MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

이 프로토콜은 항생제 유도 및 질량 분광법을 사용하여 세균성 단백질을 식별하는 빠른 방법을 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 속도와 단순성입니다. 샘플 준비는 복잡하지 않습니다.

이 기술은 세균 감염에 대한 적절한 치료를 더 잘 알리기 위해 독성 인자 또는 항생제 내성과 같은 병원성 박테리아의 특성화로 확장 될 수 있습니다. 시작하려면 멸균 1 마이크로리터 루프를 사용하여 LB 한천 판에서 자란 단일 식민지에서 박테리아를 수확하십시오. 그리고 HPLC 급 물의 300 마이크로 리터를 포함하는 2 밀리리터 O 링 링 라인 나사 캡 마이크로 센심 분리튜브로 전송합니다.

그런 다음 스테인레스 스틸 MALDI 대상에 샘플 상류체의 0.75 마이크로 리터 유물 물에서 원심 분리에 의해 세포를 간략하게 소용돌이시키고 건조할 수 있습니다. 건조된 시료 반점과 0.75 마이크로리터의 시나피닉산용용액을 33%의 아세토닐릴, 67%의 물, 0.2%의 트리플루오로아세트산으로 제조하여 건조시킵니다. 반점이 건조되면 질량 분광계에 대상을 적재하십시오.

획득 소프트웨어를 열고 MS 선형 모드 획득 또는 대량 충전 범위 및 하부 및 상한의 질량 간 범위를 해당 필드에 클릭합니다. MALDI 대상 템플릿에서 분석할 샘플 스팟을 클릭합니다. 그런 다음 왼쪽 마우스 버튼을 누르고 샘플 스팟 위로 커서를 드래그하여 레이저 절제 또는 이온화를 위해 샘플링할 직사각형 영역을 지정합니다.

마우스 버튼을 놓아 획득을 시작하고 각 샘플 스팟에 대해 1000개의 레이저 샷을 수집합니다. 이온이 검출되지 않으면 단백질 이온 신호가 검출될 때까지 레이저 강도 하에서 슬라이딩 스케일 바를 조정하여 레이저 강도를 증가시한다. MS 선형 모드 수집이 완료된 후 MS/MS 리플렉션론 모드 수집을 클릭합니다.

전구체 질량을 입력하여 전구체 질량 필드로 분석합니다. 다음으로, 전구체 질량의 낮고 높은 질량 면에 대한 전구체 질량 창의 달톤에 격리 폭을 입력합니다. CID 끄기 버튼을 클릭합니다.

그런 다음 메타스터블 서프레서 버튼을 클릭합니다. 레이저 강도를 입증된 대로 슬라이딩 스케일 바를 조정하여 최대 값의 90% 이상으로 조정합니다. MALDI 대상 템플릿에서 분석할 샘플 스팟을 클릭한 다음 왼쪽 마우스 버튼을 누름한 다음 샘플 스팟 위로 커서를 드래그하여 레이저 절제 또는 이온화를 위해 샘플링할 직사각형 영역을 지정하고 마우스 버튼을 해제하여 수집을 시작하고 각 샘플 스팟에 대해 10, 000 레이저 샷을 수집합니다.

단백질 바이오마커 시커 실행 파일을 두 번 클릭하면 그래픽 사용자 인터페이스 창이 나타납니다. 성숙한 단백질 질량 분야에서 단백질 바이오마커의 질량을 입력하고 질량 내성 분야에서 질량 측정 오차를 입력합니다. 선택적으로, 무료 b/y 이온 단백질 질량 계산기 버튼을 클릭하여 퍼티드 무료 단편 이온 쌍에서 단백질 질량을 계산하고, 단백질 질량 계산기 도구의 팝업 창이 나타납니다.

퍼티드 무료 단편 이온 쌍의 질량 충전 비율을 입력하고 페어링 추가 버튼을 클릭하고 계산기 단백질 질량이 나타납니다. 성숙한 단백질 매스 필드에 이 값을 붙여넣은 다음 단백질 질량 계산기 도구 창을 닫습니다. 잔여 제한 설정 상자를 클릭합니다.

