Name: MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 배우세요 MALDI-TOF-TOF-MS/MS와 하향식 프로테오믹스를 활용하여 대장균의 항균 면역 단백질을 신속하게 식별하는 방법입니다. 이 기술은 세포 방어 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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단백질 바이오마커 시커 소프트웨어는 clifton.fagerquist@usda.gov 클리프턴 K. Fagerquist에 연락하여 자유롭게 사용할 수 있습니다(무료). 우리는 ARS에 의해이 연구의 지원을 인정 하고자, USDA, CRIS 교부금: 2030-42000-051-00-D.

1. 미생물 샘플 준비
<ol><li>루리아 국물(LB)의 접종 25mL은 멸균 1 μL 루프를 이용하여 글리세롤 스톡으로부터 대장균 O113:H21 균주 RM7788(또는 다른 세균균균)을 가진 50mL 원추형 튜브에서 접종하였다. 튜브 및 사전 배양을 37°C에서 4시간 동안 흔들림(200rpm)으로 캡합니다.</li>
	<li>사전 배양된 국물의 알리쿼트 100 μL을 LB 한천 판에 퍼지고 미토마이신-C의 400 또는 800 ng/mL로 보충됩니다. 배양 식도는 37 °C의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 정전기로 접시를 냅니다. 주의: STEC 균주는 병원성 미생물입니다. BSL-2 생물 안전 캐비닛에서 배양 을 넘어 모든 미생물 조작을 수행합니다.</li>
	<li>멸균 1 μL 루프를 사용하여 단일 가시 식민지에서 세균 세포를 수확하고 HPLC 급 물의 300 μL을 포함하는 2.0mL O 링 안감 나사 -캡 미세 원심 분리 튜브로 전송합니다. 튜브, 소용돌이, 원심분리기를 11,337 x g에서 2분 동안 캡하여 세포를 펠릿합니다.</li>
</ol>2. 질량 분석
<ol><li>스테인레스 스틸 MALDI 대상에 샘플 상류체의 점 0.75 μL 알리쿼트 및 건조 할 수 있습니다. 건조된 시료 반점을 33% 아세토닐릴, 67% 물, 0.2%의 트리플루오라산에 시나피닉산의 포화용 액액을 과대평가한다. 그 자리를 말리십시오.</li>
	<li>MALDI-TOF-TOF 질량 분광계를 사용하여 건조된 시료 반점을 분석합니다.<ol>
<li>MALDI 대상을 질량 분광계에 로드한 후 인수 소프트웨어에서 MS 선형 모드 수집 버튼을 클릭합니다. m/z 범위를 입력하여 하부 및 상한의 m/z(예: 2kDa ~20kDa)를 획득 방법 소프트웨어에서 해당 필드에 입력하여 분석한다.</li>
		<li>소프트웨어의 MALDI 대상 템플릿에서 분석할 샘플 스팟을 클릭합니다. 그런 다음 왼쪽 마우스 버튼을 누르고 마우스 커서를 샘플 스팟 위로 드래그하여 레이저 절제/이온화를 위해 샘플링할 직사각형 영역을 지정합니다. 마우스 버튼을 해제하면 획득이 시작됩니다. 각 샘플 스팟에 대해 1,000개의 레이저 샷을 수집합니다. 참고: 데이터 수집은 소프트웨어 수집 창에 실시간으로 표시됩니다.</li>
		<li>이온이 검출되지 않으면 단백질 이온 신호가 감지될 때까지 소프트웨어의 레이저 강도 하에서 슬라이딩 스케일 바를 조정하여 레이저 강도를 높입니다. 이를 임계값이라고 합니다. 참고: 시료 스팟 분석 에 앞서, m/z 범위분석되는 단백질 교정제와 MS 선형 모드에서 계측기를 외부적으로 보정합니다( 예: 단백질 교정제의 +1 및 +2 충전 상태: 사이토크롬-C, 리소지메 및 미오글로빈은 2kDa에서 20kDa까지의 질량 범위를 커버합니다. 지정된 질량 범위 내의 중간 질량은 초점 질량(예: 9 kDa)으로 사용된다. 초점 질량은 m/z가 선형 모드 검출기에 의해 검출을 위해 최적으로 초점을 맞춘 이온입니다.</li>
