Name: 체외 및 척수에서 형광 라벨 작은 세포 외 소포의 섭취 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 PKH 형광 염료로 라벨링한 소형 세포 외 소포(sEV)의 척수 세포 섭취 시각화 프로토콜입니다. 이 방법은 척수 장애, 통증 및 염증 연구에서 sEV의 치료적 역할을 평가하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 NIH NINDS R01NS102836및 펜실베니아 보건부 유니버설 연구 강화(CURE)의 보조금에 의해 지원되었으며, 시나 K. 아지트에게 수여되었습니다. 우리는 원고의 비판적 독서에 대한 박사 브래들리 내쉬 에게 감사드립니다.

참고: 모든 절차는 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수하여 수행되었으며 드렉셀 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 시간 임신 한 CD-1 마우스는 성상체 배양에 사용되었고, 모든 댐은 함침 후 15 일 수신되었다. 12주 된 C57BL/6 마우스는 생체 내 섭취 실험에 사용되었다.
1. RAW 264.7 대식세포로부터 의 대체 분리
<ol><li>배양 RAW 264.7 세포는 DMEM 엑소좀 고갈된 배지에서 75cm2 플라스크로 24-48h에 대해 10% 엑소좀 고갈된 태아소 혈청(FBS)과 1%의 페니실린-연쇄절제술(pen-strep)을 함유하고 있다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 300ml의 조건부 배지 및 원심분리기를 300× g에서 수집합니다.</li>
	<li>4°C에서 20분 동안 2,000g× g에서 상피 및 원심분리기를 수집합니다.</li>
	<li>상체를 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 4°C에서 12,000g에서 35분 동안 ×.</li>
	<li>상체를 수집하고 0.22 μm 주사기 필터를 통해 필터링합니다.</li>
	<li>4°C에서 110,× 000 g에서 80분 동안 초원심분리기 튜브 및 원심분리기로 이송합니다.</li>
	<li>상체(exosome-고갈된 매체)를 저장하고, 1x 인산염 완충식식염(PBS)의 2mL로 펠릿을 재중단하고, 원심분리기는 4°C에서 110,000× g에서 1시간 동안 재차한다.</li>
	<li>나노입자 추적 분석(NTA) 및 투과 전자 현미경검사(TEM) 또는 서부 블로팅을 위한 방사성 면역 침전 분석(RIPA) 버퍼를 사용하여 추가 특성화를 위해 PBS의 100 μL에서 펠릿을 재중단한다.</li>
</ol>2. sEV의 특성화
<ol><li>나노입자 추적 분석(NTA) 참고: RAW 264.7 셀로부터의 정제된 세프의 크기 분포 및 입자 개수/농도는 NTA에 의해 측정되었다.<ol>
<li>최적의 추적을 위해 시야별 20-60 개의 소포를 얻기 위해 필터링 된 PBS의 sEV를 희석합니다.</li>
		<li>일정한 유량의 주사기 펌프를 사용하여 희석된 샘플을 유량 셀에 도입합니다.</li>
		<li>30 s의 3-5 동영상을 촬영합니다. 셔터 속도와 게인을 설정하고 카메라 설정을 수동으로 집중하여 최대 소포 수를 표시하고 추적 및 분석할 수 있습니다.</li>
		<li>복제 측정을 수행하기 위해 각 기록 간에 샘플을 사전합니다. NTA 인수 후 설정을 최적화하고 샘플 간에 설정을 일정하게 유지합니다.</li>
		<li>NTA 소프트웨어를 사용하여 각 비디오를 분석하여 소포의 평균 크기와 농도를 얻습니다.</li>
		<li>일관성을 위해 동일한 시스템 설정으로 모든 NTA 측정을 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>웨스턴 블롯<ol>
<li>제조 업체의 지시에 따라 단백질 분석 키트를 사용 하 여 sEV, 세포 용액 및 엑소좀 고갈 된 매체에서 총 단백질 양을 정량화.</li>
		<li>세포 용해 제제의 경우, 80-90%까지 75cm2 플라스크로 RAW 264.7 세포를 배양한다. 10-15분 동안 0.25%의 트립신으로 세포를 분리하고, 배양 배지로 트립신을 중화시키고, 5분 × 동안 400 g에서 회전하여 세포를 펠릿한다. 신선한 성장 배지에서 세포를 다시 중단.</li>
