Name: 질량분석 분석을 위한 최적의 절단 온도 화합물에 내장된 인체 조직의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 배우세요 OCT 화합물을 제거하여 인체 조직에서 스핑고지질을 정량 분석하는 방법을 LC-ESI-MS/MS를 활용해 생물정보고 샘플을 이용한 질량분석 연구에 적용할 수 있습니다.

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연구 프로젝트의 서비스 및 지원은 VCU Massey Cancer Center 조직 및 데이터 수집 및 분석 코어와 VCU 지질체학 및 대사체학 코어에서 제공했으며, 이는 NIH-NCI 암 센터 지원 보조금 P30CA016059의 자금으로 부분적으로 지원됩니다. 이 작업은 국립 보건원 보조금 R21CA232234 (산티아고 리마)의 지원을 받았습니다.

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OCT는 생물 저장소에 사용되는 일반적인 장기 냉동 보존제입니다. 그러나, OCT는 조직이 다양한 질량 분석 플랫폼(12,13,14,15)에 의해 분석될 때 이온 억제를 초래하거나, 샘플이 LC-ESI-MS/MS 11에 의해 분석될 때 신호의 손실을 초래할 수 있다. 동결 보존 조직의 OCT는 또한 Bradford 및 BCA11과 같은 칭량 및 단백질 정량 분석과 같은 조직 정규화 방법을 방해할 수 있습니다. 여기에서는 인간 조직에서 OCT를 제거한 후 질량 분석법으로 분석하는 자세한 프로토콜을 제시합니다. 상기 프로토콜은 폐가 아닌 다른 조직 공급원을 사용하거나, 또는 우리가 이전에 기술한 바와 같이 마우스 조직으로...

