Name: 고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 고체 지원 멤브레인(SSM) 전기생리학을 이용한 수송기 표적 억제 나노체 고속 스크리닝 방법입니다. 라벨 없이 전기생리적 신호로 나노체 효능을 평가하여 IC50을 결정하고 대규모 라이브러리 선별이 가능합니다.

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취리히 대학의 의학 미생물학 연구소의 세드릭 A. J. 허터와 마르쿠스 A. 시거, 바젤 대학의 바이오젠트럼의 곤잘로 세브레로(Gonzalo Cebrero)에게 합성 나노바디(sybody)의 세대협력에 감사드립니다. 난니온 테크놀로지스의 마리아 바스메스와 안드레 바조네에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (SNSF)(PP00P3_170607 및 NANION 연구 보조금 이니셔티브에서 C.P.에 의해 지원되었습니다.)

<ol><li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+an+antibody+molecule%3A+structure%2C+kinetics%2C+thermodynamics%2C+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641(2017).</li>
<li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216(2020).</li>
<li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li>
<li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF%2C+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296(2017).</li>
<li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Pharmacology+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li>
<li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li>
<li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li>
<li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317(2018).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li>
<li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li>
<li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaLi-H1%3A+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228(2016).</li>
<li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).</li>
<li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li>
<li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li>
<li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li>
<li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li>
<li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li>
<li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4+nanobodies+%28VHH-based+single+variable+domains%29+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187(2015).</li>
<li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li>
<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
<li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li>
<li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li>
<li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+LacY%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li>
<li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+of+electrogenic+sugar%2FH%2B+symport+in+MFS+sugar+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392(2016).</li>
<li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183(2020).</li>
<li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li>
<li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064(2020).</li>
<li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li>
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저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 기술은 전기 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비 억제 특성으로 나노바디를 분류합니다. 기판 수송을 평가하는 것은 프로테오폴솜의 막에 내장된 수송기를 통해 전하의 이동의 검출으로 인해 가능하다. 실험의 설치 중 중요한 단계 중 일부는 리포솜의 활성 단백질의 재구성, SSM 칩에 안정적인 단층의 준비, 바운드 nanobody 분자를 제거하기 위해 세척 프로토콜의 적용 후 초기 조건의 복구입니다. 멤브레인 단백질이 적절한 지질 대 단백질 비율로 재구성되면, 일반 SSM 프로토콜은 네이티브 기판을 사용하여 확립될 수 있다. 단백질이 없는 리포솜을 사용하여 프로테오이좀을 사용하여 측정된 전류에서 빼야 하는 소음 전류를 드러내는 것이 중요합니다. 그러나 노이즈 전류가 너무 크면 다른 지질을 사용하여 단백질 재구성을 시도하거나 이러한 해로운 신호를 최소화하는 완충 조건에 대한 화면을 시도하는 것이 좋습니다. SSM 분석에 대한 조건을 성공적으로 수립한 후 나노바디의 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 나노 바디의 빠른 스크리닝에 ...