		<li>혈전계를 사용하여 세포를 계산하고 1 × 106 세포를 다른 튜브로 옮길 수 있습니다. 위와 동일한 원심분리 조건을 사용하여 PBS로 세포를 두 번 세척하고 최종 스핀에서 셀 펠릿에 50 μL의 용해 완충제(protease 억제제 칵테일을 첨가한 RIPA 버퍼)를 추가합니다.</li>
		<li>세포를 소용돌이치며 20분 동안 얼음 위에 보관하십시오. 4°C에서 30분 동안 10,000 ×g의 원심분리로 혼합물을 주체하고, 신선한 미세원심분리기 튜브에서 상체(즉, lysate)를 수집하고, 사용할 때까지 -80°C에서 보관한다.</li>
		<li>단백질의 양을 정량화하기 전에 3 kDa-컷오프 원심 필터를 사용하여 100 μL에 엑소솜 고갈 된 매체의 2 mL을 농축한다. sEV를 1:1 비율로 혼합하고, 30초동안 소용돌이를 만들고, 15분 동안 얼음에 배양하여 단백질의 양을 정량화합니다.</li>
		<li>sEV의 동일한 양의 단백질(2 μg), RAW 264.7 셀 리세이트 및 외성 고갈 된 매체를 샘플 버퍼를 감소시키는 혼합합니다.</li>
		<li>샘플을 95°C에서 5분 동안 분해하고 5분 동안 얼음 위에 보관하고 10,000 ×g에서 2분 동안 회전합니다. 샘플을 12% 트리글리신 단백질 젤에 적재하고 젤을 125 V에서 45분 동안 실행합니다.</li>
		<li>단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인에 25 V에서 2시간 동안 전달한다.</li>
		<li>이송 후, 실온에서 1h에 대한 차단 버퍼 (재료의 테이블참조)와 PVDF 멤브레인을 차단합니다.</li>
		<li>4°C에서 하룻밤 사이에 셰이커에 1차 항체로 블롯을 배양한다. 참고: 사용된 1차 항체는 항 CD81(1:1,000), 항알파-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-상호작용 단백질 X(Alix) (Alix) (Alix) (1:1,000), 칼넥신 방지(1:1,000), 및 안티 글리세랄데히드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH) (1:1,000).</li>
		<li>1x 트라이버퍼식 식염수, 0.1% 트웬 20(TBST)으로 블로트 3 x 15분 세척, 염소 안티마우스 IgG-고추냉이 과로시다제(HRP) 또는 당나귀 안티래빗 IgG-HRP-컨쥬게이드 이차 항체(1:10,000 h)로 실온에서 배양한다.</li>
		<li>1x TBST로 3 x 15분 동안 블롯을 세척하고 HRP 기판을 사용하여 단백질을 감지합니다.</li>
		<li>웨스턴 블롯 이미저를 사용하여 향상된 화학 발광을 사용하여 얼룩을 분석합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>투과 전자 현미경 검사법 (TEM)<ol>
<li>0.1 M 인산염 버퍼(PB)에서 2% 파라포름알데히드(PFA)로 재보설하여 sEV를 수정합니다. 2 x 15 s용 소용돌이.</li>
		<li>깨끗한 파라필름에 10 μL의 sEV 서스펜션을 놓습니다. 카본 코팅 폼바 그리드를 서스펜션을 향한 코팅된 면을 플로팅합니다. 마른 환경에서 멤브레인을 20 분 동안 흡수하십시오.</li>
		<li>그리드(멤브레인 사이드 다운)를 PB 한 방울에 놓고 3 x 2 분 동안 세척하십시오.</li>
		<li>그리드를 5분 동안 1% 글루타랄데히드의 50 μL로 전송합니다.</li>
		<li>8 x 2 분 동안 증류수 100 μL로 그리드를 세척하십시오.</li>
		<li>2 분 동안 1 % uranyl 아세테이트의 드롭에 그리드를 배치하여 샘플을 대조.</li>
		<li>시료를 0.2%의 50 μL에 2% 메틸셀룰로오스 용액으로 파라필름으로 덮인 얼음 접시에 10분 동안 포함시합니다.</li>
		<li>스테인레스 스틸 루프를 사용하여 그리드를 유지하고 필터 용지로 과도한 유체를 제거합니다.</li>
		<li>루프에 있는 동안 그리드를 10분 동안 공기 건조시합니다.</li>
		<li>80 kV에서 전송 전자 현미경으로 관찰하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. sEV 라벨링
<ol><li>염료 제어를 위한 희석완충액 1mL 또는 동일한 PBS 부피1mL에 20 μg의 sEV를 희석시 희석한다.</li>
