Name: 번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 배우세요 광학 핀셋을 이용한 RNA-단백질 상호작용 연구 방법을. 공초점 현미경과 결합하여 번역 조절 과정에서 RNA 전개 및 결합 사건을 실시간으로 측정하는 실험 프로토콜입니다.

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우리는 아누자 키베와 준 교수 레드몬드 Smyth 비판적으로 원고를 검토해 주셔서 감사합니다. 우리는 전문 기술 지원을 위한 Tatyana Koch에게 감사드립니다. 실험적인 비디오 녹화에 도움을 주신 크리스티나 페카르코바에게 감사드립니다. 우리의 실험실에서 작품은 헬름홀츠 협회에 의해 지원되고 유럽 연구 위원회 (ERC) 그랜트 nr. 948636 (NC에)에서 자금.

1. 샘플 준비
<ol><li>핸들 서열로 작용하는 람다 DNA 단편을 포함하는 벡터내관심서열을 복제한다(도 2)43,50.</li>
	<li>먼저 PCR을 통해 후속 체외 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성한다(도 2B; 반응 1). 이 PCR 단계에서, T7 프로모터는 감각 DNA 분자32,33,43,50의 끝에 추가됩니다. 표 1에 따라 PCR 반응을 설정합니다. 온도 사이클러에서 적절한 사이클로 50 μL 알리코에서 PCR을 실행합니다.</li>
	<li>두 개의 별도의 PCR 반응(표 1, 그림 2B; 반응 2 및 3)으로 핸들을 준비합니다. 먼저 PCR별로 5' 핸들을 생성합니다. 이어서, 3' 핸들을 생성하고 동시에 5'디곡시게닌 라벨프라이머32,33,43,50을 사용하여 디곡시게닌으로 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>PCR 후 실리카 스핀 컬럼을 사용하여 DNA를 정화합니다.</li>
	<li>T7 RNA 폴리머라제(표 2)를 이용한 체외 전사 반응을 수행한다(표 2)32,33,43,50. RNA의 길이에 따라 2-4 시간 동안 37°C에서 반응을 배양한다. 다음으로, 반응에 DNase I를 추가하고 DNA 템플릿을 소화하기 위해 37°C에서 30분 동안 배양한다. 실리카 스핀 컬럼을 사용하여 RNA를 정화합니다.</li>
	<li>5' 핸들(표 3)의 라벨링 반응 동안, T4 DNA 폴리머라세38,50에 의해 핸들의 3'끝에 비오틴-16-dUTP를 추가한다. 1-2 시간 동안 실온에서 반응을 수행하십시오. 그 후 실리카 스핀 컬럼을 사용하여 DNA를 정화합니다. 참고: 5' 핸들은 3'끝(그림 2B)에 레이블을 지정해야 하므로 PCR 중에 레이블을 수행할 수 없습니다.</li>
	<li>상기 에 언급된 성분-5' 손잡이(3'biotin로 표시), 3'핸들(5' 디곡시게닌으로 표시), RNA-1:1:1 어닐링 버퍼(80% 포르마미드, 400mM NaCl, 40m HEPES, pH 7.5, 0.5m EDTA) 및 원하(RNA)에서 1:1:1 m 의 어퍼비로 혼합하여 원하는 RNA(8M EDTA)를 원하는 것으로 나타났다. 어닐링 혼합물을 최대 85°C까지 10분간 가열한 다음 천천히 식힙니다.</li>
	<li>어닐드 샘플을 3M 아세테이트(pH 5)의 1/10 부피와 혼합하고, 3권의 얼음-차가운 에탄올을 혼합하고 -80°C에서 -80°C에서 하룻밤 사이에 -20°C 이상을 배양한다.</li>
	<li>4°C에서 30분 동안 15,000 g 의 × 샘플을 원심분리합니다. 상체를 버리고 진공 상태에서 펠릿 (일반적으로 보이지 않음)을 건조시십시오.</li>
	<li>마지막으로, RNase가없는 물의 50 μL의 펠릿을 다시 중단하고 알리쿼트합니다. 사용 될 때까지 -80 °C에 알리쿼트저장합니다. 단기 저장을 위해 시료도 -20°C로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 악기 설정
참고: 다음 프로토콜은 LUMICKS 회사의 상업용 광학 핀셋 계측기 C-Trap에 최적화되어 있습니다. 따라서 다른 광학 핀셋 계측기를 사용하는 동안 제시된 단계에 대한 조정이 필요할 수 있습니다. 사용하지 않을 경우 기계의 미세 유체 시스템은 표백제 (hypochlorite 용액) 보관되며 사용하기 전에 세척해야합니다.