		<li>MS 선형 모드 수집이 완료되면 인수 소프트웨어에서 MS/MS 리플렉션론 모드 수집 버튼을 클릭합니다. 전구체 질량을 입력하여 전구체 질량 필드로 분석합니다. 다음으로, 전구체 질량의 낮고 높은 질량 면(예: ±100 Da)에 대한 전구체 질량 창에 격리 폭(Da)을 입력합니다.</li>
		<li>CID 끄기 버튼을 클릭합니다. 메타스터블 서프레서 ON 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어의 레이저 강도 아래 슬라이딩 스케일 막대를 조정하여 레이저 강도를 최대 값의 90% 이상으로 조정합니다.</li>
		<li>소프트웨어의 MALDI 대상 템플릿에서 분석할 샘플 스팟을 클릭합니다. 그런 다음 왼쪽 마우스 버튼을 누르고 마우스 커서를 샘플 스팟 위로 드래그하여 레이저 절제/이온화를 위해 샘플링할 직사각형 영역을 지정합니다. 마우스 버튼을 해제하면 획득이 시작됩니다. 각 샘플 스팟에 대해 10,000개의 레이저 샷을 수집합니다. 참고: 샘플 스팟 분석 이전에, 계측기는 alkylated thioredoxin35의+1 전하 상태의 포스트 소스 붕괴(PSD)의 조각 이온을 사용하여 MS/MS-리플론 모드에서 외부로 보정되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원시 MS 데이터를 처리하지 마십시오. 지정된 순서로 다음 단계 순서를 사용하여 MS/MS-PSD 원시 데이터를 처리하는 프로세스: 고급 기준 보정(32, 0.5, 0.0) 및 잡음 제거(표준 편차 2개) 다음으로 가우시안 스무딩(31점)이 뒤따릅니다.</li>
	<li>PBC19,20에서생성된 눈에 띄는 조각 이온의 존재에 대해 MS/MS-PSD 데이터를 수동으로 검사한다.</li>
	<li>단편 이온과 신호-잡음(S/N)의 절대적이고 상대적인 풍부에 대해 MS/MS 데이터를 평가합니다. 특히 MS/MS-PSD 데이터가 시끄러운 경우 단백질 식별을 위해 가장 풍부한 단편 이온만 사용하십시오.</li>
</ol>3. 실리코 단백질 데이터베이스 구축
<ol><li>단백질 식별을 위해 단백질 바이오마커 시커 소프트웨어에 의해 스캔되는 세균균의 실리코 단백질 서열에 포함된 텍스트 파일을 생성한다. 단백질 서열은 분석되는 균주의 전체 게놈 시퀀싱(WGS)에서 파생됩니다(또는 밀접하게 관련된 균주).</li>
	<li>NCBI/PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) 웹사이트에 접속하여 분석중인 특정 세균균의 약 5,000가지 단백질 서열을 다운로드한다(예: 에슈리치아 대장균 O113:H21 균주 RM7788). 최대 다운로드 크기는 200시퀀스입니다.<ol>
<li>따라서 25개의 다운로드를 단일 텍스트 파일에 복사하여 붙여넣습니다. 각 다운로드에 대해 FASTA(텍스트) 형식을 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 운영 단백질 바이오마커 시커 소프트웨어
<ol><li>단백질 바이오마커 시커 실행 파일을 두 번 클릭합니다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 창이나타납니다(그림 1,상단 패널).</li>
	<li>단백질 바이오마커의 질량을 성숙한 단백질 질량 필드에 입력합니다(MS-linear 모드에서 측정된 대로). 다음으로 질량 측정 오류를 질량 허용 오차 필드에 입력합니다. 표준 질량 측정 오차는 10,000 Da 단백질에 대한 ±10 Da입니다.</li>
	<li>선택적으로, 보완 b/y 이온 단백질 질량 계산기 버튼을 클릭하여 퍼티프로 보완 단편 이온 쌍(CFIP 또는 b/y)에서 단백질 질량을 계산합니다. 팝업 창, 단백질 질량 계산기 도구, 나타납니다(그림 1,하단 패널).<ol>
<li>PUTATIVE CFIP의 m/z를 입력하고 쌍 추가 버튼을 클릭합니다. 계산된 단백질 질량이 나타납니다.</li>