	<li>희석 완충제의 1mL에 PKH67 또는 PKH26 염료3μL을 희석하고 파이펫팅하여 혼합한다.</li>
	<li>희석된 PKH 염료를 희석된 SEV에 넣고 파이펫팅하여 섞습니다. 실온에서 어둠 속에서 5 분 동안 배양하십시오. 염료 제어를 위해, 3.1 단계에서 희석 된 PBS와 희석 된 염료를 혼합합니다.</li>
	<li>PBS에 1% 소 세럼 알부민(BSA)의 2mL을 첨가하여 염료와 sEV 믹스를 튜브에 넣고 염료를 흡수한다.</li>
	<li>4°C에서 110,000 × g에서 1h의 원심분리기. 상체를 버리고, PBS의 2mL에서 펠릿을 재차, 원심분리기는 4°C에서 110,000 × g에서 1h로 재차한다. PBS로 세척을 반복하고 표지된 SEV 또는 염료 제어를 동일한 볼륨으로 복리용합니다.</li>
	<li>브래드포드 방법에 의한 총 단백질의 양을 정량화한다.</li>
</ol>4. 신경-2a 세포에 의한 sEV 섭취
<ol><li>12웰 플레이트에 18mm 커버립을 놓고 10개의 × 104 Neuro-2a 세포를 10% FBS 및 1% 펜 스트렙을 함유한 완전한 DMEM 배지 1mL의 총 1mL에 배치합니다.</li>
	<li>세포 수렴성이 80-90%인 경우 배지를 DMEM 엑소좀 고갈된 매체로 변경한다. 1, 5 또는 10 μg의 라벨이 붙은 sEV를 각 웰에 1, 4 및 24h에 추가하여 용량 및 시간 의존적 섭취를 하거나 동일한 양의 염료 제어를 추가합니다.</li>
</ol>5. 초등회 성상세포 문화
<ol><li>저체온증을 유도하여 출생 4 일 후에 출생 후 새끼 4개 마취.</li>
	<li>10mM 4-(2-하이드록세틸)-1-파이프라진에탄황포닉산(HEPES)으로 보충된 얼음-차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 함유한 60mm 페트리 접시에서 뇌를 수집합니다.</li>
	<li>피질 엽을 모두 해부하고 수막을 제거합니다. 멸균 된 블레이드로 조직을 다진다.</li>
	<li>조직을 파충/데옥시리보누벨리스 I 해리 버퍼를 포함하는 15mL 원추형 튜브로 이송하고 37°C에서 20분 동안 배양한다. 5분마다 소용돌이치기. 참고: 4개의 마우스 코르티제의 경우, HBSS의 7.5 U/mL 파파인 9mL이 37°C에서 30분 이상 활성화되고, 0.22 μm 주사기 필터를 통해 여과하고, 데시리보누벨리스 I와 혼합하여 0.1 mg/mL의 최종 농도로 혼합한다.</li>
	<li>수퍼내티츠를 흡인시키고 완전한 DMEM 5mL를 추가하여 효소 활성을 비활성화합니다. 5mL 유리 세로지컬 파이펫과 화염 광택 파스퇴 파이펫으로 조직을 분리하는 것을 조심스럽게 세심하게 세심하게 합니다.</li>
	<li>40 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과하고 4 °C에서 5 분 동안 250 × g에서 세포를 원심 분리합니다. 75cm2 플라스크에서 전체 DMEM의 10mL에서 배지를 흡인하고 세포를 시드한다. 도금 후 4h의 신선한 DMEM 배지 15mL로 상체 매체를 교체하십시오.</li>
	<li>시험관에서14 일 후, 6 시간 동안 320 rpm에서 마이크로글리아와 올리고덴드로키트를 분리하기 위해 플라스크를 궤도 셰이커로 옮다.</li>
	<li>37°C에서 10분 동안 세포 해리효소(재료 표)의5mL를 사용하여 나머지 성상세포를 트립시션한다. 완전한 DMEM 5mL을 추가하여 효소 작용을 비활성화하고 4 °C에서 5 분 동안 250 × g에서 세포를 펠릿하십시오.</li>
	<li>전체 DMEM에서 셀을 다시 일시 중지합니다. 씨앗 5 × 104 셀에 12 mm #1.5 커버립 24 웰 플레이트에.</li>
</ol>6. 성상세포에 의한 sEV 섭취
<ol><li>성상 세포가 80-90 %의 합류에 도달하면 매체를 DMEM 엑소솜 고갈 매체로 변경합니다.</li>
	<li>레이블이 지정되지 않은 레이블이 없는 sEV 1μg, 동일한 양의 염료 제어 또는 PBS를 셀에 추가합니다. sEV 치료 후 1h 및 24 h염색세포를 사용하십시오.</li>
</ol>7. 면역형광
<ol><li>PBS 3x로 세포를 헹구고 실온에서 10 분 동안 PB에서 4 % PFA로 고정하십시오.</li>
	<li>고정셀을 PB로 3 x 5분 세척하고 PB에서 0.1% 트리톤 X-100을 사용하여 10-15분 동안 세척하고 PB 3 x 5분으로 세척합니다.</li>
