Name: 고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 고체 지원 멤브레인(SSM) 전기생리학을 이용한 수송기 표적 억제 나노체 고속 스크리닝 방법입니다. 라벨 없이 전기생리적 신호로 나노체 효능을 평가하여 IC50을 결정하고 대규모 라이브러리 선별이 가능합니다.

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취리히 대학의 의학 미생물학 연구소의 세드릭 A. J. 허터와 마르쿠스 A. 시거, 바젤 대학의 바이오젠트럼의 곤잘로 세브레로(Gonzalo Cebrero)에게 합성 나노바디(sybody)의 세대협력에 감사드립니다. 난니온 테크놀로지스의 마리아 바스메스와 안드레 바조네에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (SNSF)(PP00P3_170607 및 NANION 연구 보조금 이니셔티브에서 C.P.에 의해 지원되었습니다.)

<ol><li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+an+antibody+molecule%3A+structure%2C+kinetics%2C+thermodynamics%2C+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641(2017).</li>
<li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216(2020).</li>
<li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li>
<li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF%2C+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296(2017).</li>
<li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Pharmacology+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li>
<li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li>
<li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li>
<li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317(2018).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li>
<li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li>
<li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaLi-H1%3A+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228(2016).</li>
<li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).</li>
<li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li>
<li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li>
<li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li>
<li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li>
<li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li>
<li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4+nanobodies+%28VHH-based+single+variable+domains%29+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187(2015).</li>
<li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li>
<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
<li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li>
<li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li>
<li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+LacY%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li>
<li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+of+electrogenic+sugar%2FH%2B+symport+in+MFS+sugar+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392(2016).</li>
<li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183(2020).</li>
<li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li>
<li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064(2020).</li>
<li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li>
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저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 기술은 전기 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비 억제 특성으로 나노바디를 분류합니다. 기판 수송을 평가하는 것은 프로테오폴솜의 막에 내장된 수송기를 통해 전하의 이동의 검출으로 인해 가능하다. 실험의 설치 중 중요한 단계 중 일부는 리포솜의 활성 단백질의 재구성, SSM 칩에 안정적인 단층의 준비, 바운드 nanobody 분자를 제거하기 위해 세척 프로토콜의 적용 후 초기 조건의 복구입니다. 멤브레인 단백질이 적절한 지질 대 단백질 비율로 재구성되면, 일반 SSM 프로토콜은 네이티브 기판을 사용하여 확립될 수 있다. 단백질이 없는 리포솜을 사용하여 프로테오이좀을 사용하여 측정된 전류에서 빼야 하는 소음 전류를 드러내는 것이 중요합니다. 그러나 노이즈 전류가 너무 크면 다른 지질을 사용하여 단백질 재구성을 시도하거나 이러한 해로운 신호를 최소화하는 완충 조건에 대한 화면을 시도하는 것이 좋습니다. SSM 분석에 대한 조건을 성공적으로 수립한 후 나노바디의 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 나노 바디의 빠른 스크리닝에 ...