		<li>이 숫자를 성숙한 단백질 질량 필드에 복사하여 붙여 넣고 단백질 질량 계산기 도구 창을 닫습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>잔여 제한 설정 상자를 클릭하여 N 단자 신호 펩타이드 길이를 선택합니다. 슬라이딩 스케일과 커서가 있는 팝업이 나타납니다. 커서를 원하는 신호 펩티드 길이(최대 50개)로 이동합니다. 신호 펩티드 길이가 선택되지 않으면 소프트웨어에 의해 무제한 서열 잘림이 수행됩니다.</li>
	<li>GUI의 단편 이온 조건하에서 폴리펩티드 백본 골짜기(PBC)에 대한 잔류물을 선택한다. 하나 이상의 잔류물 상자(D, E, N 및/또는 P)를 클릭합니다.<ol>
<li>검색할 조각 이온(+1) 입력 을 클릭합니다. 팝업 조각 페이지가 나타납니다. 다음으로 각 조각 이온에 대해 한 번 클릭하면 입력할 조각 이온 수에 해당하는 조각 이온 추가 버튼을 클릭합니다. 입력할 각 조각 이온에 대해 드롭다운 필드가 나타납니다.</li>
		<li>조각 이온의 m/z와 관련 m/z 허용 오차를 입력합니다. 완료되면 저장 및 닫기 버튼을 클릭합니다. 참고: 합리적인 m/z 허용 오차는 ±1.5입니다.</li>
		<li>일치하는 조각 이온 수의 오른쪽에 있는 상자의 원하는 번호로 스크롤하여 식별에 맞게 일치해야 하는 최소 조각 이온 수를 선택합니다. 참고: 세 경기가 적절해야 합니다.</li>
		<li>해당 원을 클릭하여 산화 상태로 시스테인 잔류물을 선택합니다. 검색 후 단백질 식별이 발견되지 않으면 감소 된 상태에서 시스테인으로 검색을 반복하십시오. 검색 후 식별이 발견되지 않으면 조각 이온 허용 오차를 ±3로 확대하고 검색을 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>파일 설정에서 FASTA 파일 선택 버튼을 클릭하여 이전에 프로토콜 단계 3.1 에서 3.2로 구성된 세균 균주의 실리코 단백질 서열을 포함하는 FASTA(텍스트) 파일을 찾아보고 선택합니다. 그런 다음 출력 폴더를 선택하고 출력 파일 이름을 만듭니다.</li>
	<li>파일 항목 실행 단추를 클릭합니다. 팝업 창에는 검색이 시작되기 전에 검색 매개 변수를 표시하는 검색 매개 변수 확인(그림1,하단 패널)이라는 제목이 표시됩니다.</li>
	<li>검색 매개 변수가 올바른 경우 검색 시작 단추를 클릭합니다. 검색 매개 변수가 올바르지 않으면 취소 버튼을 클릭하고 올바른 매개 변수를 다시 입력합니다. 검색이 시작되면 매개 변수 창이 닫히고 진행률 표시줄이 있는 새 팝업창(그림 1,하단 패널)이 나타나 검색 진행 상황과 발견된 식별 수의 실행 집계를 보여 주어 있습니다.</li>
	<li>검색이 완료되면(몇 초) 진행률 표시줄이 자동으로 닫히고 검색 요약이 GUI의 로그 필드에표시됩니다(그림 2,상단 패널). 또한, 새로운 팝업 창은 단백질 식별(들)을 표시하는 것으로 나타나며(그림2,하단 패널). 참고: 인식되지 않은 잔류물을 갖는 실리코 단백질 서열에서는, 예를 들어, U 또는 X, 분석에서 자동으로 건너뛰고 이러한 서열은 이후에 별도의 팝업 창으로 보고되어 검색이 완료되면 서열이 어느 정도 건너뛴지 운전자에게 경고합니다.</li>
</ol>5. 단백질 서열의 검색 후 확인
<ol><li>수동 분석을 통해 후보 순서의 정확성을 확인합니다. 참고: 단백질 바이오마커 시커 소프트웨어의 목적은 성숙한 단백질에서 가능한 PTM으로 서열 잘림절을 고려하지 않고 많은 명백히 잘못된 단백질 서열을 제거하여 고정밀단백질 서열을 식별하는 것입니다. 반환가능한 후보 시퀀스의 수가 적기 때문에 수동 확인이 가능합니다.</li>
	<li>이러한 기능을 갖는 질량 분석 또는 프로테오믹 소프트웨어를 사용하여 후보 시퀀스의 b 및 y형 조각 이온의 평균 m/z 의 테이블을 생성한다. D-, E-및 N-잔류물의 C 단자 측의 실리코 단편 이온의 평균 m/z와 P-잔류물의 N단 측)을 MS/MS-PSD 데이터로부터 눈에 띄는 단편 이온의 m/z와 비교한다. 참고: 가장 눈에 띄는 MS/MS-PSD 단편 이온은 실리코 단편 이온에서 D-, E-및 N과 연관된 것과 쉽게 일치해야 합니다. 그러나, 산성 효과 단편화 메커니즘은 단백질서열(36)의N-또는 C-테르미니 근처에서 덜 효율적이다.</li>
</ol>

