소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 생체 내 출생 후 전기천공법 활용
2021년 6월 9일
여기에서 우리는 출생 후 뇌 발달 과정에서 마우스 소뇌에서 과립 뉴런의 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다.이 세포는 시냅스 구조를 개선하고 시냅스를 형성하여 전체 뇌 회로에 통합됩니다.
이 프로토콜은 주요 형태학적 성장을 시각화하기 위해 다양한 발달 단계에 걸쳐 소뇌 과립 뉴런을 연구합니다. 이 기술의 장점으로는 세포 특이적 표적화, 형질주입된 구조체의 빠른 발현, 세포 자율 효과 연구를 가능하게 하는 세포의 희소 라벨링이 있습니다. 로딩 피펫 팁에서 11.2mm 세그먼트를 절단하는 것으로 시작하여 절단 부분을 해밀턴 주사기 끝 부분에 스페이서로 배치하여 주입 깊이를 1.5mm로 제한합니다.
주사기 팁의 스페이서를 접착제 또는 파라필름으로 고정합니다. 실험 강아지의 시상 뇌 섹션에서 단일 전기천공된 CGN의 형태를 연구하려면 컨포칼 현미경에서 스택당 0.5마이크로미터의 Z 스택 이미지를 촬영합니다. 이미지 창당 하나의 셀을 이미지화하여 이미지 분석 및 3D 재구성이 용이합니다.
간단한 신경돌기 추적자를 사용하여 맹검 방식으로 신경돌기 길이와 수지상 발톱 형성을 분석합니다. 전기천공된 CGN의 단일 채널 Z 스택 이미지를 피지에 업로드하고 플러그인"세그멘테이션"및 Simple Neurite Tracer"드롭다운 메뉴에서 새 3D 뷰어 만들기"를 선택합니다. 셀 소마에 연결되는 수상 돌기의 바닥으로 스크롤하고 접합부를 클릭하여 경로를 시작하십시오.
셀 채우기 신호가 가장 밝은 섹션을 클릭하고 Y를 눌러 추적을 유지하여 경로를 수동으로 추적합니다. 수상 돌기의 끝까지 추적하고 F를 눌러 경로를 확인하십시오. 다음으로, 구조물의 바닥에서 가장 긴 중성암의 끝까지 발톱을 추적합니다.
Windows에서 Control을 누르거나 macOS에서 ALT를 누른 상태에서 경로를 클릭하여 2차 및 3차 분기를 추적합니다. F.Observe trace에 대한 측정값이 별도의 창에 표시되는지 확인하여 경로를 확인합니다. 발톱 가지의 모든 크기를 더하여 각 발톱의 전체 길이를 구합니다.
대표적인 분석에서, 주입 후 3일에서 14일 사이에 전기천공된 CGN의 투영 이미지는 수상돌기 수의 점진적인 감소를 보여주었습니다. CGN은 수지상 성장 단계를 거친 후 3DPI에서 7DPI로 개선되어 초과 수상돌기의 50% 이상이 가지치기되었습니다. 이 사건은 각 수상 돌기의 끝에 발톱과 같은 구조가 형성되는 나머지 아버가 점진적으로 길어지는 것과 일치하며, 이는 이러한 발달 과정이 동시에 일어나고 있음을 나타냅니다.
7 DPI에 의해, 발톱은 약 75 %수상 돌기의. 표지된 각 CGN은 총 체성-수지상 표면적 및 부피를 정량화하기 위해 NMRS에서 재구성되었습니다. 개발 전반에 걸쳐 CGN 크기의 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.
7DPI에서 CGN은 3, 5 및 10 DPI에 비해 볼륨이 크게 20% 감소했습니다. 시술에서 가장 중요한 것은 주사 전에 소뇌를 정확하게 찾는 것입니다. 이 방법은 shRNA, siRNA 또는 Cre Recombinase의 형질감염에 의해 과립 뉴런 발달에서 그들의 역할을 연구하기 위해 생체 내에서 유전자를 유전적으로 조작하는 데 적용할 수 있습니다.
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개요
본 논문은 생체 내 전기천공법(in vivo electroporation)을 이용하여 발달 중인 마우스 소뇌 내 소뇌 과립세포(CGNs)의 형태학적 발달을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 CGNs의 희소 표지 및 유전적 조작을 가능하게 하여, 주요 발달 단계 동안의 수지상 돌기 성장, 클로(claw) 형성 및 시냅스 형성 과정을 상세히 분석할 수 있도록 합니다. 이 방법은 정밀한 주입, 공초점 이미징 및 정량적 형태 측정 분석을 결합하여 시간에 따른 CGN의 성숙 과정을 추적합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 발생생물학
- 세포생물학
배경
- 뉴런은 뇌 발달 과정에서 상당한 구조적 및 기능적 변화를 겪습니다.
- 설치류의 소뇌는 단일 세포 형태 형성, 특히 CGN의 형태 형성을 연구하기 위한 모델 시스템입니다.
- CGN은 시냅스 입력에 필수적인 특수한 수지상 돌기 클로(dendritic claws)를 형성합니다.
- 전통적인 표지 방법은 세포 특이성이나 시간적 해상도가 부족한 경우가 많습니다.
연구 목적
- 생체 내(in vivo)에서 개별 CGN의 형태학적 발달을 시각화하고 정량화한다.
- 발달 단계별로 수지상 돌기의 성장, 가지치기 및 claw 형성을 추적한다.
- CGN의 세포 자율적 유전적 조작을 위한 플랫폼을 제공한다.
사용된 방법
- 발달 중인 생쥐 소뇌 내 과립 신경세포 전구세포의 생체 내 전기천공법(In vivo electroporation).