<ol><li>표백제를 버리고 주사기를 RNase가없는 물 1 mL로 채웁니다.</li>
	<li>0.5M 나트륨 티오술파테의 50μL을 RNase 가 없는 물의 최소 1mL에 추가하고 시스템의 나머지 표백제를 제거하기 위해 시스템(1bar, 적어도 0.5mL)을 철저히 세척합니다.</li>
	<li>주사기에서 티오술파테 나트륨 용액을 버리십시오. 주사기를 신선한 것으로 바꾸고 RNase가 없는 물0.5mL이상으로 시스템을 세척하십시오. 참고: 미세 유체 시스템이 시스템의 기포를 피하기 위해 건조하게 실행되지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>2 방울의 침지 오일 (굴절률 1.33) 또는 목표 위에 약 70 μL의 물을 넣습니다.</li>
	<li>흐름 셀을 유지 프레임 내부에 배치합니다.</li>
	<li>침수 오일 2 방울(굴절률 1.51)을 유량 셀 위에 놓습니다.</li>
	<li>핀셋 머신에서 레이저 장치를 켭니다. 실행되면 소프트웨어 인터페이스의 트래핑 레이저를 100%로 켭니다.</li>
	<li>진단 카메라(Z-finder)를 사용하여, 마이크로 나사를 돌려 굴절 링이 가장 큰 두 번째 반사(인터페이스) 사이의 챔버 의 중간으로 Z축을 조정합니다. 참고: 목표가 측정 챔버에 더 가깝게 이동하고 목표의 초점 평면이 두 단계 사이의 인터페이스를 교차할 때마다 Z 파인더 모드에서 반사를 인식할 수 있습니다. 가능한 4 개의 인터페이스가 있습니다 : (i) 물 / 침수 오일 및 바닥 유리 (ii) 바닥 유리 및 챔버 내부버퍼 (iii) 챔버 내부 버퍼 및 상단 유리 (iv) 상단 유리 및 응축기용 침지 오일.</li>
	<li>응축기 위치(트랩핑 레이저를 약 50%로 설정)를 조정하여 응축기가 측정 챔버 위에 있는 침지 오일을 만지도록 합니다.</li>
	<li>응축기로 천천히 아래/위로 이동하여 초점을 조정하므로 약 10 개의 라이트 밴드가 달 모드 (진단 카메라)에 표시됩니다.</li>
</ol>3. 샘플 측정
<ol><li>시료 구조(0.1%(w/v) AD 비드 서스펜션 +4 μL+4 μL의 샘플과 분석 버퍼(300mM KCl)의 8μL을 가진 비착성 안티곡시게닌 코팅 구슬(AD)을 배양합니다. 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7.6, 0.05% Tween 20, 5 mM DTT) 10-20 분 RT. 인큐베이션 후, 분석 버퍼의 500 μL로 샘플을 희석. 참고: 산소 침전을 첨가하는 것이 좋습니다. 여기서 포도당(8.3 mg/mL), 포도당 산화제(40 U/mL) 및 카탈라아제(185 U/mL)를 포함하는 산소 제거제 시스템이 사용되었다.</li>
	<li>1%의 0.8 μL(w/v) 스트렙타비딘 코팅(SA) 구슬을 1mL의 분석 버퍼와 혼합합니다.</li>