Sphingolipids는 인간 대사 및 질병 1,2에서 역할로 알려진 생리 활성 대사 산물입니다. 그들은 세포 이동, 세포 생존 및 죽음, 세포 이동, 수포 트래피킹, 세포 침윤 및 전이, 혈관 신생 및 사이토 카인 1,2,3,4,5,6,7,8,9 생성과 같은 복잡한 세포 과정을 조절합니다. . 스핑고지질 대사 조절의 결함은 암의 시작과 진행에 기여하고, 암이 얼마나 공격적인지, 암이 치료에 어떻게 반응하고 내성을 발달시키는지를 결정합니다3,10. 따라서 질병의 원인에 대한 이러한 광범위한 영향 때문에 질병 특이 적 스핑 고지 질 변화를 정확하게 확립 할 수있는 분석 방법이 중요한 도구입니다. 질량 분석법(MS)은 스핑고지질의 변화를 분석하는 가장 정확하고 신뢰할 수 있는 방법입니다.
스핑고지질 변화 분석에 사용할 수 있는 인간 표본은 수술실에서 전향적으로 또는 조직 생체 저장소에서 후향적으로 얻을 수 있습니다. 수술로 인한 신선한 조직은 MS 또는 다른 분석 방법으로 직접 분석 할 수 있기 때문에 유리합니다. 그러나 전향적으로 조직을 획득하는 것은 행정적, 기술적, 물류적 장애물이 있으며 통계적 검정력에 도달하기에 충분한 표본을 수집하는 것은 어려울 수 있습니다. 생물 저장소에서 조직을 얻는 것은 소급 적으로 대량으로 획득 할 수 있고 생물 저장소가 조직학 및 병리를 확인하고 표준 운영 절차를 사용하여 극저온 적으로 조직을 보존 및 저장하며 상관 분석에 사용할 수있는 임상 병리학 적 데이터를 제공 할 수 있기 때문에 유리합니다. 그러나 분자 및 구조적 특징을 보존하기 위해 생물 저장소는 조직을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 내장하여 조직을 냉동 보존할 수 있으며, 이는 데이터 정규화 분석 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량분석법(LC-ESI-MS/MS)에 의한 스핑고지질의 정량화를 방해하는 것으로 나타났습니다.11 . 또한 OCT 화합물의 주성분인 폴리비닐알코올과 폴리에틸렌글리콜이 다른 MS 분석 플랫폼12,13,14,15에서 이온 억제를 초래하는 것으로 나타났습니다. 따라서 OCT 화합물은 MS에 의한 스핑고지혈증 분석 전에 조직에서 제거되어야 합니다.
이전 보고서에서 우리는 LC-ESI-MS/MS 분석11 을 위해 인간 표본에서 OCT 화합물을 제거하기 위한 프로토콜과 데이터 정규화11을 위해 조직 칭량에 사용되는 방법론을검증했습니다. 여기에서는 스핑고지혈증성 OCT 화합물 제거 프로토콜(sOCTrP)의 단계를 자세히 설명하고 인간 폐 선암 종양 및 정상 인접 비관련 조직의 대표 데이터를 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 폴리프로필렌 피펫 팁</td><td>NA</td><td></td><td>검체 검색에 사용</td></tr><tr><td>1.5 mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Erlenmeyer 플라스크</td><td>VWR</td><td>89091-116</td><td>튜브 및 조직 계량에 사용</td></tr><tr><td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td><td>Sciex</td><td>NA</td><td>MS 데이터 분석 및 통합을 위한 소프트웨어</td></tr><tr><td>포름산암모늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11550</td><td>LC 이동상의</td></tr><tr><td>경우 분석 척도</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0.1mg까지 정확한</td></tr><tr><td>NA 저울 병 뚜껑 디스펜서</td><td>Sartorius</td><td>LH-723071</td><td>용매</td></tr><tr><td>C12-Ceramide (d18 : 1 / C12 : 0) 분배에 사용; N- (도데 카노일) - 스핑 -4- 에닌</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>LM2212</td><td>내부 표준</td></tr><tr><td>C12- 글루코실 세라미드 (d18 : 1 / 12 : 0); N-(도데카노일)-1-&베타;-글루코실-스핑-4-아인</td><td>아반티 극성 지질</td><td>LM2511</td><td>내부 표준</td></tr><tr><td>C12-락토실세라미드 (d18:1/12:0); N-(도데카노일)-1-&szlig;-lactosyl-sphing-4-ene</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2512</td><td>내부 표준</td></tr><tr><td>C12-Sphingomyelin&nbsp; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2312</td><td>내부 표준</td></tr><tr><td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td><td>VWR</td><td>EM-CX1054-1</td><td></td></tr><tr><td>ClickSeal Biocontainment Lids</td><td>Thermo Scientific</td><td>75007309</td><td>원심분리 중 생물학적 위험 에어레졸 방지</td></tr><tr><td>Conflikt</td><td>Decon Labs</td><td>4101</td><td>Decontaminant</td></tr><tr><td>CTO-20A/20AC 란 오븐</td><td>Shimadzu</td><td>NA</td><td>LC</td></tr><tr><td>d17:1-Sphingosine; &nbsp; (2S, 3R, 4E) -2- 아미노 헵타 덱 -4- 엔 -1,3- 디올</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2000</td><td>내부 표준</td></tr><tr><td>d17 : 1- 스핑 고신 -1- 포스페이트; 헵타 데카스 핑-4- 에닌 -1- 포스</td><td>페이트 Avanti Polar Lipids</td><td>LM2144</td><td>내부 표준</td></tr><tr><td>DGU20A5R 탈기 장치</td><td>Shimadzu</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>일회용 배양 튜브 13x100mm</td><td>VWR</td><td>53283-800</td><td>13x100 mm 스크류 탑 튜브</td></tr><tr><td>온수 목욕</td><td>NA</td><td>NA</td><td>하룻밤 지질 추출용</td></tr><tr><td>균질화기 150</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-167</td><td>삼중산염 조직</td></tr><tr><td>균질화기 플라스틱 일회용 발전기 프로브</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-177</td><td>균질화</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>심지를 만드는 데 사용되는 실험실 등급 조직</td></tr><tr><td>메탄올 LC-MS 등급 4L</td><td>VWR</td><td>EM-MX0486-1</td><td></td></tr><tr><td>Nexera LC-30 AD 바이너리 펌프 시스템</td><td>Shimadzu</td><td>NA</td><td>LC-MS용</td></tr><tr><td>영구 마커</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>페놀 나사산 폐쇄, Kimble Chase(일회용 배양 튜브용 캡)</td><td>VWR</td><td>89001-502</td><td>13x100mm 나사 상단 튜브 캡</td></tr><tr><td>인산염 버프 식염수</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td>세척 후 튜브에서 시료 회수</td></tr><tr><td>리피터 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>4987000118</td><td>LC-MS 내부 표준 분배</td></tr><tr><td>스크류 캡, 파란색, 빨간색 PTFE/흰색 실리콘</td><td>VWR</td><td>89239-020</td><td>자기인젝터 바이알 캡</td></tr><tr><td>ID 패치가 있는 나사산 유리 바이알</td><td>VWR</td><td>46610-724</td><td>자기인젝터 바이알</td></tr><tr><td>SIL-30AC 자기인젝터</td><td>Shimadzu</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD2030P1220</td><td>용매 건조용</td></tr><tr><td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 컬럼</td><td>Sigma Aldrich</td><td>581300-U</td><td>, LC-MS용</td></tr><tr><td>트리플 쿼드 5500+ LC-MS/MS 시스템</td><td>, Sciex</td><td>NA</td>, <td>LC-ESI-MS/MS용</td></tr><tr><td>초음파 수조</td>, <td>추출 및 건조된 지질의 균질화 및 재현탁을 위한</td> <td>Branson</td><td>모델 2800</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>NA</td><td></td><td>NA sOCTrP 및 건조 지질 재현탁용</td></tr><tr><td>VWR 배양 튜브 일회용 붕규산 유리</td><td>VWR</td><td>47729572</td><td>13x100 유리 배양 튜브</td></tr><tr><td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td><td>VWR</td><td>BDH83645.400</td><td></td></tr></tbody></table>