저자는 이해상충이 없습니다.

프로토콜 고려 사항 현재 프로토콜의 주요 강점은 속도, 샘플 준비의 단순성 및 비교적 작동, 훈련 및 유지 보수가 쉬운 계측기의 사용입니다. 액체 크로마토그래피-ESI-HR-MS에 의한 상향식 및 하향식 프로테오믹 분석은 MALDI-TOF-TOF의 하향식에 대한 여러 면에서 유비쿼터스이며 훨씬 우수하지만 더 많은 시간, 노동 및 전문 지식이 필요합니다. 악기 복잡성은 종종 특정 악기 플랫폼이 대량 분석에서 공식적으로 훈련되지 않은 과학자들에 의해 채택 될 가능성이 있는지 여부에 영향을 미칠 수 있습니다. MALDI-TOF-TOF를 사용한 하향식 접근법은 임상 미생물학 실험실에서 박테리아의 분류학적 식별을 위해 현재 사용이 아닌 MALDI-TOF-MS의 분석을 확장하는 동시에 분석에 필요한 노동, 복잡성 또는 전문 지식을 크게 증가시키지 않기 위한 것입니다.
프로토콜은 기계적(또는 전기적) 셀 리시스 단계를 사용하지 않습니다. 분비 또는 세포외 ...

질량 분석법에 의한 소화되지 않은 단백질의 분석 및 식별을 하향식 프로테오믹 분석1,2,3,4라고합니다. 현재 는 전기분무 이온화(ESI)5 및 고해상도 질량 분석기6,정교한 해리 기술, 예를 들어 전자 전달 해리(ETD), 전자 포획 해리(ECD)7,자외선 광 해리(UV-PD)8등을 활용하는 확립된 기술이다.
다른 소프트 이온화 기술은 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)9,10,11은 하향식 분석에 덜 광범위하게 활용되고 있으며, 이는 주로 다른 질량 분석기와 비교하여 해상도가 제한된 비행 시간(TOF) 질량 분석기와 결합되기 때문이다. 이러한 한계에도 불구하고 MALDI-TOF 및 MALDI-TOF-TOF 계측기는 순수 단백질과 분획되고 분수되지 않은 단백질 혼합물의 신속한 하향식 분석을 위해 악용되었습니다. 순수 단백질의 식별을 위해, 산내 붕괴(ISD)는 ISD 단편 이온의 질량 분석(MS) 분석뿐만 아니라 단백질 이온 단편의 질량 분석법(MS/MS)을 허용하고, 표적 단백질의 N-및 C-테르미니로부터 서열특이적 단편을 자주 제공하는, 에드먼12, 에드만12와유사하게 매우 유용한 기술이다. . ISD 접근법의 단점은 Edman 시퀀싱에서와 같이 샘플에 단 하나의 단백질만 포함되어야 한다는 것입니다. 1개의 단백질 요구 사항은 전구체 이온에 단편 이온의 명백한 기여에 대한 필요성 때문입니다. 2개 이상의 단백질이 샘플에 존재하는 경우, 어떤 단편 이온이 전구체 이온에 속하는지 할당하기가 어려울 수 있다.
단편 이온/전구체 이온 어트리뷰션은 MALDI-TOF-TOF-MS/MS를 사용하여 해결할 수 있습니다. 모든 고전적인 MS/MS 실험과 마찬가지로 전구체 이온은 단편화 전에 대량 선택/격리되며, 검출된 단편 이온은 특정 전구체 이온에 기인할 수 있다. 그러나, 이러한 접근법에 사용할 수 있는 해리 기술은 주로 높은 에너지 충돌 유도 해리(HE-CID)14 또는 포스트 소스 붕괴(PSD)15,16으로제한된다. HE-CID 및 PSD는 펩티드와 작은 단백질을 단편화하는 데 가장 효과적이며, 서열 커버리지는 경우에 따라 제한될 수 있다. 또한, PSD는 아파르산효과(17,18,19,20)라고불리는 현상에 의한 아파르트 및 글루타믹산 잔류물의 C-말단 측에서 주로 폴리펩티드 백본 골짜기(PBC)를초래한다.
MALDI-TOF-MS는 또한 미생물의 분류학적 식별에서 틈새 응용 프로그램을 발견했습니다: 박테리아21,곰팡이22,및 바이러스23. 예를 들어, MS 스펙트럼은 비교를 위해 패턴 인식 알고리즘을 사용하여 알려진 박테리아의 MS 스펙트럼의 참조 라이브러리와 비교하여 알려지지 않은 박테리아를 식별하는 데 사용됩니다. 이 접근 방식은 격리의 하룻밤 배양을 필요로하지만, 속도와 단순성 때문에 매우 성공적인 입증했다. 이러한 접근법(보통 20kDa 미만)에 의해 검출된 단백질 이온은 속 및 종 수준에서 분류학 적 분해를 허용하는 MS 지문을 포함하며, 어떤 경우에는 하위종(24) 및 균주수준(25,26)에서분류학을 용이한다. 그러나, 분류잠재적으로 병원성 미생물을 분류할 뿐만 아니라 특정 독성 요인, 독소 및 항균 저항(AMR) 요인을 식별할 필요가 있습니다. 이를 달성하기 위해 펩티드, 단백질 또는 소분자의 질량은 MS에 의해 측정되고 이후에 MS/MS에 의해 분리되고 단편화됩니다.
병원성 박테리아는 종종 플라스미드에게 불린 DNA의 원형 조각을 전송합니다. 플라스미드는, prophages와 더불어, 박테리아 사이 수평 유전자 전송의 중요한 벡터이고 박테리아를 통해 항균 저항 및 그밖 독성 요인의 급속한 퍼짐에 책임 있습니다. 플라스미드는 또한 항균 (AB) 유전자, 예를 들어, 복리신 및 박테리신을 수행 할 수 있습니다. 이러한 유전자가 발현되고 단백질이 분비될 때, 동일한 환경 틈새 시장을 차지하는 이웃 박테리아의 단백질 번역 기계를 비활성화하는 역할을한다(27). 그러나, 이러한 bactericidal 효소는 또한 그들을 생산 하는 호스트에 위험을 제기할 수 있습니다. 결과적으로, 유전자는 AB 효소의 기능을 구체적으로 억제하고 면역 단백질(Im)으로 지칭되는 숙주에 의해 공동 발현된다.
미토마이신-C 및 시프로플록사신과 같은 DNA 손상 항생제는 종종 시가 독소 생성 대장균(STEC)에서 SOS 반응을 유도하는 데 사용되며, 시가 독소 유전자(stx)는 세균게놈(28)에 존재하는 프로파지 게놈 내에서 발견된다. 우리는 이전에 항생제 유도, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 STEC 균주29,30,31,32에의해 생성된 Stx 유형 및 아류형을 검출하고 식별했습니다. 전작에서는 STEC O113:H21 균주 RM7788이 미토마이신-C로 보충된 한천 매체에서 하룻밤 사이에 배양되었다. 그러나, m/z~7816에서 Stx2a의 예상 B-서브유닛을 검출하는 대신, m/z~7839에서 상이한 단백질 이온이 검출되고 알 수 없는 기능(33)의플라스미드 인코딩 된 가상 단백질로 확인되었다. 현재 작업에서, 우리는 항생제 유도를 사용하여이 균주에 의해 생성 된 두 개의 플라스미드 인코딩 AB-임 단백질을 확인, MALDI-TOF-TOF-MS / MS, 및 전체 게놈 시퀀싱에서 파생 된 실리코 단백질 서열에서 처리 및 스캔개발 독립 형 소프트웨어를 사용하여 하향식 proteomic 분석 (WGS). 또한 시퀀스 잘림과 관련된 번역 후 수정(PTM)의 가능성이 소프트웨어에 통합되었습니다. 면역 단백질은 인산 효과에 의해 유발되고 MS/MS-PSD에 의해 검출된 PBC로부터의 성숙한 단백질 이온 및 서열 특이적 단편 이온의 측정질량으로부터 이 소프트웨어를 사용하여 확인되었다. 마지막으로, 프로모터는 이 긴장이 DNA 손상 항생제에 드러나면 이러한 유전자의 발현을 설명할 수 있는 플라스미드 게놈에서 AB/Im 유전자의 상류로 확인되었다. 이 작품의 일부는 2020년 가을 미국 화학 협회 가을 가상 회의 및 엑스포 (2020년 8월 17-20일)34에서발표되었습니다.

