Name: 인간 1차 출처에서 인간 MK의 면역페노티핑 및 세포 분류 또는 헤마토포이틱 전조자로부터 시험관내 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 30 s
Description: 배우세요 인간 거대핵구 분화 단계의 면역페노타이핑 및 유세포 분석 방법을. 유세포 분류를 통해 다배체 상태의 거대핵구를 식별하고 정제하여 혈액학 연구에 활용할 수 있습니다.

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마르코스 페레즈 바스테레헤아, 로레나 로드리게스 로렌조, 베고냐 가르시아 멘데스(HUCA) 및 팔로마 세레조, 알무데나 파에로, 마리아 데 라 포베다 콜로모(HCSC)에 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 의학 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (로슈 SP200221001) A.B., RYC 펠로우십 (RYC-2013-12587; 장관 드 Economía y 경쟁, 스페인) 및 I + D 2017 교부금 (SAF2017-85489-P; 장관 드 시엔시아, 이노바시온 y 유니버시다데스, 스페인 과 폰도스 페더) L.G., 세베로 오초아 그랜트 (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades 델 Principado de Asturias, 스페인.M) 및 교내 박사 후 보조금 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, 오비에도, 스페인) A.A.H. 우리는 자신의 지식 (및 시간), 특히 멀티 컬러 태그 항체 패널 믹스와 단일 색상 비드 제어 준비에 대한 그의 현명한 조언을 공유 레이니어 반 데르 린덴 감사합니다.

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시청각 재료 생산은 BD 바이오 사이언스에 의해 지원되었다.

유동 세포측정에 의한 메가카요포에이시스 연구에 초점을 맞춘 대부분의 연구는 현재까지 계보 별 표면마커(즉,CD42A/CD42B, CD41/CD61)만을 사용하여 MK 서브세트의 식별에 국한된 반면, 이전의 MK 분화 단계는 제대로 조사되지 않았습니다. 본 기사에서는 인간 메가카요포이시스의 포괄적인 유동 세포측정 특성화를 해결하기 위한 면역페노티핑 전략을 보여줍니다. 전반적으로, 우리는 보다 상세한 방법으로 메가카요포이시스연구를 위한 동일한 유동 세포측정 항체 패널에서 MK 특이적 및 비특이적 표면 마커(표 1 및 2)를 결합하는 실용성을 강조하고자 한다. 우리의 새로운 접근은 혈액학 무질서에 있는 진단 및/또는 예후를 돕기 위하여 강력한 공구역할을 할 수 있었습니다. 우리는 제시 된 패널과 조합이 확정적이지 않다고 생각한다. 우리는 또한 하위 병리학에 의존하는 인간 1 차적인 근원 (주로 BM 견본에서)에 있는 표면 마커의 아주 역동적인 행동을 관찰했습니다. 더 많은 연구가 필요하고, 바라건대, 과학 적인 사회는...