항체는 항원 결합을 담당하는 두 개의 동일한 무거운 사슬과 2개의 광사슬로 구성됩니다. 낙타는 기존의 항체1,2에 비해 그들의 cognate 항원에 대해 유사한 친화력을 나타내는 무거운 사슬 전용 항체를 가지고있다. 중형사슬 전용 항체의 단일 가변 도메인(VHH)은 전체 항원 결합 전위를 유지하고 매우 안정적인1,2로나타났다. 이들 분리된 VHH 분자 또는 "나노바디"는 막 단백질생화학과 관련된 연구에서 구현되어 적합성3,4,억제제5,6,안정화 제제7,구조 결정8,9,10을 위한 가젯으로서 적합성3,4 . 나노체는 표적 특이적 나노체를 인코딩하는 B 세포의 사전 농축을 위한 낙타의 예방접종에 의해 생성될 수 있고, 그 다음에 나노드 라이브러리의 복제및 파지 디스플레이에 의한선택(11,12,13)이다. 나노체를 생성하는 다른 방법은 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 또는 효모디스플레이(14,15, 17,17,18,19,20)에의해 라이브러리 및 선택에 의존하는 시험관 내 선택 방법을 기반으로 한다. 이러한 체외 방법은 큰 라이브러리 크기를 필요로하지만 동물 예방 접종을 피하는 혜택을 상대적으로 낮은 안정성으로 단백질을 대상으로 나노 체의 선택을 선호.
나노체의 작은 크기, 높은 안정성과 용해도, 강한 항원 친화성, 낮은 면역원성, 비교적 쉬운 생산, 치료21,22,23의개발을 위한 강력한 후보를 만든다. 특히, 다중 막 단백질의 활성을 억제하는 나노체는 임상적용을위한 잠재적자산이다5,24,25,26. 멤브레인 수송기의 경우, nanobody가 억제 활성을 가지고 있는지 여부를 평가하기 위해, 수송 기판 및 / 또는 공동 기판의 검출을 허용하는 분석기를 개발할 필요가있다. 이러한 소법은 일반적으로 표지된 분자 또는 보편적인 응용 프로그램이 부족할 수 있는 기판 특이적 검출 방법의 설계를 포함한다. 더욱이, 억제 나노체의 식별은 일반적으로 많은 바인더의 선별을 필요로 한다. 따라서, 고처리량 모드에서 사용할 수 있고 라벨이 부착된 기판에 의존하지 않는 방법은 이 선택에 필수적이다.
SSM 기반 전기 생리학은 멤브레인(예: 이온 결합/수송)27,28을통해 전하의 이동을 검출할 수 있는 매우민감하고시간 해결된 기술이다. 이 기술은 이러한 단백질의 상대적으로 낮은 회전율로 인해 다른 전기 생리학 기술을 사용하여 연구하기 어려운 전기 생성 수송기를 특성화하기 위해 적용되었으며,이는 29,30,31,32,33,34, 34,35. SSM 전기생리학은 표지된 기판의 사용을 필요로 하지 않으며, 고처리량 스크리닝에 적합하며, 관심있는 수송기를 함유하는 프로테오폴좀 또는 멤브레인 소포를 사용할 수 있다. 여기서, 우리는 SSM 기지를 둔 전기생리학이 억제 및 비 억제 특성을 가진 수송기 표적 나노체를 분류하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다. 원칙의 증거로, 우리는 SSM 센서에 프로테오폴좀의 고정을위한 자세한 단계 다음 리포솜에 세균 콜린 수송기의 재구성을 설명합니다. 다음으로 는 콜린 수송의 SSM 기반 전기 생리학 측정을 수행하는 방법과 반 최대 유효 농도(EC50)를결정하는 방법에 대해 설명합니다. 그런 다음 SSM 기반 전기 생리학을 사용하여 여러 나노 체를 검사하고 콜린 수송 억제제를 식별하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 선택된 억제 나노체의 절반 최대 억제 농도(IC50)를결정하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>1-옥타데칸네티올 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858-25ML</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 흡착제(폴리스티렌 흡착제 비드)</td><td>BioRad</td><td>#152-3920</td><td></td></tr><tr><td>PD 10 탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>필터 200nm 멤브레인</td><td>Whatman Nucleopore</td><td>WHA800282</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>33539-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8034051000</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecyl-&szlig;-D-maltoside (DDM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850520P-25g</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr><tr><td>(SSM 설정) SURFE2R N1</td><td>Nanion</td><td>----- </td><td></td></tr><tr><td>SURFE2R N1 단일 센서 칩</td><td>Nanion</td><td># 161001</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Polar Lipid Extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>Egg PC L-&alpha;-phosphatidylcholine </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051C</td><td></td></tr></tbody></table>