	<li>실온에서 1시간 동안 PB에서 5% 정상 염소 혈청(NGS)으로 세포를 차단합니다.</li>
	<li>1 차적인 항체로 세포를 배양: microtubule 관련 단백질 2 (MAP2A, 1:500) 신경-2a 세포 또는 신경교낭 산성 단백질 (GFAP, 1:500) 신선한 5% NGS/PB 에 대한 신선한 5% NGS/PB 는 부드러운 흔들림으로 4°C에서 하룻밤 사이에.</li>
	<li>PB로 3 x 10 분 세척하고 플루오로포레 접합 보조 항체 (염소 안티 마우스 IgG1, 알렉사 플루어 594; 또는 염소 안티 마우스 IgG H&L, 알렉사 플루어 488)를 5 % NGS에 추가하고 로커의 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>PB로 3 x 10분 세척하고 핵 얼룩 4',6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI)의 1μg/mL로 실온에서 10분 동안 배양하십시오. PB로 셀을 다시 3배 다시 세척합니다.</li>
	<li>페이드 장착 방지 매체를 사용하여 #1 슬라이드에 커버립을 장착합니다. 어둠 속에서 밤새 건조하고, 공초점 현미경에 이미징 될 때까지 4 °C에서 준비 된 유리 슬라이드를 저장합니다.</li>
</ol>8. sEV의 생체 내 섭취
<ol><li>표지되지 않은 또는 표지된 sEV 5μg의 인트라테칼 주입을 PBS의 10 μL로 재장매하거나, 동일한 부피(10 μL)의 염료 제어(섹션 3에서 제조됨)를 C57BL/6 마우스로 주입한다.</li>
	<li>후 6 및 18 sEV의 후 주입, 깊이 케타민의 100 mg/kg 체중의 내 역류 주사와 자일라진의 10 mg/kg 체중에 의해 마우스를 마취.</li>
	<li>0.9% 식염수로 생쥐의 심내 복혈을 수행하여 혈액을 씻어내고, 갓 만든 얼음 차가운 4% PFA/PB가 그 뒤를 이습니다.</li>
	<li>척수를 해부하고 24 시간 동안 4 ° C에서 4 % PFA / PB로 수정하십시오. Cryo는 24 시간 동안 또는 조직이 가라 앉을 때까지 PB에서 30 % 자당에서 조직을 보호합니다. 면역 조직 화학까지 4 °C에서 조직을 저장합니다.</li>
</ol>9. 면역 작용화학
<ol><li>O.C.T 화합물에 L4-L5 척수를 포함. 완전히 고화 될 때까지 드라이 아이스에 동결.</li>
	<li>저온을 사용하여 30 μm(척수의 단면)에서 조직을 섹션화하고 PB를 포함하는 24웰 플레이트에서 단면을 수집합니다. PB에서 0.3 % 트리톤으로 섹션 3 x 5 분 세척하십시오.</li>
	<li>실온에서 2시간 동안 0.3% Triton/PB에서 5% NGS로 비특이적 결합 부위를 차단합니다.</li>
	<li>희석 1차 항체: 항 MAP2A(1:500), GFAP(1:1,000), 마이크로글리아용 이바1(1:2,000), 0.3% 트리톤/PB에서 5% NGS를, 셰이커에 4°C로 하룻밤 동안 배양한다.</li>
	<li>섹션 3 x 5 분 0.3% 트리톤/PB로 세척하고, 실온에서 2시간 동안 5% NGS/PB에 이차 항체(당나귀 안티래빗 IgG 알렉사 플루어 488, 1:500 또는 염소 안티 마우스 IgG 알렉사 플루어 488, 1:500)를 추가합니다.</li>
	<li>PB로 3 x 5분 세척하고 실온에서 10분 동안 DAPI의 1 μg/mL로 섹션을 배양합니다. PB로 섹션 3 x 5 분 세척합니다.</li>
	<li>깨끗한 접착제 슬라이드(재료 테이블)에섹션을 마운트하고 가벼운 현미경 아래에 미세 한 페인트 브러시를 장착합니다.</li>
	<li>장착 매체로 커버슬립을 적시다. 실온에서 어둠 속에서 하룻밤 을 치료하십시오.</li>
	<li>각각의 레이저를 가진 공초점 현미경의 밑에 심상.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜에서, 우리는 PKH 염료와 sEV의 라벨링과 척수에 그들의 섭취량의 시각화를 보여주었습니다. PKH 리포필릭 형광염은 세포측정 및형광 현미경검사3,5,6,12,24,25를유동하여 세포 라벨링에 널리 사용된다. 상대적으로 긴 반감기 와 낮은 세포 독성으로 인해, PKH 염료는 생체 내 및 체외 세포 추적 연구26,27의넓은 범위에 사용될 수 있다. 우수한 막 보존 및 생화학적 안정성이 유리하지만, sEV로 정제된 지단백질 오염물질을 ...