항체는 항원 결합을 담당하는 두 개의 동일한 무거운 사슬과 2개의 광사슬로 구성됩니다. 낙타는 기존의 항체1,2에 비해 그들의 cognate 항원에 대해 유사한 친화력을 나타내는 무거운 사슬 전용 항체를 가지고있다. 중형사슬 전용 항체의 단일 가변 도메인(VHH)은 전체 항원 결합 전위를 유지하고 매우 안정적인1,2로나타났다. 이들 분리된 VHH 분자 또는 "나노바디"는 막 단백질생화학과 관련된 연구에서 구현되어 적합성3,4,억제제5,6,안정화 제제7,구조 결정8,9,10을 위한 가젯으로서 적합성3,4 . 나노체는 표적 특이적 나노체를 인코딩하는 B 세포의 사전 농축을 위한 낙타의 예방접종에 의해 생성될 수 있고, 그 다음에 나노드 라이브러리의 복제및 파지 디스플레이에 의한선택(11,12,13)이다. 나노체를 생성하는 다른 방법은 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 또는 효모디스플레이(14,15, 17,17,18,19,20)에의해 라이브러리 및 선택에 의존하는 시험관 내 선택 방법을 기반으로 한다. 이러한 체외 방법은 큰 라이브러리 크기를 필요로하지만 동물 예방 접종을 피하는 혜택을 상대적으로 낮은 안정성으로 단백질을 대상으로 나노 체의 선택을 선호.
나노체의 작은 크기, 높은 안정성과 용해도, 강한 항원 친화성, 낮은 면역원성, 비교적 쉬운 생산, 치료21,22,23의개발을 위한 강력한 후보를 만든다. 특히, 다중 막 단백질의 활성을 억제하는 나노체는 임상적용을위한 잠재적자산이다5,24,25,26. 멤브레인 수송기의 경우, nanobody가 억제 활성을 가지고 있는지 여부를 평가하기 위해, 수송 기판 및 / 또는 공동 기판의 검출을 허용하는 분석기를 개발할 필요가있다. 이러한 소법은 일반적으로 표지된 분자 또는 보편적인 응용 프로그램이 부족할 수 있는 기판 특이적 검출 방법의 설계를 포함한다. 더욱이, 억제 나노체의 식별은 일반적으로 많은 바인더의 선별을 필요로 한다. 따라서, 고처리량 모드에서 사용할 수 있고 라벨이 부착된 기판에 의존하지 않는 방법은 이 선택에 필수적이다.
SSM 기반 전기 생리학은 멤브레인(예: 이온 결합/수송)27,28을통해 전하의 이동을 검출할 수 있는 매우민감하고시간 해결된 기술이다. 이 기술은 이러한 단백질의 상대적으로 낮은 회전율로 인해 다른 전기 생리학 기술을 사용하여 연구하기 어려운 전기 생성 수송기를 특성화하기 위해 적용되었으며,이는 29,30,31,32,33,34, 34,35. SSM 전기생리학은 표지된 기판의 사용을 필요로 하지 않으며, 고처리량 스크리닝에 적합하며, 관심있는 수송기를 함유하는 프로테오폴좀 또는 멤브레인 소포를 사용할 수 있다. 여기서, 우리는 SSM 기지를 둔 전기생리학이 억제 및 비 억제 특성을 가진 수송기 표적 나노체를 분류하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다. 원칙의 증거로, 우리는 SSM 센서에 프로테오폴좀의 고정을위한 자세한 단계 다음 리포솜에 세균 콜린 수송기의 재구성을 설명합니다. 다음으로 는 콜린 수송의 SSM 기반 전기 생리학 측정을 수행하는 방법과 반 최대 유효 농도(EC50)를결정하는 방법에 대해 설명합니다. 그런 다음 SSM 기반 전기 생리학을 사용하여 여러 나노 체를 검사하고 콜린 수송 억제제를 식별하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 선택된 억제 나노체의 절반 최대 억제 농도(IC50)를결정하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>1-옥타데칸네티올 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858-25ML</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 흡착제(폴리스티렌 흡착제 비드)</td><td>BioRad</td><td>#152-3920</td><td></td></tr><tr><td>PD 10 탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>필터 200nm 멤브레인</td><td>Whatman Nucleopore</td><td>WHA800282</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>33539-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8034051000</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecyl-&szlig;-D-maltoside (DDM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850520P-25g</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr><tr><td>(SSM 설정) SURFE2R N1</td><td>Nanion</td><td>----- </td><td></td></tr><tr><td>SURFE2R N1 단일 센서 칩</td><td>Nanion</td><td># 161001</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Polar Lipid Extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>Egg PC L-&alpha;-phosphatidylcholine </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051C</td><td></td></tr></tbody></table>

고체 지원 멤브레인(ssm) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

단일 도메인 항체 (나노 체)는 단백질의 기계론 및 구조 연구에서 광범위하게 사용되었으며, 그 중 많은 사람들이 수송기와 같은 막 단백질의 억제에 의존하는 임상 치료법을 개발하기위한 도구로 엄청난 잠재력을 제기합니다. 그러나, 수송 활동의 억제를 결정하는 데 사용되는 대부분의 방법은 고처리량 루틴에서 수행하기 어렵고 라벨이 부착된 기판 가용성에 의존하여 대형 nanobody 라이브러리의 스크리닝을 복잡하게 만듭니다. 고체 지원 멤브레인 (SSM) 전기 생리학은 전기 수송기를 특성화하고 수송 운동 및 억제를 측정하는 데 사용되는 고처리량 방법입니다. 여기서 우리는 전기이차 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비억제 나노체를 선택하고 나노체 억제 상수를 계산하기 위해 SSM 계 전기생리학의 구현을 보여준다. 이 기술은 표지된 기판을 사용할 수 없는 수송기를 표적으로 하는 억제 나노바디를 선택하는 데 특히 유용할 수 있다.