- 명확한 형태학적 분석을 위한 CGN의 희소 표지(Sparse labeling).
- 3D 재구성을 위한 Z-스택 이미징 기반 공초점 현미경 관찰.
- Fiji 및 Simple Neurite Tracer를 이용한 신경 돌기 길이 및 수지상 발톱(dendritic claw) 구조의 수동 추적 및 정량화.
주요 결과
- 주입 후 3일에서 14일(DPI) 사이의 투영 이미지를 통해 CGN당 수상돌기 수가 점진적으로 감소하는 것이 확인되었습니다.
- 3~7 DPI 사이에 CGN의 수상돌기 가지치기가 진행되어, 과잉 수상돌기의 50% 이상이 제거되었습니다.
- 남아 있는 수상돌기 끝단에 갈퀴 모양의 구조가 형성되었으며, 7 DPI까지 수상돌기의 약 75%에서 갈퀴가 관찰되었습니다.
- CGN의 크기는 대체로 일정하게 유지되었으나, 다른 시점과 비교하여 7 DPI에서 부피가 20% 유의하게 감소한 것이 관찰되었습니다.
결론
- 본 프로토콜을 통해 생체 내 CGN의 형태학적 발달에 대한 상세한 세포 특이적 분석이 가능합니다.
- 수지상 돌기 가지치기와 클로(claw) 형성은 CGN 성숙 과정에서 동시에 일어나는 프로세스입니다.
- 본 방법은 유전자 조작에 적용 가능하여 CGN 발달 과정에서의 유전자 기능을 연구하는 데 유용합니다.
자주 묻는 질문
산업계 관련성 요약
소뇌 과립세포(CGN)의 형태 및 시냅스 발달에 대한 정량적 생체 내(in vivo) 분석은 신경 발달 표적 검증의 예측 신뢰도를 높이기 위한 필수적인 요구 사항입니다. 희소 표지 및 유전자 조작 기능은 중추신경계(CNS) 발견의 초기 단계에서 기전적 리스크를 감소시킵니다. 이러한 접근 방식은 세포 형태 형성(morphogenesis)을 시냅스 통합과 연결함으로써 중개 연구의 연속성을 지원하며, 신경생물학 중심의 R&D 포트폴리오 결정에 기초 자료를 제공합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- CGN 형태 형성 및 시냅스 형성에서 유전자 기능의 직접적인 조사를 가능하게 합니다.
- in vivo에서 세포 자율적 효과를 분리함으로써 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
- 가설 기반의 타겟 검증을 위한 정량적 판독 값을 제공합니다.
- 형태학적 및 시냅스 표현형을 기반으로 신경 발달 타겟의 우선순위 선별을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 신경세포 형태학을 위한 검증되고 재현 가능한 이미징 및 분석 워크플로우를 구축합니다.
- 후속 스크리닝을 위해 수상돌기 수, claw 형성 및 신경돌기 길이와 같은 정량적 지표를 제공합니다.
- 블라인드 처리된 소프트웨어 지원 형태계측 분석을 통해 어세이 표준화를 가능하게 합니다.
- CNS 파이프라인의 화합물 또는 유전자 스크리닝을 위한 견고한 생물학적 시스템을 준비합니다.
중개 및 전임상 연구
- 설치류 모델에서 형태학적 표현형을 질병 관련 시냅스 발달과 일치시킵니다.
- 초기 발견부터 신경발달 중재의 전임상 검증까지의 연속성을 지원합니다.
- 시냅스 성숙의 중개 바이오마커를 평가하기 위한 플랫폼을 제공합니다.
- 세포 변화를 기능적 시냅스 결과와 연결함으로써 개발 리스크를 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 CNS 연구의 초기 발견부터 리드 화합물 식별까지를 통합하여, 유전적 또는 약리학적 개입에 대한 반복적인 가설 검증과 정량적 표현형 분석을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 신경세포 형태 형성 및 시냅스 형성에 관여하는 유전자 기능의 귀무 가설 검정을 지원합니다.
- 스크리닝: 수지상 돌기 및 시냅스 구조 분석을 위한 재현 가능하고 정량적인 결과물을 제공합니다.
- 분석: 소프트웨어 지원을 통한 신경돌기 길이, 수지상 돌기 갈래 및 세포 부피의 블라인드 측정을 제공합니다.
- 중개 연구: 세포 표현형과 in vivo의 질환 관련 시냅스 발달 사이의 가교 역할을 합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 발견 프로그램 전반에 걸쳐 다양한 유전자 조작 및 중추신경계(CNS) 모델 시스템에 적용 가능합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 신경발달 표적 검증 및 메커니즘 위험 완화에 대한 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 재현성과 확장성을 위해 in vivo 이미징 및 형태측정학적 분석을 표준화합니다.
- 전략적 가치: 유전자 섭동과 정량화 가능한 신경세포 표현형을 연결함으로써 go/no-go 결정에 필요한 정보를 제공합니다.
- 포트폴리오 영향: 강력한 in vivo 데이터를 기반으로 CNS 표적의 위험 조정 우선순위 결정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 설치류 신경해부학 및 정밀한 정위 주입 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 공초점 현미경 및 고급 이미지 분석 소프트웨어(예: Fiji, Simple Neurite Tracer)의 사용 권한이 요구됩니다.
- 눈가림 분석 및 데이터 해석을 위해 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 세포 자율적 연구를 위해 다양한 유전적 구성물(shRNA, siRNA, Cre Recombinase)에 맞게 조정 가능합니다.
- 재현 가능한 결과를 얻기 위해서는 주입 정확도와 세포 표지 효율이 매우 중요합니다.