메가카요세포(MKs)는 조혈줄기세포(HSC)로부터 개발되어 호르몬 혈전포이에틴(TPO)에 의해 주로 오케스트레이션되는 메가카요포이에이시스(megakaryopoiesis)라는 복잡한 과정을 거쳐 개발한다. 메가카요포이시스의 고전적인 견해는 HSC에서 부터 헌신적인 선조및 전구체 세포의 계층적 단계를 통해 세포 여행을 설명하며 궁극적으로 성숙한 MK로 이어집니다. 성숙 하는 동안, MKs 는 여러 차례의 내시경증을 경험하고, 혈소판 생산을 위한 충분한 멤브레인 표면을 제공하는 복잡한 세포내 경계 막 시스템(DMS)을 개발하고, 성숙한 혈소판1,2,3에의해 상속되는 다양한 과립에 포함된 과다를 효율적으로 생산하고 포장한다. 그 결과, 성숙한 MK는 고다형성 핵(심지어 >64N에 도달)을 특징으로 하는 큰 세포(40-60 μm)이다. 최근 연구에 따르면 HSC가 특정 물리 병리학적조건에 대한 응답으로 전통적인 혈통 약정 체크 포인트를 우회하는 MK로 분화하는 대체 경로를제안4,5,6,7,9,10,11. 이러한 사실 인정은 성숙한 MK를 향한 조혈 분화가 생물학 필요에 반응하는 연속체 및 적응 프로세스이다는 것을 강조합니다.
세포 생물학 및 메가카요포에이시스(12)를 특징짓는 분자 양상에 대한 지식이 증가함에 따라, 유동 세포측정에 의한 공정 연구에 전념하는 대부분의 연구는 계보별 표면 마커(즉, CD42A/B, CD41/CD61)를 이용한 성숙한 MK의 식별으로 제한되며, MK의 초기 상이한 단계는 아직 밝혀지지 않았다. 앞서 마우스골수와 골수 유래 MK배양13,14로메가카요포이스를 무대에 올리는 전략을 문서화하여인간15에적용했다. 본 기사에서는 HSC에서 성숙한 MK에 이르기까지, 인간 원(골수-BM 및 말초 혈액-PB-) 또는 MK 특이적 표면 마커(CD61, CD42B, CD4B, CD4B, CD4B) 및 CD4B9, CD4B1 을 통합하는 패널을 사용하여 체외 배양에 이르기까지 메가karyopoiesis의 특성화를 허용하는 면역페노티핑 전략을 보여줍니다. 큰 크기와 취약성에도 불구하고, MK는 전술한 세포 표면 마커를 사용하여 면역페노타입이 될 수 있으며, 세포 파열 및/또는 손상을 최소화하기 위해 특정 압력 및 노즐 직경의 특정 조건하에서 형광 활성화 셀 분류에 의해 농축될 수 있다. 이 기술은 인간의 건강과 질병에 있는 거대 karyopoiesis 및 혈소판 생산의 복잡성을 더 잘 이해하기 위하여 목적으로, 다중 Omics 접근을 촉진합니다. 주목할만한, 그것은 증가하는 수요의 임상 맥락에서 진단과 예후를 돕기 위하여 유용한 공구로 포즈를 취합니다.
이 원고에서 우리는 기본 소스에서 MK 특이적이고 비특이적 표면 마커를 통합하거나 시험관 내에서생성되는 패널로 인간 메가카요포이스를 무대에 올리는 전략을 문서화합니다. 또한, 형광 활성화 셀 선별기, 바람직한 분획 및 성숙한 MK(도1)를사용하여 분류하는 프로토콜을 제공합니다. 이 단계는 MK의 큰 크기와 취약성으로 인해 기술적으로 어렵기 때문에 인기가 없습니다. 그러나, 마우스와 인간 골수 샘플에서 이전에 사용되었으며, 기술 발전으로 인해매번 16,17,18에더 나은 결과를 초래한다. MKs 또는 MK 전구체가 연구될 수 있는 인간 적인 1차 근원은 골수, 장혈 및 말초 혈액을 포함합니다, 다른 중. 각 샘플에 대한 분석을 위해 관련 셀 분획을 격리하는 적절한 샘플 처리가 중요합니다. 표준 절차는 메가 카요포이시스의 연구를 목표로 할 때 고려해야 할 몇 가지 고려 사항과 함께 통합됩니다.