SSM 기반 전기 생리학은 전기 수송기의 특성화에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 여기에 제시된 프로토콜에서, 우리는 그들의 억제 및 비 억제 특성에 근거를 둔 이차 수송기 (여기 세균 콜린 symporter)를 표적으로 하는 나노 체를 분류하기 위하여 SSM 기지를 둔 전기 생리학을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술의 가장 유용한 기능 중 하나는 여러 버퍼 조건의 높은 처리량 검사를 허용한다는 것입니다. 이 특별한 특성은 바인더의 선택 후에 나노 바디의 수십에서 구성될 수 있는 nanobody 도서관의 분석에 유익합니다. 표준 실험에서 안정적인 지질 단층이 센서 칩위에 조립됩니다. 콜린 수송기를 포함하는 프로테올리포좀 제제를 적용한 후, 좋은 전도도성 및 커패시턴스에 대한 점검이 수행되어 실험의 성공을 위해 필수적이다. 실험 중에 멤브레인의 무결성이 손상된 경우, 소음이 높은 배경 전류로 인해 쉽게 관찰될 수 있으며, 낮은 소음 조건을 복구하는 것이 다소 어렵기 때문에 새로운 칩으로 변경하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 우리...

나노 바디는 구조 생물학에 있는 중요한 공구이고 치료의 발달을 위한 중대한 잠재력을 포즈. 그러나 억제 특성을 가진 나노 체의 선택은 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 전기막 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비 억제 나노체의 분류를 위한 고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학의 사용을 입증합니다.

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

제시된 프로토콜은 고처리량 스크리닝 및 프로테오폴좀으로 재구성된 전기 수송기를 대상으로 하는 억제 및 비억제 나노체의 식별또는 막 소포에 존재하는 데 사용된다. 특히 라벨이 부착된 기판을 사용할 수 없는 경우 여러 경우에 전송 용하를 설계하는 것이 어려울 수 있습니다. 동일한 전기 생리학이 거의 모든 전기 생성 수송기의 수송에 나노 체의 효과를 연구 할 수 있다면, SSM 전기 생리학은 라벨기판을 필요로하지 않기 때문에.나노 바디는 의학 응용 프로그램에서 그들의 사용에 대 한 조사 되었습니다. 이 기술은 인간 또는 인간 병원체의 특정 전기 생성 수송기를 표적으로 하는 잠재적인 억제제를 스크린하는 것을 도울 수 있습니다. 시작하려면 10개의 깨끗한 튜브를 가지고 각 튜브에 10밀리리터를 전달합니다.활성화 SSM 버퍼를 준비하려면 예상 반 최대 농도 주위에 일련의 농도를 사용하여 기판을 튜브에 추가합니다. SSM 소프트웨어를 시작하고 컴퓨터가 자동으로 초기화하도록 합니다. 데이터에 대한 저장 경로를 설정합니다.확인 버튼을 눌러 확인합니다. 워크플로 옵션에서 표준 초기 세척 프로토콜을 선택하고 실행을 클릭합니다. 다음으로, 소켓에 프로테오올리포좀 코팅 칩을 장착합니다.팔을 움직이면 칩을 잠급다. 장착된 칩을 캡으로 둘러싸습니다. 워크플로에서 CapCom 프로그램을 선택하고 실행하여 전도도 및 커패시턴스를 결정합니다.전도도가 5 나노시멘 미만이고 정전 용량이 측정을 위해 사용하기 전에 15에서 35 nanofarad 사이인지 확인합니다. 활성화 솔루션을 바이알로 전송하고 프로브 샘플러에 버퍼를 배치합니다. 비활성화 버퍼를 저수지로 옮기고 오른쪽의 저장소 위치에 있는 칩 홀더 옆에 놓습니다.세 가지 측정을 수행하고 모든 10개의 버퍼에 대해 다음 활성 버퍼로 이동하는 루프에서 솔루션 시퀀스 또는 BAB 시퀀스 의 순서를 사용하여 워크플로에 대한 프로토콜을 만듭니다. BAB 시퀀스에 대해 초당 200 마이크로리터의 기본 유량을 1초, 1초, 1초 의 흐름 시간을 사용하고 플레이를 클릭하여 측정을 시작합니다. 프로토콜을 저장하고 재생 버튼을 클릭하여 워크플로우를 실행하도록 합니다.그런 다음 단백질이 없는 리포솜을 사용하여 동일한 실험을 수행합니다. 데이터 분석에 기본 소프트웨어를 사용하여 측정된 전류 대 시간을 플롯하고 활성화 버퍼의 추가 범위에서 피크 높이 추정을 위해 함수를 사용합니다. 기판 농도에 대해 피크 전류를 플