작은 세포 외 소포 (sEV)는 나노 크기, 50-150 nm의 크기 범위와 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 다중 vesicular 바디 (MVBs)에서 유래하고 플라즈마 막과 MVB의 융합에 세포에서 풀어 놓입니다. sEV는 miRNAs, mRNA, 단백질 및 생리활성 지질을 포함하고, 이 분자는 세포 간 세포 통신의 형태로 세포 사이 옮겨질 것입니다. sEV는 다양한 내막 경로에 의해 수신자 세포에 의해 내부화될 수 있으며, 수신자 세포에 의한 sEV의 이러한 포획은 EV와 표적 세포1모두에 대한 표면 분자의 인식에 의해 중재된다.
sEV는 수용체 세포의 분자 및 현상 변화를 유발할 수 있는 능력, 치료제로서의 유용성, 화물 분자 또는 약리학제의 운반선으로서의 잠재력으로 인해 관심을 얻고 있습니다. 그들의 작은 크기 때문에, sEV의 화상 진찰 및 추적은 특히 생체 내 연구 및 임상 설정에 도전적일 수 있습니다. 따라서 생체 내 및 생체 내 및 생체 내 추적을 지원하기 위해 라벨 및 이미지 sEV를 표시하고 이미지 sEV를개발하는 많은 방법이 개발되었다.
sEV 생체 분포및 표적 세포 상호 작용을 연구하는 가장 일반적인 기술은 형광염염료 분자3,4,5,6,7로라벨을 붙이는 것을 포함한다. 전기 는 처음에 일반적으로 이미지 세포에 사용 된 세포막 염료로 표시 되었다. 이 형광 염료는 일반적으로 sEV에 관심있는 지질 이중 층 또는 단백질을 얼룩. 몇몇 지방성 염료는 디르 (1,1′-디옥타데딜-3,3,3′,3′-테트라메틸린도트리카르보시아노니 오오드), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-테트라메틸 인도카르보시아닌 과염소산염), 및 DiD (1, 1′-디옥타데킬-3, 3, 3′, 3′, 3′-테트라메틸 인도카르보시야닌 4-클로로벤젠술포네이트 소금)8,9,101.
PKH67 및 PKH26과 같은 다른 지방성 염료는, 고형성 극지 헤드 그룹과 어떤 지질 구조로 쉽게 상호 작용하고 장기 염료 보존 및 안정적인 형광12로이어지는 긴 알리파성 탄화수소 꼬리를 갖는다. PKH 염료는 또한 EV 라벨을 지정할 수 있으며, 이는 생체 내에서EV 속성의 연구를 할 수 있습니다13. 다른 많은 염료는 형광 현미경 검사법과 유동 세포종을 사용하여 외종을 관찰하는 데 사용되어 왔으며, 여기에는 지질 라벨염료14 및 카박스시플루오레세인 디아세테이트 succinimidyl ester(CFDA-SE)15,16 및 칼세옥 아세틸(AM)
CNS에 있는 다른 세포 사이 sEV 매개 한 교차토크의 연구 결과는 신경 염증성 및 신경 퇴행성 질환의 병인에 중요한 통찰력을 제공했다18. 예를 들어, 뉴런으로부터의 sEV는 베타 아밀로이드 펩타이드와 인광타우 단백질을 퍼뜨리고알츠하이머병(19)의발병에 도움을 주어 질 수 있다. 추가적으로, 적혈구에서 파생된 전기는 많은 양의 알파-시뉴클레인을 함유하고 있으며 혈액-뇌 장벽을 넘어파킨슨병증(20)에기여할 수 있다. sEV의 능력은 생리적 장벽을교차하고 표적 세포에 자신의 생체 분자를 전송하는 그들에게 CNS22에치료 약물을 전달하는 편리한 도구를 만든다.
척수에 있는 무수한 CNS 세포에 의하여 sEV upup를 시각화하는 것은 기계학 연구 및 각종 세포 근원에서 외인성 관리한 sEV의 치료 이득의 평가를 둘 다 가능하게 할 것입니다. 이 논문은 대식세포에서 파생된 sEV를 라벨로 지정하고 생체외에서 의 기생을 이미지하고 뉴런, 마이크로글리아 및 성상세포에 의해 요추 척수에서 생체내로 분류하여 시각화에 의한 sEV 전달을 질적으로 확인하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 원심 필터</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alix 항체</td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Calnexin 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD81 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)</td><td>Cell Signaling 기술</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>항 아교 섬유 산성 단백질 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>1:500 for IF; 1:1000 IHC</td></tr><tr><td>Anti-IBA1 항체</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Anti-MAP2A 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기, 40 &mu; m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12,000 x g</td></tr><tr><td>커버슬립, 12-mm, #1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립, 18-mm, #1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>DC 단백질 분석</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNAse I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 IgG H& L (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 IgG H & L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>이중 젖빛 현미경 슬라이드, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 칼슘 및 마그네슘 없음</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>엑소좀 고갈 소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>FluorChem M 이미징 시스템</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 컨포칼 현미경</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG1, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HRP Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>차단 버퍼, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS 샘플 버퍼</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 시스템</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 3.2 소프트웨어</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuro-2a 세포주</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>시그마-알드리치</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>시그마-알드리치</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Transfer Membrane</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 세포주</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 버퍼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-188-48</td><td>접착 슬라이드</td></tr><tr><td>T-75 플라스크</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 디지털 전송 전자 현미경</td><td>FEI Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Grids</td><td>전자 현미경 과학</td><td>FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine 단백질 젤, 12%</td><td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS Running Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Transfer Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td>세포 <td>해리 효소</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25%</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>110,000 x g</td></tr></tbody></table>