<table><tbody><tr><td>MK 분류에 필요한</td> <td>130 마이크론</td><td>643943</td><td>노즐 BD</td></tr><tr><td>5810R 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Cell 분리 및 세척</td></tr><tr><td>A-4-62 Swing Bucket Rotor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Cell 분리 및 세척</td></tr><tr><td>Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge</td><td>ELITech Group</td><td></td><td>Automatized cytology devise, 여기서 슬라이드는 Mat-Gr& 음; nwald Giemsa</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터 Galaxy 170 S</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Cell Incubation</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>시토스핀</td></tr> 제조 <tr><td>FACSAria IIu 분류기</td><td>BD</td><td></td><td>레이저 488-nm 및 633-nm</td></tr><tr><td>FACSCanto II 유세포 분석기</td><td>BD</td><td></td><td>레이저 488-nm, 633-nm 및 405-nm</td></tr><tr><td>Olympus 현미경 BX 41</td><td>올림푸스</td><td></td><td>현미경</td></tr> 현미경 <tr><td>BX 61</td><td>올림푸스</td><td></td><td>현미경 사진</td></tr><tr><td>Zoe 형광 세포 이미저</td><td>BioRad</td><td></td><td>현미경 사진</td></tr><tr>성체 혈청 <td>Sigma-Aldrich</td><td>L4646</td><td>또는 유사한</td>림프렙 줄기 세포에서 PBMC,<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>지질, 콜레스테롤이 풍부함을<td>얻기 위해</td></tr><tr><td></td><td> Technologies</td><td>#07801</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4333</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>재조합 인간 에리트로포이에틴(EPO)</td><td>&nbsp; R& D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>또는 유사</td></tr><tr><td>재조합 인간 줄기 세포 인자(SCF)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&trade;</td><td>PHC2115</td><td>또는 유사</td></tr><tr><td>재조합 인간 트롬보포이에틴(TPO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&trade;</td><td>PHC9514</td><td>또는 TPO 수용체 작용제</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Merck</td><td>A7906-100G</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Mouse Ig, &kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD</td><td>552843</td><td>인간 세포에 대한 항체는 일반적으로 마우스에서 추출합니다.</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td>또는 유사</td></tr><tr><td>BD FACS Accudrop Beads</td><td>BD</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>CD31 AF-647</td><td>BD</td><td>561654</td><td>Mouse anti-human</td></tr><tr><td>CD31 FITC</td><td>Immunostep</td><td>31F-100T</td><td></td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>BD</td><td>555821</td><td>Mouse anti-human</td></tr><tr><td>CD41 PE</td><td>BD</td><td>555467</td><td>Mouse anti-human</td></tr><tr><td>CD41 PerCP-Cy5.5</td><td>BD</td><td>333148</td><td>마우스 anti-human</td></tr><tr><td>CD42A APC</td><td>Immunostep</td><td>42AA-100T</td><td>우리는 불특이적 결합을 관찰했습니다 ... 평가해야 할 사항</td></tr><tr><td>: CD42A PE</td><td>BD</td><td></td> 558819 <td>마우스 anti-human</td></tr><tr><td>CD42B PerCP</td><td>Biolegend</td><td>303910</td><td>마우스 anti-human</td></tr><tr><td>CD49B PE</td><td>BD</td> 555669 <td></td><td>마우스 anti-human</td></tr><tr><td>CD61 FITC</td><td>BD</td><td>555753</td><td>Mouse anti-human</td></tr><tr><td>CD71 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>334109</td><td>Mouse anti-human</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD</td><td>564219</td><td>Fc blocking - control</td></tr><tr><td>KIT PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>313212</td><td>Mouse anti-human</td></tr><tr><td>Lineage Cocktail 2 FITC</td><td>BD</td><td>643397</td><td>Mouse anti-human</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Merck</td><td>R6513</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Triton X-500</td><td>Merck</td><td>93443-500ML</td><td>또는 이와 유사한</td></tr> 차량<tr><td>CellTrics 필터 분류</td><td></td><td></td><td></td>용 세포 여과기</tr><tr><td>100 마이크로미터</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2328</td><td>세포 여과기</td></tr><tr><td>참고: 우리는 일반 시약/화학물질 (PBS, EDTA 등) 또는 일회용품 (튜브 등) 또는 이전에 발표된 및 표준 프로토콜에 명시된 시약을 지정하지 않습니다. - 달리 명시되지 않는 한.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 1차 출처에서 인간 mk의 면역페노티핑 및 세포 분류 또는 헤마토포이틱 전조자로부터 시험관내 분화