고체 지원 멤브레인(ssm) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

단일 도메인 항체 (나노 체)는 단백질의 기계론 및 구조 연구에서 광범위하게 사용되었으며, 그 중 많은 사람들이 수송기와 같은 막 단백질의 억제에 의존하는 임상 치료법을 개발하기위한 도구로 엄청난 잠재력을 제기합니다. 그러나, 수송 활동의 억제를 결정하는 데 사용되는 대부분의 방법은 고처리량 루틴에서 수행하기 어렵고 라벨이 부착된 기판 가용성에 의존하여 대형 nanobody 라이브러리의 스크리닝을 복잡하게 만듭니다. 고체 지원 멤브레인 (SSM) 전기 생리학은 전기 수송기를 특성화하고 수송 운동 및 억제를 측정하는 데 사용되는 고처리량 방법입니다. 여기서 우리는 전기이차 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비억제 나노체를 선택하고 나노체 억제 상수를 계산하기 위해 SSM 계 전기생리학의 구현을 보여준다. 이 기술은 표지된 기판을 사용할 수 없는 수송기를 표적으로 하는 억제 나노바디를 선택하는 데 특히 유용할 수 있다.

SSM 기반 전기 생리학은 전기 수송기의 특성화에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 여기에 제시된 프로토콜에서, 우리는 그들의 억제 및 비 억제 특성에 근거를 둔 이차 수송기 (여기 세균 콜린 symporter)를 표적으로 하는 나노 체를 분류하기 위하여 SSM 기지를 둔 전기 생리학을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술의 가장 유용한 기능 중 하나는 여러 버퍼 조건의 높은 처리량 검사를 허용한다는 것입니다. 이 특별한 특성은 바인더의 선택 후에 나노 바디의 수십에서 구성될 수 있는 nanobody 도서관의 분석에 유익합니다. 표준 실험에서 안정적인 지질 단층이 센서 칩위에 조립됩니다. 콜린 수송기를 포함하는 프로테올리포좀 제제를 적용한 후, 좋은 전도도성 및 커패시턴스에 대한 점검이 수행되어 실험의 성공을 위해 필수적이다. 실험 중에 멤브레인의 무결성이 손상된 경우, 소음이 높은 배경 전류로 인해 쉽게 관찰될 수 있으며, 낮은 소음 조건을 복구하는 것이 다소 어렵기 때문에 새로운 칩으로 변경하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 우리...

나노 바디는 구조 생물학에 있는 중요한 공구이고 치료의 발달을 위한 중대한 잠재력을 포즈. 그러나 억제 특성을 가진 나노 체의 선택은 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 전기막 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비 억제 나노체의 분류를 위한 고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학의 사용을 입증합니다.