질량분석 분석을 위한 최적의 절단 온도 화합물에 내장된 인체 조직의 준비

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sphingolipids는 인간의 신진 대사와 질병에서 잘 확립 된 역할을하는 세포 구성 요소입니다. 질량 분석법은 스핑고지질이 질병에서 변경되었는지 여부를 결정하고 스핑고지질이 임상적으로 표적화될 수 있는지 여부를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 수술실에서 직접 조직을 획득하는 적절하게 전원이 공급되는 전향적 연구는 시간이 많이 걸리고 기술적, 물류적, 행정적으로 어려울 수 있습니다. 대조적으로, 후향적 연구는 조직 생물 저장소에서 이미 많은 수의 냉동 보존된 인간 표본을 활용할 수 있습니다. 생물 저장소에서 조직을 조달하는 다른 이점은 조직학, 병리학 및 일부 경우 임상 병리학 변수를 포함하여 조직 표본과 관련된 정보에 대한 액세스를 포함하며, 이들 모두는 지질체학 데이터와의 상관 관계를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 동결보존 및 질량분석에 사용되는 최적 절단 온도 화합물(OCT)의 비호환성과 관련된 기술적 한계는 지질 분석의 기술적 장벽입니다. 그러나 우리는 이전에 OCT가 스핑고지질 함량을 변경하지 않고 세척 및 원심분리의 주기를 통해 인간 생물 저장소 표본에서 쉽게 제거될 수 있음을 보여주었습니다. 우리는 또한 이전에 OCT에서 동결 보존 된 인간 조직의 스핑 고지 질이 최대 16 년 동안 안정적이라는 것을 확립했습니다. 이 보고서에서는 조직 세척, 데이터 정규화를 위한 조직 칭량, 지질 추출, 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량분석법(LC-ESI-MS/MS)으로 분석할 샘플 준비, 질량분석법 데이터 통합, 데이터 정규화 및 데이터 분석을 포함하여 OCT에 내장된 인체 조직 표본에서 스핑고지질을 분석하는 단계와 워크플로를 간략하게 설명합니다.