<table><tbody><tr><td>4000 시리즈 탐색기 소프트웨어</td><td>AB Sciex</td><td>버전 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>4800 Plus MALDI TOF / TOF 분석기</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile Optima LC / MS 등급</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996-1</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2 생물학적 위험 캐비닛</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>사이토크롬 -C</td><td>시그마</td><td>C2867-10MG</td><td></td></tr><tr><td>데이터 탐색기 소프트웨어</td>: <td>AB Sciex</td><td>버전 4.9</td><td></td></tr>, <tr><td>초점 단백질 환원-알킬화 키트</td>, <td>G-Biosciences,</td><td>786-231</td><td></td></tr>, <tr><td>GPMAW 소프트웨어</td>, <td>Lighthouse 데이터</td><td>버전 10.0</td><td></td></tr>, <tr><td>인큐베이터</td><td>, VWR</td><td>9120973</td><td></td></tr>, <tr><td>LB Agar</td>, <td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td></td></tr>, <tr><td>Luria Broth</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>Sigma</td><td>L4919-1G</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 2 mL, 나사 캡, O-링</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-343</td><td></td></tr><tr><td>MiniSpin Plus 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22620207</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0440-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Myoglobin</td><td>Sigma</td><td>M5696-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Shaker MaxQ 420HP 모델 420</td><td>Thermo Scientific</td><td>모델 420</td><td></td></tr><tr><td>Sinapinic acid</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861580</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1 uL loops</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-595</td><td></td></tr><tr><td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td><td>Sigma</td><td>T0910-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537-100G</td><td></td></tr><tr><td>Water Optima LC/MS 등급</td><td>피셔 케미컬</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