체외 및 척수에서 형광 라벨 작은 세포 외 소포의 섭취

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

작은 세포 외 소포 (sEV)는 모든 세포에 의해 분비되고 체액에 존재하는 50-150 nm 소포입니다. sEV는 RNA, 단백질 및 지질과 같은 생체 분자를 기증자에서 수용세포로 이송하여 세포 간의 주요 신호 중재자를 만듭니다. 중추 신경계 (CNS)에서 sEV는 신경 면역 상호 작용을 포함하여 세포 간 신호를 중재 할 수 있습니다. sEV 기능은 생체외 및 생체 내 모두 받는 사람 세포에서 표지된 sEV의 섭취량을 추적하여 연구할 수 있다. 이 논문은 PKH 멤브레인 염료를 사용하여 RAW 264.7 대식세포의 조건부 매체로부터 sEV의 라벨링을 설명합니다. 그것은 신경-2a 세포와 시험관내1 차 성상세포에 의해 여러 시간 지점에서 표지된 sEV의 다른 농도의 uptakes를 보여줍니다. 또한 마우스 척수 뉴런, 성상세포 및 공초점 현미경 검사법에 의해 시각화된 미세glia에서 내trathecally를 전달한 sEV의 섭취도 표시됩니다. 대표적인 결과는 척수로 성공적인 sEV 납품을 확인하는 것을 도울 수 있는 다른 세포에 의하여 sEV의 uptake에 있는 시간 의존적인 변이를 보여줍니다.

원심분리를 통해 RAW 264.7 컨디셔닝 된 매체로부터 sEV를 분리한 후, NTA는 정제된 세프의 농도 및 크기 분포를 결정하는 데 사용되었다. RAW 264.7 유래 sEV의 평균 평균 크기는 140nm이고 피크 입자 크기는 121.8nm였으며, 빛 산란 측정에서 대부분의 검출 가능한 입자가 50-150 nm(그림1A)에서엑소좀 또는 sEV의 크기 범위 내에 떨어졌는 것을 확인하였다. 세포 외 소포 2018 (MISEV2018)23의연구를위한 최소한의 정보에서 제안 된 바와 같이, 우리는 뚜렷한 EV 인구에서 존재하거나 제외되어야하는 단백질 세트를 분석했습니다. sEV, 세포 용해 및 엑소 고갈 된 매체의 서양 블로팅은 sEV 유래 단백질 샘플에 sEV 마커 단백질 Alix, CD81 및 GAPDH가 포함되어 있음을 입증했습니다. 세포 리자테 분획은 sEV에 없는 내과성 망상 상주 단백질, calnexin으로 풍부하게 되었다. ...

우리는 PKH 염료로 대식세포 유래 작은 세포외 소포를 라벨과 시험관 내 및 척수에서 그들의 upup을 관찰하는 프로토콜을 기술합니다.