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

메가카요세포(MK) 분화는 고도의 다중계(>64N) 및 매우 큰 셀(40-60 μm)을 초래하는 다수의 내미토성 주기를 포함한다. 세포 생물학 및 분자 수준에서 메가카요포에이시스에 대한 빠르게 증가하는 지식과는 달리, 유동 세포측정에 의한 메가카르요포에이스의 특성화는 계보 특이적 표면 마커를 이용한 성숙한 MK의 식별에 국한되는 반면, 이전의 MK 분화 단계는 아직 미개척되지 않은 상태로 남아 있다. 여기서는 MK 특이적 및 비특이적 표면 마커를 통합하는 패널이 있는 인간 1차 출처 또는 체외 배양에서 연속MK 분화 단계를 식별할 수 있는 면역페노티핑 전략을 제시합니다. 그 크기와 취약성에도 불구하고, MK는 위에서 언급한 패널을 사용하여 면역페노타입이 될 수 있으며, 압력 및 노즐 직경의 특정 조건하에서 형광 활성화 셀 분류에 의해 농축될 수 있다. 이 접근은 인간에 있는 거대 karyopoiesis 및 혈소판 생산의 복잡성을 더 잘 이해하기 위하여 목적으로, 다중 Omics 연구 결과를 촉진합니다. 메가카요포이스의 더 나은 특성화는 혈통 관련 병리학 및 악성종양의 진단 또는 예후에서 근본적인 자세를 취할 수 있습니다.

골수와 플로이디 도 4에서, 우리는 환자로부터 BM 샘플 (열망)에서 메가 카요포이스의 대표적인 면역 페노티핑 분석을 보여줍니다. CD71 및 CD31에 대한 셀룰러 분획을 플로팅할 때 CD31- CD71- (빨간색), CD31- CD71+ (파란색), CD31+ CD71- (오렌지), CD31+ CD71미드 (밝은 녹색), CD31+ CD71+ (어두운 녹색) 및 CD31 ++++++1)의 6개의 주요 인구를 게이트했습니다. 이러한 인구는 항상 동일한 위치에 존재하지 않습니다 (일정한 사이토미터 설정을 고려), 그것은 볼 수 있듯이, 그 고려되어야한다. 이것은 병리학적 상태와 ...

여기서는 메가카요세포 분화의 특성화를 위한 면역페노티핑 전략을 제시하고, 이 전략이 형광 활성화 세포 선별기로 다른 단계에서 메가카요사이클을 분류하는 방법을 보여준다. 방법론은 인체 에 있는 문화에서 생성된 거대 karyocytes뿐만 아니라 인간 1차 조직에적용될 수 있다.

인간 1차 출처에서 인간 MK의 면역페노티핑 및 세포 분류 또는 헤마토포이틱 전조자로부터 시험관내 분화

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

Hello.I는 안드레아 아세비스 Huerta.아스투리아스 공국의 건강 연구소 부분의 혈소판 연구 실에서 박사 후 연구원, ISPA. 스페인 오비에도에 위치한다.Hello.I am 로라 구티

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연구

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생물학

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

이 프로토콜은 단일 세포 분류 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기 세포의 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 방법을 설명합니다. 특히, 단일 세포 분류를 사용하면 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합할 때 이종 집단에서 면역표현형 세포의 99% 순도를 달성할 수 있습니다.

인간 박리 낙엽 치아에서 면역 표현형 중간엽 줄기 세포의 단일 세포 분류

배우세요 인간 거대핵구 분화 단계의 면역페노타이핑 및 유세포 분석 방법을. 유세포 분류를 통해 다배체 상태의 거대핵구를 식별하고 정제하여 혈액학 연구에 활용할 수 있습니다.

인간 1차 출처에서 인간 MK의 면역페노티핑 및 세포 분류 또는 헤마토포이틱 전조자로부터 시험관내 분화

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