maldi-tof-tof-ms/ms 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

이 프로토콜은 bactericidal 효소의 면역 단백질을 식별합니다: 복리신 E3 및 박테리아는 항생제 유도를 사용하여 병원성 대장균 균주에 의해 생성되고, MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광및 하향식 프로테오믹 분석에 의해 확인된 것으로, 사내에서 개발된 소프트웨어와 함께. 배리신 E3(Im3)의 면역 단백질과 박테리오신(Im-Bac)의 면역 단백질은 산성, 글루타믹산 및 아스파라진 잔류물의 C-말단 측에서 폴리펩타이드 백본 분열(PBC)에 의해 생성된 눈에 띄는 b-및/또는 y형 단편 이온으로부터 확인되었다. 이 소프트웨어는 세균균의 전체 게놈 염기서열분석에서 파생된 실리코 단백질 서열에서 빠르게 스캔합니다. 또한 이 소프트웨어는 성숙한 단백질 서열이 잘린 경우 단백질 서열의 아미노산 잔류물을 반복적으로 제거합니다. 단일 단백질 서열은 각 면역 단백질에 대해 검출된 것과 일치하는 질량 및 단편 이온을 소유했습니다. 그런 다음 후보 순서를 수동으로 검사하여 감지된 모든 조각 이온을 할당할 수 있는지 확인했습니다. Im3의 N 단말 메티오닌은 번역 후 제거된 반면 임박은 완전한 시퀀스를 가졌다. 또한, 우리는 PBC에 의해 형성된 2개 또는 3개의 비보완 단편 이온만이 올바른 단백질 서열을 식별하는 데 필요하다는 것을 발견했습니다. 마지막으로, 프로모터(SOS box)는 세균균균의 플라스미드 게놈에서 항균 및 면역 유전자의 상류로 확인되었다.

도 3(상단 패널)는 400 ng/mL 미토마이신-C로 보충된 LBA에서 하룻밤 사이에 배양된 STEC O113:H21 균주 RM7788의 MS를 나타낸다. m/z 7276, 7337 및 7841의 피크는 이전에 감기 충격 단백질 C(CspC), 냉쇼크 단백질 E(CspE), 및 알 수 없는 기능의 플라스미드 매개단백질로확인되었다. m/z 9780 [M+H]+에서의 단백질 이온은 도 3(하단 패널)에 도시된 바와 같이 MS/MS-PSD에 의해 분석되었다. 전구체 이온은 시간 시간 이온 선택기 (TIS) 창±100 Da. 조각 이온은 m / z 및 유형 / 번호로 식별하여 격리되었다. m/z 2675.9(별과 함께 강조)의 단편 이온은 도 3(상단 패널)에 도시된 m/z 9655에서 메타안정 단백질 이온의 해리...