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

제시된 프로토콜은 고처리량 스크리닝 및 프로테오폴좀으로 재구성된 전기 수송기를 대상으로 하는 억제 및 비억제 나노체의 식별또는 막 소포에 존재하는 데 사용된다. 특히 라벨이 부착된 기판을 사용할 수 없는 경우 여러 경우에 전송 용하를 설계하는 것이 어려울 수 있습니다. 동일한 전기 생리학이 거의 모든 전기 생성 수송기의 수송에 나노 체의 효과를 연구 할 수 있다면, SSM 전기 생리학은 라벨기판을 필요로하지 않기 때문에.나노 바디는 의학 응용 프로그램에서 그들의 사용에 대 한 조사 되었습니다. 이 기술은 인간 또는 인간 병원체의 특정 전기 생성 수송기를 표적으로 하는 잠재적인 억제제를 스크린하는 것을 도울 수 있습니다. 시작하려면 10개의 깨끗한 튜브를 가지고 각 튜브에 10밀리리터를 전달합니다.활성화 SSM 버퍼를 준비하려면 예상 반 최대 농도 주위에 일련의 농도를 사용하여 기판을 튜브에 추가합니다. SSM 소프트웨어를 시작하고 컴퓨터가 자동으로 초기화하도록 합니다. 데이터에 대한 저장 경로를 설정합니다.확인 버튼을 눌러 확인합니다. 워크플로 옵션에서 표준 초기 세척 프로토콜을 선택하고 실행을 클릭합니다. 다음으로, 소켓에 프로테오올리포좀 코팅 칩을 장착합니다.팔을 움직이면 칩을 잠급다. 장착된 칩을 캡으로 둘러싸습니다. 워크플로에서 CapCom 프로그램을 선택하고 실행하여 전도도 및 커패시턴스를 결정합니다.전도도가 5 나노시멘 미만이고 정전 용량이 측정을 위해 사용하기 전에 15에서 35 nanofarad 사이인지 확인합니다. 활성화 솔루션을 바이알로 전송하고 프로브 샘플러에 버퍼를 배치합니다. 비활성화 버퍼를 저수지로 옮기고 오른쪽의 저장소 위치에 있는 칩 홀더 옆에 놓습니다.세 가지 측정을 수행하고 모든 10개의 버퍼에 대해 다음 활성 버퍼로 이동하는 루프에서 솔루션 시퀀스 또는 BAB 시퀀스 의 순서를 사용하여 워크플로에 대한 프로토콜을 만듭니다. BAB 시퀀스에 대해 초당 200 마이크로리터의 기본 유량을 1초, 1초, 1초 의 흐름 시간을 사용하고 플레이를 클릭하여 측정을 시작합니다. 프로토콜을 저장하고 재생 버튼을 클릭하여 워크플로우를 실행하도록 합니다.그런 다음 단백질이 없는 리포솜을 사용하여 동일한 실험을 수행합니다. 데이터 분석에 기본 소프트웨어를 사용하여 측정된 전류 대 시간을 플롯하고 활성화 버퍼의 추가 범위에서 피크 높이 추정을 위해 함수를 사용합니다. 기판 농도에 대해 피크 전류를 플롯하여 비선형 회귀를 통해 기판의 농도 또는 EC50의 절반 최대 효과를 결정합니다.작동하지 않는 SSM 버퍼의 50 밀리리터를 깨끗한 튜브로 옮킨다. 기판 콜린을 5 밀리몰러의 최종 농도에 추가하고 긍정적 인 제어 측정을 위해 이를 사용합니다. SSM 버퍼를 활성화하지 않는 10밀리리터를 깨끗한 튜브로 옮킨다.5 밀리몰라에 기판 콜린을 추가하고 500 나노 몰라 최종 농도에 nanobody. 각 nanobody에 대한 단계를 반복하여 활성 솔루션을 설명하는 대로 준비합니다. SSM 기계를 시작하고 앞에서 설명한 것처럼 프로테오폴솜 코팅 칩의 커패시턴성과 전도도를 측정합니다.나아무도 없이 활성화 용액을 바이알로 옮기고 버퍼를 프로브 샘플러에 배치합니다. nanobody없이 비활성화 버퍼를 저수지로 옮기고 프로브 샘플러에 배치합니다. 그런 다음 활성 및 비활성 용액을 사용하여 나노바디를 포함하는 모든 솔루션에 대해 이 프로세스를 반복합니다.BAB 시퀀스를 사용하여 워크플로에 대한 프로토콜을 만듭니다. 나노체가 없는 버퍼를 사용하여 BAB 서열의 세 가지 측정을 수행하는 루프, nanobody를 포함하는 버퍼를 사용한 BAB 서열의 두 가지 측정, nanobody와의 120초 지연 시간 인큐베이션, nanobody를 포함하는 버퍼를 사용한 BAB 서열의 세 가지 측정을 수행합니다. 워크플로를 저장하고 재생 버튼을 클릭하여 실행하도록 합니다.