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기에서 우리는 electrogenic 막 수송의 특성에 대한 응용 프로그램에 초점을 맞춘 견고한 지원 세포막에 따라 전기 생리학 방법을 제시한다.

전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

많은 치료 응용 프로그램은 신체의 세포 장벽에 걸쳐 약물 사업자와 그들의화물의 안전하고 효율적인 전송을 필요로합니다. 이 문서는 위장 (GI) 상피 세포와 같은 세포 장벽에 걸쳐 약 nanocarriers (나노 결정)의 전송 속도와 메커니즘을 평가하기 위해 설립 방법의 적응을 설명합니다.

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

이 글의 첫 번째 부분에서는 원형질막에서 소포성 Na+/H+ 교환체를 발현하는 돌연변이 세포주를 선택하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 부분에서는 세포 내 pH 측정 및 빠른 이온 흡수를 기반으로 하는 프로토콜을 제공하며, 이는 이러한 교환기의 이온 선택성과 운동 파라미터를 결정하는 데 사용됩니다.

나의 기능적 특성<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

우리는 2 단계 효소 절차를 채택하는 인간 적인 오줌 방광 견본에서 단 하나 신선하게 고립된 분리근 평활근 세포의 제조를 위한 방법을 기술합니다. 얻어진 생존 가능한 DSM 세포는 생리학적 및 약리학적 특성을 밝히기 위해 기재된 암포테리신-B 패치-클램프 전기생리학을 포함하는 다양한 단일 세포 기술에 의해 연구될 수 있다.

9-페난트롤에 민감한 양이온 전류의 특성화를 위해 갓 분리된 인간 분리기 평활근 세포의 준비 및 활용

여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

원형질막에서 트랜스-골지체 네트워크로의 단백질의 엔도사이틱 및 역행성 수송은 막 항상성을 유지하고 신호 전달을 조절하는 데 필수적입니다. 여기에서는 HeLa 세포에서 유도체화된 항-GFP 나노바디를 사용하여 살아있는 세포 현미경으로 막관통 화물 단백질의 엔도사이틱 수송을 이미지화하고 정량화하는 방법을 설명합니다.

배양 세포에서 기능화된 나노바디를 사용한 엔도사이틱 수송의 생세포 이미징

이 프로토콜은 원형질막 단백질의 나노스케일 공간 조직을 해명하기 위한 단일 항체 표지(SAL)를 설명합니다. 단일 분자 수준에서 누적된 항체-에피토프 상호작용을 활용하여 막 SAL(mSAL)은 국소 에피토프 분포를 지도화하는 동시에 천연 세포 환경에서 항체 결합 행동을 포착합니다.

단일 항체 표지를 이용한 막 단백질의 단분자 위치 현미경

배우세요 고체 지원 멤브레인(SSM) 전기생리학을 이용한 수송기 표적 억제 나노체 고속 스크리닝 방법입니다. 라벨 없이 전기생리적 신호로 나노체 효능을 평가하여 IC50을 결정하고 대규모 라이브러리 선별이 가능합니다.

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

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