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

척수의 다른 세포에 의해 sEV라고도 하는 작은 세포 외 소포의 섭취를 시각화하면 sEV의 성공적인 전달을 확인할 수 있습니다. 이를 통해 로덴 모델의 다양한 소스에서 내trathecally 투여 된 sEV의 기계론 적 및 치료 연구를 가능하게합니다. 이 프로토콜은 온화한 척수에 있는 세포에 의하여 sEV upup를 구상하는 것을 이용할 수 있고, 척추 무질서, 고통 및 염증에 있는 sEV 및 그것의 화물 분자의 역할을 평가하는 것을 도울 수 있습니다.이 절차는 저와 함께 시나 아지트 박사의 연구실에서 두 대학원생인 슈안 루오(Xuan Luo)와 함께 제일 준 주청 린(Xuan Luo)이 시연할 것입니다. 12 개의 웰 플레이트에 18 mm 커버 슬립을 배치한 다음 10 %의 FBS 및 1 % 펜 스트렙을 포함하는 완전한 DMEM의 총 1 밀리리터로 각 우물의 신경 -2a 세포를 플레이트합니다. 세포 수 유창성이 80~ 90%에 도달하면 매매체를 DMEM 엑소솜 고갈된 배지로 변경하여 각각 1, 5 또는 10 마이크로그램의 라벨이 부착된 sEV를 추가합니다.1, 4 및 24 시간 동안. 주사제 제어의 동일한 볼륨에서 우물의 나머지 부분에 복용량 및 시간 의존 섭취량에 대 한. 60mm에서 산후 새끼의 두뇌를 수집, 얼음 차가운 행크스 균형 소금 용액을 포함하는 페트리 접시 10 밀리몰라 헤페로 보충, 피질 엽을 모두 해부하고 수막을 제거.그런 다음 멸균 된 블레이드로 조직을 다진다. 페판 또는 데옥시리보뉴클레우스를 함유한 15밀리리터 원뿔형 튜브로 조직을 옮기고 37도에서 20분 동안 배양하고, 5분마다 튜브를 소용돌이치며, 체퍼를 흡인하고, 완전한 DMEM 5 밀리리터를 튜브에 추가한다. 효소 활성을 비활성화하려면 5 밀리리터 유리 세로지컬 파이펫과 화염 연마 목초지 파이펫으로 조직을 분리하기 위해 신중하게 평가하십시오.40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과한 다음, 섭씨 4도에서 5분 동안 250회 G로 세포를 원심분리하고, 배지를 흡인하고, 75 평방 센티미터 플라스크에서 완전한 DMEM의 10 밀리리터에서 세포를 볼 수 있습니다. 4시간 의 도금 후, 신선한 DMEM 배지의 15 밀리리터로 슈퍼네이트와 매체를 교체하십시오. 마이크로글리아와 올리고드렌드로키테를 분리하기 위해 14일 간 시험관에서 플라스크를 궤도 셰이커로 6시간 동안 320 RPM으로 옮는다.섭씨 37도에서 10분 동안 세포 해리 효소 5밀리리터를 사용하십시오. 트립시인화하려면, 나머지 성상세포는 효소 작용을 비활성화하고 완전한 DMEM의 5 밀리리터를 추가한 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 250배 G로 세포를 펠릿합니다. 완전한 DMEM에서 세포를 다시 중단하고 24 웰 플레이트에서 12 밀리미터 번호 1.5 커버 슬립에 세포를 참조하십시오.PBS를 사용하여 세포를 3번 헹구고 실온에서 10분 동안 PBS에서 4%의 포름알데히드 또는 PFA로 고정합니다. 고정 된 세포를 PBS로 5 분 동안 3 번 세척하고 PBS에서 0.1 % Triton X 100을 사용하여 10 ~ 15 분 동안 과미를 처리하십시오. 그런 다음 PBS로 세동을 반복합니다.실온에서 1시간 동안 PBS에서 5%의 정상 염소 혈청 또는 NGS를 사용하여 세포를 차단하고, 신경-2a 세포를 맵 양방향 항체와 GFAP 항체로 1~500비율로 1-500비율로 배양하여 신선 5%NGS 또는 PBS를 4°C에서 4°C. PBS에서 세포를 3회 세척한 후, 5%NGS에 플루오로포레 컨쥬게이드 이차 항체를 첨가한다. 로커의 빛으로부터 보호되는 실온에서 2시간 동안 배양하세요.PBS로 세척을 반복하고 실온에서 10 분 동안 DAPI밀리리터 당 1 마이크로 그램으로 세포를 배양하십시오. 다시 한번, PBS로 세포를 3 번 씻으십시오. 안티 페이드 장착 매체를 사용하여, 1 번 슬라이드에 커버 슬립을 장착, 그들은 어둠 속에서 하룻밤 건조하고 공초점 현미경에 이미징 때까지 섭씨 4도에서 준비 된 유리 슬라이드를 저장합니다.척수를 해부하고 24 시간 동안 섭씨 4도에서 PBS에서 4 % PFA로 수정하십시오. 이전에는 PBS에서 30%의 자당에서 24시간 동안 또는 조직이 침몰할 때까지 조직을 섭씨 4도까지 보관한 다음, 면역작용까지 조직을 섭씨 4도에 보관하고, 10월 화합물에 L4 L5 척수를 침범한 다음, 완전히 고화될 때까지 드라이 아이스에 동결한다. 30 마이크로미터에서 조직을 절개하기 위해 극저온을 사용하고 PBS를 포함하는 24 개의 웰 플레이트에서 섹션을 수집합니다.PBS에서 0.3%트리톤으로 5분간 섹션을 3회 세척하고 실온에서 2시간 동안 5%MGS를 사용하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 셰이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 섹션을 배양하십시오. Pbs에서 0.3 %의 트리톤으로 5 분 동안 섹션을 3 번 씻으시면하십시오.그런 다음 이차 항체의 적절한 농도를 추가합니다. 텍스트 원고에 따르면 실온에서 2 시간 동안 배양하고 PBS만 사용하여 섹션을 세척하고 실온에서 10 분 동안 DAPI 밀리리터 당 1 마이크로 그램으로 배양하십시오. 그런 다음 가벼운 현미경으로 PBS 세싱을 반복하고 미세 페인트 브러시로 명확한 접착제 슬라이드에 섹션을 장착합니다.커버 슬립을 실온에서 밤새 마운팅 매체로 적시시키고, 각각의 레이저로 공초점 현미경으로 심상을 획득하고, 평균 평균 크기RA 2 6 4 0.7 유래 sEV는 140 나노미터이고 피크 입자 크기는 121.8 나노미터였다. 가장 검출 가능한 입자가 엑소좀 또는 sEVS의 크기 범위 내에 떨어지면 됩니다. 50 내지 150 나노미터에서, sEV, 세포 Lysate 및 외래 매체의 서쪽 블로팅은 sEV 파생 단백질 샘플이 sEV 마커 단백질 Alix CD81 및 GAPDH를 포함하고 있음을 입증했습니다.세포 용해는 내피 성 망상, 상주 단백질 칼넥신으로 농축되었기 때문에 칼넥신은 세포 오염에 대한 부정적인 마커로서 sEV에 결석했다. sEV의 섭취량은 1시간, 10마이크로그램 sEV에 대해 발생했으며, 4시간, 5, 10마이크로그램의 sEV를 4시간 동안 배양 형광을 검출할 수 있었다. 1차 성상세포에 의한 PKH 26 표지된 sEV의 섭취를 검사하고 1차 피질 성상세포에서 sEVS 섭취량으로부터 최대 형광이 발생하였고, 24시간 PKH26 표지된 sEV를 복용하여 6시간 동안 최대 형광을 관찰하고, 뉴런 성화세포 및 마이크로글리아 세포에서 최대 형광이 관찰되었다.컨트롤, 레이블이 없는 sEV 및 염료 제어가 포함되면 언바운드 염료 패치 해안의 특정 레이블 오프리 댄스로 인해 바람이 거짓 긍정 최근 신호에 대한 코드를 생성합니다. seV의 섭취는 조리법과 세포 및 조직에 생체 분자화물 전송을 조사하고 생체 분자 또는 표적 유전자의 발현 수준에 있는 변경을 결정해서 확인할 수 있습니다. sEV 전달의 기능적 영향을 조사하기 위해 행동 연구를 수행할 수도 있습니다.