다음으로, BAB 서열과 5개의 측정 루프를 사용하여 워크플로우를 위한 새로운 프로토콜을 만들어 가역적으로 결합된 나노 바디를 씻어낸다. 워크플로를 저장하고 재생 버튼을 클릭하여 실행하도록 합니다. 측정의 마지막 피크 전류를 초기 기판 전용 측정과 비교합니다.피크 전류가 초기 값에 도달하면 nanobody가 성공적으로 세척되고 초기 조건이 다시 설정되었습니다. 그렇지 않으면 워크플로를 반복하거나 새 칩으로 변경합니다. 각 nanobody 화면에 대한 개별 칩을 사용하여이 프로세스를 반복하거나 동일한 칩을 사용하여 여러 나노 바디로 반복하십시오.데이터 분석을 위해 선호하는 소프트웨어를 사용하여 측정된 전류와 시간을 플롯합니다. 그런 다음 소프트웨어는 정품 인증 버퍼를 추가하는 범위에서 피크 높이 추정을 위한 함수를 자동으로 선택합니다. 진행 기판 전용 측정에 기초하여 피크 전류와 nanobody의 존재를 정규화합니다.히스토그램에서 피크 전류를 플롯하고 억제 나노 체를 식별하기 위해 나노 체의 존재에서 측정 된 피크 전류에 기판 전용 측정의 피크 전류를 비교합니다. 비작동 SSM 버퍼의 50 밀리리터를 깨끗한 튜브로 옮기고 기질 콜린을 5 밀리몰러의 최종 농도에 추가하고 이를 양성 제어를 위한 활성화 솔루션으로 사용합니다. 8개의 깨끗한 튜브에 비작동용액5밀리리터를 추가한 다음, 예상 IC50 범위의 농도에서 튜브에 기질 콜린과 억제 nanobody를 추가합니다.8개의 튜브에 비활성 용액의 10밀리리터를 추가하고 비활성화 버퍼에 대응하는 각 튜브에 억제 nanobody를 추가합니다. SSM 설정을 시작하고 프로테오올리포좀 코팅 칩의 커패시턴성과 전도도를 측정합니다. 나아무도 없이 활성화 용액을 유리병으로 옮기고 프로브 샘플러에 넣습니다.그런 다음 나아무도 없이 비활성화 버퍼를 저수지로 옮기고 오른쪽에 있는 칩 홀더 옆에 있는 저장소 위치에 배치합니다. 나노바디를 포함하는 활성화 및 비활성 솔루션을 바이알로 옮기고 프로브 샘플러에 버퍼를 배치합니다. BAB 시퀀스를 사용하여 워크플로에 대한 프로토콜을 만듭니다.각 농도를 두 번 측정하고, 120초 동안 배양하고, 세 번 더 측정하는 루프를 포함합니다. 데이터 분석에 기본 소프트웨어를 사용하여 측정된 전류 대 시간을 플롯하고 활성화 버퍼의 추가 범위에서 피크 높이 추정에 대한 함수를 선택합니다. 비선형 회귀를 통해 IC50을 결정하기 위해 nanobody 농도에 대한 피크 전류를 플롯합니다.나노체의 스크리닝 중에 사용되는 기판 농도를 결정하기 위해, 전기 생성 수송은 EC50을 결정하기 위해 상이한 기판 농도하에서 측정되었다. 포화 조건에 대응하는 기판 농도, 5 밀리몰어, 선택 및 모든 활성화 버퍼에서 일정하게 유지. 전기원전 수송에 대한 억제 나노체의 효과는 피크 전류의 진폭감소로부터 가시화되었다.nanobody 바인딩을 허용하지 않도록 세척 프로토콜을 실행 한 후, 초기 피크 전류 진폭의 80 ~ 95 %의 회복이 관찰되었다. 비활성 조건에서 활성화 조건으로 변경할 때 이러한 버퍼에 존재하는 나노 체에 의해 중요한 유물 전류가 도입되지 않았습니다. 억제 특성을 가진 나노체를 선택한 후, 개별 나노체에 대한 IC50 값이 결정되었다.나아무도를 포함하는 버퍼와 칩에 프로테올리포좀의 보정을위한 충분한 시간을 제공하는 것이 중요합니다. 바인딩이 되돌릴 수 있기 때문에 버퍼활성화 및 비활성 모두에 아무도 존재할 필요가 없습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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배우세요 고체 지원 멤브레인(SSM) 전기생리학을 이용한 수송기 표적 억제 나노체 고속 스크리닝 방법입니다. 라벨 없이 전기생리적 신호로 나노체 효능을 평가하여 IC50을 결정하고 대규모 라이브러리 선별이 가능합니다.

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