여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

이 프로토콜은 항생제 유도 및 질량 분광법을 사용하여 세균성 단백질을 식별하는 빠른 방법을 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 속도와 단순성입니다. 샘플 준비는 복잡하지 않습니다.이 기술은 세균 감염에 대한 적절한 치료를 더 잘 알리기 위해 독성 인자 또는 항생제 내성과 같은 병원성 박테리아의 특성화로 확장 될 수 있습니다. 시작하려면 멸균 1 마이크로리터 루프를 사용하여 LB 한천 판에서 자란 단일 식민지에서 박테리아를 수확하십시오. 그리고 HPLC 급 물의 300 마이크로 리터를 포함하는 2 밀리리터 O 링 링 라인 나사 캡 마이크로 센심 분리튜브로 전송합니다.그런 다음 스테인레스 스틸 MALDI 대상에 샘플 상류체의 0.75 마이크로 리터 유물 물에서 원심 분리에 의해 세포를 간략하게 소용돌이시키고 건조할 수 있습니다. 건조된 시료 반점과 0.75 마이크로리터의 시나피닉산용용액을 33%의 아세토닐릴, 67%의 물, 0.2%의 트리플루오로아세트산으로 제조하여 건조시킵니다. 반점이 건조되면 질량 분광계에 대상을 적재하십시오.획득 소프트웨어를 열고 MS 선형 모드 획득 또는 대량 충전 범위 및 하부 및 상한의 질량 간 범위를 해당 필드에 클릭합니다. MALDI 대상 템플릿에서 분석할 샘플 스팟을 클릭합니다. 그런 다음 왼쪽 마우스 버튼을 누르고 샘플 스팟 위로 커서를 드래그하여 레이저 절제 또는 이온화를 위해 샘플링할 직사각형 영역을 지정합니다.마우스 버튼을 놓아 획득을 시작하고 각 샘플 스팟에 대해 1000개의 레이저 샷을 수집합니다. 이온이 검출되지 않으면 단백질 이온 신호가 검출될 때까지 레이저 강도 하에서 슬라이딩 스케일 바를 조정하여 레이저 강도를 증가시한다. MS 선형 모드 수집이 완료된 후 MS/MS 리플렉션론 모드 수집을 클릭합니다.전구체 질량을 입력하여 전구체 질량 필드로 분석합니다. 다음으로, 전구체 질량의 낮고 높은 질량 면에 대한 전구체 질량 창의 달톤에 격리 폭을 입력합니다. CID 끄기 버튼을 클릭합니다.그런 다음 메타스터블 서프레서 버튼을 클릭합니다. 레이저 강도를 입증된 대로 슬라이딩 스케일 바를 조정하여 최대 값의 90% 이상으로 조정합니다. MALDI 대상 템플릿에서 분석할 샘플 스팟을 클릭한 다음 왼쪽 마우스 버튼을 누름한 다음 샘플 스팟 위로 커서를 드래그하여 레이저 절제 또는 이온화를 위해 샘플링할 직사각형 영역을 지정하고 마우스 버튼을 해제하여 수집을 시작하고 각 샘플 스팟에 대해 10, 000 레이저 샷을 수집합니다.단백질 바이오마커 시커 실행 파일을 두 번 클릭하면 그래픽 사용자 인터페이스 창이 나타납니다. 성숙한 단백질 질량 분야에서 단백질 바이오마커의 질량을 입력하고 질량 내성 분야에서 질량 측정 오차를 입력합니다. 선택적으로, 무료 b/y 이온 단백질 질량 계산기 버튼을 클릭하여 퍼티드 무료 단편 이온 쌍에서 단백질 질량을 계산하고, 단백질 질량 계산기 도구의 팝업 창이 나타납니다.퍼티드 무료 단편 이온 쌍의 질량 충전 비율을 입력하고 페어링 추가 버튼을 클릭하고 계산기 단백질 질량이 나타납니다. 성숙한 단백질 매스 필드에 이 값을 붙여넣은 다음 단백질 질량 계산기 도구 창을 닫습니다. 잔여 제한 설정 상자를 클릭합니다.말단 신호 펩티드 길이를 선택하고 슬라이딩 스케일및 커서가 있는 팝업이 나타나커를 원하는 신호 펩타이드 길이로 이동한다. 신호 펩티드 길이를 선택하지 않으면 소프트웨어에 의해 제한되지 않은 서열 잘림이 수행됩니다. 조각 이온 조건하에서 하나 이상의 잔류물, D-E-N 및/또는 P.의 상자를 클릭하여 폴리펩타이드 백본 분열에 대한 잔기를 선택한 다음 조각 이온 을 입력하면 검색 버튼이 되고 팝업 조각 페이지가 나타납니다.다음 번 조각 이온 추가 버튼을 클릭하면 각 조각 이온에 대해 드롭다운 필드가 나타납니다. 전하 허용 오차에 의해 조각 이온 및 관련 질량의 전하 비율에 의해 질량을 입력합니다. 그런 다음 저장 및 닫기 버튼을 클릭합니다.일치하는 조각 이온의 오른쪽 상자에서 스크롤하여 식별을 위해 일치해야 하는 최소 조각 이온 수를 선택하고 산화 상태에서 시스테인 잔류물을 선택합니다. 단백질이 검색 후에 확인되지 않는 경우에, 그들의 감소한 상태에서 시스테인으로 검색을 반복합니다. 파일 설정에서 FASTA 선택 파일 아이콘을 클릭하여 이전에 생성된 세균 균주의 실리코 단백질 서열을 포함하는 FASTA 파일을 찾아보고 선택합니다.그런 다음 출력 폴더를 선택하고 출력 파일 이름을 만듭니다. 파일 항목 아이콘에서 검색 실행 아이콘을 클릭합니다. 검색이 시작되기 전에 검색 매개 변수를 표시하는 검색 매개 변수 확인이라는 제목의 팝업 창이 나타납니다.검색 매개 변수가 올바른 경우 검색 시작을 클릭합니다. 매개 변수가 올바르지 않으면 취소를 클릭하고 올바른 매개 변수를 다시 입력합니다. 검색이 시작되면 매개 변수 창이 닫히고 진행률 표시줄이 있는 새 팝업 창이 나타나 검색 진행 상황과 발견된 식별 수의 실행 집계가 표시됩니다.검색이 완료되면 진행률 표시줄이 자동으로 닫히고, 검색 요약은 그래픽 사용자 인터페이스의 로그 필드에 표시되며, 발견된 단백질 식별을 표시하는 새 팝업 창이 표시됩니다. 현재 연구에서는, 세균성 배양은 mytomycin-C의 2개의 다른 농도로 LB에서 성장했습니다. 균 소생술-C 농도로 성장 하는 세균 문화의 질량 스펙트럼.감기 충격 단백질 C, 감기 충격 단백질 E, 및 알 수 없는 기능의 플라스미드 매개 단백질이 확인되었다. 9780에서 알려지지 않은 단백질 이온은 MS/MS에 의해 분석되었고, 전구체 이온은 약 100달톤의 시간 이온 셀렉터 창으로 격리되었다. 9675.9를 충전하는 질량의 단편 이온은 9655에서 메타안정 단백질 이온의 해리로부터 유출된다.배앓이 E3용 면역 단백질의 서열에는 이온화의 기본 잔류 가능한 부위가 포함되어 있다. 폴리펩티드 백본 분열에서 검출된 단편 이온은 검색 중에 감소된 형태의 시스테인이 사용되었을 때 사용되었다. N단 메티오닌은 번역 후 수정으로 제거된다.세균 배양이 높은 mytomycin-C 농도에서 성장했을 때, 박테리오신의 면역 단백질이 확인되었다. 9651에서 알려지지 않은 피크는 MS/MS에 의해 분석되었고, 전구체 이온은 마이너스 75 + 60 달톤의 더 좁고 비대칭 TIS 창으로 격리되었다. 박테리오신의 면역 단백질의 서열은 이온화의 기본 잔류 가능한 부위를 포함합니다.폴리펩티드 백본 분열에서 검출된 단편 이온은 검색 중에 감소된 형태의 시스테인이 사용되었을 때 사용되었다. 항생제의 다른 농도와 함께, 상대적인 단백질 풍부 는 다를 수 있습니다. 그리고 이들은 질량 분석법을 사용하여 분석되었다.세균세포를 수확할 때, 항생제및 농도에 대하여 식민지 형태학 및 세균성 성장을 관찰하십시오. 단백질을 검출하기 위해서는 하나의 마이크로리터 세포 루프가 필요합니다.