말단 신호 펩티드 길이를 선택하고 슬라이딩 스케일및 커서가 있는 팝업이 나타나커를 원하는 신호 펩타이드 길이로 이동한다. 신호 펩티드 길이를 선택하지 않으면 소프트웨어에 의해 제한되지 않은 서열 잘림이 수행됩니다. 조각 이온 조건하에서 하나 이상의 잔류물, D-E-N 및/또는 P.의 상자를 클릭하여 폴리펩타이드 백본 분열에 대한 잔기를 선택한 다음 조각 이온 을 입력하면 검색 버튼이 되고 팝업 조각 페이지가 나타납니다.

다음 번 조각 이온 추가 버튼을 클릭하면 각 조각 이온에 대해 드롭다운 필드가 나타납니다. 전하 허용 오차에 의해 조각 이온 및 관련 질량의 전하 비율에 의해 질량을 입력합니다. 그런 다음 저장 및 닫기 버튼을 클릭합니다.

일치하는 조각 이온의 오른쪽 상자에서 스크롤하여 식별을 위해 일치해야 하는 최소 조각 이온 수를 선택하고 산화 상태에서 시스테인 잔류물을 선택합니다. 단백질이 검색 후에 확인되지 않는 경우에, 그들의 감소한 상태에서 시스테인으로 검색을 반복합니다. 파일 설정에서 FASTA 선택 파일 아이콘을 클릭하여 이전에 생성된 세균 균주의 실리코 단백질 서열을 포함하는 FASTA 파일을 찾아보고 선택합니다.

그런 다음 출력 폴더를 선택하고 출력 파일 이름을 만듭니다. 파일 항목 아이콘에서 검색 실행 아이콘을 클릭합니다. 검색이 시작되기 전에 검색 매개 변수를 표시하는 검색 매개 변수 확인이라는 제목의 팝업 창이 나타납니다.

검색 매개 변수가 올바른 경우 검색 시작을 클릭합니다. 매개 변수가 올바르지 않으면 취소를 클릭하고 올바른 매개 변수를 다시 입력합니다. 검색이 시작되면 매개 변수 창이 닫히고 진행률 표시줄이 있는 새 팝업 창이 나타나 검색 진행 상황과 발견된 식별 수의 실행 집계가 표시됩니다.

검색이 완료되면 진행률 표시줄이 자동으로 닫히고, 검색 요약은 그래픽 사용자 인터페이스의 로그 필드에 표시되며, 발견된 단백질 식별을 표시하는 새 팝업 창이 표시됩니다. 현재 연구에서는, 세균성 배양은 mytomycin-C의 2개의 다른 농도로 LB에서 성장했습니다. 균 소생술-C 농도로 성장 하는 세균 문화의 질량 스펙트럼.

감기 충격 단백질 C, 감기 충격 단백질 E, 및 알 수 없는 기능의 플라스미드 매개 단백질이 확인되었다. 9780에서 알려지지 않은 단백질 이온은 MS/MS에 의해 분석되었고, 전구체 이온은 약 100달톤의 시간 이온 셀렉터 창으로 격리되었다. 9675.9를 충전하는 질량의 단편 이온은 9655에서 메타안정 단백질 이온의 해리로부터 유출된다.

배앓이 E3용 면역 단백질의 서열에는 이온화의 기본 잔류 가능한 부위가 포함되어 있다. 폴리펩티드 백본 분열에서 검출된 단편 이온은 검색 중에 감소된 형태의 시스테인이 사용되었을 때 사용되었다. N단 메티오닌은 번역 후 수정으로 제거된다.

세균 배양이 높은 mytomycin-C 농도에서 성장했을 때, 박테리오신의 면역 단백질이 확인되었다. 9651에서 알려지지 않은 피크는 MS/MS에 의해 분석되었고, 전구체 이온은 마이너스 75 + 60 달톤의 더 좁고 비대칭 TIS 창으로 격리되었다. 박테리오신의 면역 단백질의 서열은 이온화의 기본 잔류 가능한 부위를 포함합니다.

폴리펩티드 백본 분열에서 검출된 단편 이온은 검색 중에 감소된 형태의 시스테인이 사용되었을 때 사용되었다. 항생제의 다른 농도와 함께, 상대적인 단백질 풍부 는 다를 수 있습니다. 그리고 이들은 질량 분석법을 사용하여 분석되었다.

세균세포를 수확할 때, 항생제및 농도에 대하여 식민지 형태학 및 세균성 성장을 관찰하십시오. 단백질을 검출하기 위해서는 하나의 마이크로리터 세포 루프가 필요합니다.