uptake-fluorescent-labeled-small-extracellular-vesicles-vitro-spinal

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 뉴런이나 폴리에틸렌 흡입 피펫을 사용하여 모든의 연결을 요로에 형광등과 칼슘에 민감한 염료의 높은 농도를 도입을위한 간단하고 저렴한 비용으로 기술을 설명합니다.

신경, 책자, 그리고 형광 염료와 척수 뿌리 역행로드

이 비디오에서는 세포외 소포체 또는 EV의 세포 흡수를 시각화하고 정량화하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 컨포칼 현미경을 사용하여 3D 형광 이미징을 활용하며 내재화된 EV와 세포 표면에 부착된 EV를 구별할 수 있습니다.

Extracellular Vesicle Uptake Assay: 3D 형광 이미징 기법을 사용하여 세포외 소포의 세포 흡수를 시각화하고 정량화하는 방법

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

마우스 척수 이미징을위한 새로운 생체 준비. 이 프로토콜은 척수 걸쳐 라이브 세포 상호 작용의 두 광자 이미징을 허용한다.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

이 작품에서는, 우리는 변형 체 falciparum 감염 적혈구에 의해 발표 하는 extracellular 소포 (EVs)의 역할을 조사 하기 위해 프로토콜 설명 합니다. 특히, 우리는 내 피 세포와 EVs의 상호 작용에 초점.

말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

여기에서, 우리는 골관절염을 위한 모형으로 이용된 연골 이병 에서 그들의 이동 그리고 upup를 감시하기 위하여 혈소판 lysate 유래 세포외 소포를 레이블을 붙이는 프로토콜을 제시합니다.

연골 내의 마이그레이션 및 섭취 모니터링을 위한 세포외 소포 라벨링

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

이 동영상은 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 보여줍니다. Dissociated commissural 뉴런이 축삭의 성장과지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

배우세요 PKH 형광 염료로 라벨링한 소형 세포 외 소포(sEV)의 척수 세포 섭취 시각화 프로토콜입니다. 이 방법은 척수 장애, 통증 및 염증 연구에서 sEV의 치료적 역할을 평가하는 데 활용됩니다.

체외 및 척수에서 형광 라벨 작은 세포 외 소포의 섭취

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