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캡처 화합물 사진 crosslinking 및 정화하여 다음 기능을 가역 작은 분자 - 단백질 상호 작용에 의한 프로테옴의 복잡도를 줄이기 위해 trifunctional 작은 분자 수 있습니다. 여기있는 캡처 컴파 운드를...

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

단기 (MALDI-TOF) 질량 분석 (MS) 직접 혈액 배양액 행의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 애플리케이션은 박테리아의 식별을 촉진. 제출 방법은 직접 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 식별을위한 신속하고 신뢰할 수있는 방법입니다.

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS) 및 분자 기술(16S rRNA 유전자 염기서열 분석)을 통해 일상적인 진단에서 희귀 박테리아 병원체를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하는 두 기술의 조합에 있습니다.

16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)는 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 모음을 입력하는 데 사용되었다. doylei는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)에 비해 변형 수준에서 분리합니다.

의 하위 유형<em&gt; 캄 필로 박터 jejuni와</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt;은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP)

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

자세한 프로토콜 분리, 식별 및 모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS)를 사용 하 여 단백질 샘플에서 proteoforms의 특성에 대 한 설명 합니다. 프로토콜은 단순 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성화 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별에 사용할 수 있습니다.

모 세관 지역 전기 이동 법 탠덤 질량 분석을 사용 하 여 대규모 하향식 단백질

이 프로토콜은 고급 특징 추출 및 생물정보학 분석 소프트웨어와 결합된 액체 크로마토그래피 질량분석법을 사용하여 펩티도글리칸 조성에 대한 자세한 분석을 다룹니다.

액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

이 프로토콜은 배양체학과 MALDI-TOF MS를 결합하여 유제품의 미생물 구성을 신속하고 비용 효율적으로 평가할 수 있습니다. 기존 배양 방법보다 짧은 처리 시간으로 16S rRNA 시퀀싱에 필적하는 분류 결과를 제공합니다.

MALDI 접근법 을 통한 박테리아 단백질체학 프로파일링을 이용한 낙농장의 미생물 안전성 평가

배우세요 MALDI-TOF-TOF-MS/MS와 하향식 프로테오믹스를 활용하여 대장균의 항균 면역 단백질을 신속하게 식별하는 방법입니다. 이 기술은 세포 방어 메커니즘 연구에 활용됩니다.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

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