결과. 그림 하나는 림마, edgeR 및 DESeq2에 의해 취득 된 모든 유전자의 화산 플롯을 보여줍니다.음수 로그 p 값은 로그 폴드 변경에 대해 플롯됩니다. 적색점은 상조절된 분화 유전자를 나타내며, 녹색점은 하향 조절된 분화 유전자를 나타낸다. 림마는 1만 80080개의 하향 조절유전자를 분화하고, Cholangiocarcinoma 조직에서 1,000만 4백사십삼의 상발성 발현 유전자를 식별한다.EdgeR은 1,000만 십백8개의 하향 조절 된 분화 유전자를 식별하고, 3천 1백 21 개의 상반된 발현 유전자를 식별합니다. DESeq2는 1,000개의 6백 16개의 하향 조절 된 분화 유전자를 식별하고, 2천 9백삼8개의 상반된 분화 유전자를 식별합니다. 그림 2, 벤 다이어그램은 limma edgeR 및 DESeq2에서 결과 나누기 사이에 중복을 보여 준다.이 세 가지 방법의 결과를 비교하면, 1,000사백삼1up-regulated 분화 유전자, 그리고 1,000,300 개의 다운 조절 된 분화 유전자가 겹치고 있다. 7.결론. 이 프로토콜에서는 R 패키지, 림마, 에지R 및 DESeq2를 사용하여 높은 계열의 카운트 데이터에 대한 다양한 유형의 측정 분석의 세부 프로토콜을 여기에 제공했습니다. 세 가지 방법은 분석 과정에서 유사하고 직원들이 있습니다.그리고 그 세 가지 약에서 그들의 부분적으로 겹칩니다. 세 가지 의약품 모두 고유한 장점이 있습니다. 그리고 선택은 데이터의 시간에 따라 달라집니다.현재 데이터가 있는 경우 limma를 우선적으로 제공해야 하지만 세대 시퀀싱 데이터, edgeR 및 DESeq2가 선호됩니다.

three-differential-expression-analysis-methods-for-rna-sequencing

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 프로토콜은 다음과 같은 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 프로필 transcriptomes에 RNA-seq, 강력한 차세대 DNA 시퀀싱 기술을 적용 할 완전하고 자세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시약 또는 질병 상태에 의해 영향을 다양한 세포 나 조직에 generalizable 수 있습니다.

RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

유전자 발현, 돌연변이 및 유전자 융합에 대해 선택된 전사체를 조사하기 위한 데이터 분석을 사용한 색인화된 cDNA 라이브러리 준비, 혼성화 및 캡처를 포함하는 표적 RNA 염기서열분석 기반 방법을 설명합니다. Targeted RNAseq를 사용하면 데스크톱 염기서열분석기에서 선택된 전사체를 비용 효율적이고 신속하게 평가할 수 있습니다.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

여기에 제시된 RNA-seq 분석에 의한 분자 수준에서의 특성화에 의해 접촉 억제에 의한 인간 1차 각질 세포의 체외 분화를 위한 단계별 절차이다.

RNA-Seq 분석에 의한 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 의 특성화

이 방법은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) RNA 샘플로부터 얻을 수 있는 서열 데이터의 질 및 양을 개선하는 단계를 설명한다. 우리는 FFPE-RNA 샘플의 품질을 보다 정확하게 평가하고, 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, FFPE-RNA 샘플의 데이터를 분석하는 방법론을 설명합니다.

저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화

DiCoExpress는 품질 관리에서 공동 발현에 이르기까지 RNA-Seq 분석을 수행하기 위해 R로 구현 된 스크립트 기반 도구입니다. DiCoExpress는 최대 2개의 생물학적 요인까지 완전하고 불균형한 설계를 처리합니다. 이 비디오 자습서는 DiCoExpress의 다양한 기능을 통해 사용자를 안내합니다.

DiCoExpress를 이용한 다인자 RNA-Seq 실험 분석

대체 스플라이싱(AS) 및 대체 폴리아데닐화(APA)는 전사체 이소형과 그 생성물의 다양성을 확장합니다. 여기에서는 실험 조건에 따라 다양한 AS 및 APA를 검출하고 시각화하기 위해 벌크 RNA-seq 및 3' 말단 시퀀싱 분석을 분석하는 생물정보학 프로토콜을 설명합니다.

RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

현재 작업은 벌크 RNA 시퀀싱 실험에서 사례와 대조군 샘플을 비교하여 생성된 세포 내 신호 전달 경로의 프로필을 기반으로 치료 표적을 예측하고 우선 순위를 지정하는 R 스크립트인 Pathway2Targets 알고리즘을 실행하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

인간 차등적으로 발현된 유전자 목록을 사용하여 다운스트림 경로 농축 분석 및 표적 우선 순위 지정 수행

이 프로토콜은 생물정보학 경험이 제한된 습식 실험실 생물학자를 위한 RNA-seq 실험에 대한 초기 품질 관리를 허용합니다.

Rup(RNA-seq 사용성 평가 파이프라인) - 진핵생물의 대량 RNA-seq 실험을 위한 품질 관리

학습하세요 RNA 시퀀싱 데이터의 차동 발현 분석을 위한 limma, EdgeR, DESeq2 방법론을 RStudio에서 활용하는 전체 프로토콜. 담관암 데이터를 활용하여 세 가지 방법의 비교 분석과 차등 발현 유전자 식별 과정을 상세히 다룹니다.

RNA 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법: 림마, EdgeR, DESeq2

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