이 프로토콜에서는 냉동 보존된 인간 조직에서 OCT를 제거하고 LC-ESI-MS/MS로 분석하기 위해 조직의 무게를 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 절차에 필요한 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다. 도 1 에 도시된 것은 10개의 인간 폐 선암 종양과 10개의 정상 인접 조직을 세척하여 OCT를 제거하고 LC-ESI-MS/MS로 분석한 전형적인 실험의 결과이다. 중요하게도, 우리가 이전에11을 보았듯이, 폐 선암 종양에서 정상 인접 비관련 조직과 비교하여 유의하게 상승하는 다양한 사슬 길이의 세라마이드(그림 1A) 및 모노헥소실-세라마이드(그림 1B)가 있다.
섹션 4에 요약된 지질 추출 단계에 대한 OCT의 효과를 평가하기 위한 대조군 실...

스핑 고지 질은 인간 질병에서 잘 확립 된 역할을 가진 생리 활성 대사 산물입니다. 질량 분석법으로 조직의 변화를 특성화하면 질병 병인학에서 역할을 밝히거나 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 그러나 생물 저장소에서 냉동 보존에 사용되는 OCT 화합물은 질량 분석을 방해합니다. OCT에 내장된 인간 조직의 스핑고지질을 LC-ESI-MS/MS로 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT는 질량 분석과 호환되지 않는 저온 보존제입니다. 이 프로토콜을 사용하여 연구원들은 조직에서 OCT를 제거하고 탠덤 액체 크로마토그래피 질량분석법으로 스핑고지질을 정량화할 수 있습니다. 조직 건조 심지, 조직 세척 및 조직 칭량의 준비는 버지니아 커먼 웰스 대학의 April Boyd가 시연하고 지질 추출은 버지니아 커먼 웰스 대사체학 및 지질체학 코어의 책임자 인 Jeremy Allegood 박사가 시연합니다.시작하려면 수술 용 가위를 메탄올에 5 분 동안 담가 닦은 다음 깨끗한 실험실 등급 티슈로 닦으십시오. 파우더가 없는 장갑을 사용하여 실험실 등급 티슈의 끝을 빙글빙글 돌려 30-40mm 길이의 미세하게 가늘어진 심지를 만듭니다. 그런 다음 메탄올로 청소 한 가위를 사용하여 두꺼운 끝 부분의 심지를 자르고 깨끗한 판지 상자에 넣으십시오.다음으로, 메탄올 세척 가위를 사용하여 1 밀리리터 피펫 팁의 끝에서 4-5 밀리미터를 자르고 팁을 팁 홀더에 다시 놓습니다. 조직에서 OCT를 씻어 내려면 인간의 폐 조직이 들어있는 각 튜브에 얼음처럼 차가운 초순수 탈 이온수 10 밀리리터를 넣고 단단히 덮으십시오. 튜브를 10 분 동안 배양하십시오.튜브 또는 조직 펠릿의 벽에 침착된 모든 조직이 완전히 재부유될 때까지 각 튜브를 격렬하게 소용돌이합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10 분 동안 4, 000에서 5, 000 배 G에서 사전 냉각 된 스윙 버킷 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리합니다. 원심분리가 완료되면 얼음 위의 튜브의 뚜껑을 풉니다.세척 용액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 0.5 밀리리터의 상청액을 남긴 다음 튜브를 다시 덮습니다. 모든 튜브에서 상청액을 제거한 후 동일한 방법으로 조직을 두 번 더 씻으십시오. 세 번의 OCT 제거 세척 후 준비된 단축 피펫 팁을 사용하여 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 튜브에 추가합니다.동일한 팁을 사용하여 펠릿을 부드럽게 재현탁하고 재현 된 모든 조직을 사전 라벨링되고 사전 무게가 측정 된 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 모든 조직 샘플이 옮겨 질 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 사전 냉각된 원심분리기에서 튜브를 원심분리하여 조직을 펠릿화한 다음 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 PBS를 조심스럽게 흡입하고 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다.앞서 준비한 티슈 건조 심지를 사용하여 남아 있는 세척액을 부드럽게 제거한 다음 튜브를 닫고

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