	<li>주사기에서 물을 버리고 주사기를 각각의 서스펜션/솔루션으로 채웁니다. 약 1 바에서 적어도 2 분 동안 씻은 다음 구슬을 잡기 시작합니다. 참고: 실험적인 설정에 따라 다양한 채널 배열이 사용될 수 있습니다(그림 3). 전형적으로, 하나의 유량 채널은 RNA 분자를 운반하는 항 디곡시겐 구슬로 채워져 있다. 두 번째 채널은 스트렙타비딘 코팅 구슬로 채워져 있습니다. 버퍼 채널은 테더를 형성하는 데 사용됩니다. 제4 채널은 RNA 결합 단백질(도 3C)을 로드하거나 대안적으로 RBP를 완충 채널에 직접 첨가할 수 있도록 사용될 수 있다(도 3B).</li>
	<li>구슬을 잡려면 광학 트랩을 서로 분리합니다. 먼저 AD 채널로 이동하여 트랩 1에서 AD 비드를 잡습니다. 다음으로, SA 채널로 무대를 이동하고 트랩 2에 의해 하나의 SA 비드를 잡을 수 있습니다. 참고: 버퍼 및 비드 채널의 인터페이스에 머무르거나 이미 잡힌 비드를 잃지 않도록 하거나 동일한 트랩으로 여러 구슬을 잡지 않도록 하십시오.</li>
	<li>올바른 크기의 구슬이 캡처되면 버퍼 채널로 이동하여 라미나르 흐름을 중지합니다. 다음으로, 트랩 강성을 확인하기 위해 힘 보정을 수행합니다. 각각의 강성 값은 x/y 축에서 10-15% 이상 차이가 없어야 합니다. 참고: 비드 크기에 따라 레이저 전원 또는 레이저 분할 트랩 사이를 조정합니다. 비드 템플릿이 일치하는 한 모든 비드 쌍에 대해 강제 보정을 수행할 필요가 없습니다(유사성 점수 &gt; 0.9). 그러나, 그것은 정기적으로 수행 해야 합니다., 또는 적어도 때마다 분석 조건이 변경 됩니다.</li>
	<li>구슬을 서로 가까이 이동시키고 몇 초 동안 기다린 다음 다시 떨어져 이동하여 밧줄이 형성될 때까지 반복하여 밧줄낚시를 시작합니다. 밧줄 형성은 두 구슬을 서로 떼어낼 때 측정된 힘의 증가를 초래한다. 참고: 여러 테더의 형성을 피하려면 구슬을 너무 가깝게 이동해서는 안 됩니다. 두 구슬 사이의 밧줄을 잡으면서, 밧줄의 품질은 오버 스트레칭 고원을 찾아 확인할 수 있습니다. 고원은 단일 밧줄에 대해 50에서 60 pN 사이여야합니다.</li>
	<li>밧줄을 얻으면 측정을 시작합니다. 다른 측정 설정을 연구 현상에 따라 선택되어야한다 (그림 1B-D). 참고: 일반적으로 실험 의 시작 부분에서, 힘 램프 실험은 밧줄 의 품질을 확인하고 동작을 조사하기 위해 수행됩니다. 그 후, 하나는 또한 상태 전환을 더 연구하기 위해 상수 력 또는 상수 위치 실험을 시작할 수 있습니다. RNA 샘플에서 충분한 수의 측정이 수행되어 그 동작을 결정하면, 표지된 인자를 시스템에 추가하여 공초점 측정을 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>형광 측정을 수행하려면 광학 핀셋 기기에서 공초점 레이저 및 광자 카운터 유닛을 켭니다.</li>
	<li>소프트웨어 인터페이스에서 원하는 파장의 여기 레이저를 켜고 불소에 따라 레이저의 힘을 5% 이상으로 설정합니다. 참고: 저측정하지는 않지만 샘플에 대한 과도한 광손상을 방지하기 위해 여기 레이저의 전력 설정을 0%로 낮춥니다.</li>
	<li>소프트웨어의 이미지 기능을 사용하여 샘플 이미징을 시작합니다. 참고: 잘 초점을 맞춘 이미지를 얻으려면 공초점 현미경 및 광학 트랩의 초점 평면을 정렬해야 합니다. 이를 위해, 블루 레이저 채널에서 폴리스티렌 구슬의 자동 불발성을 사용할 수 있다. 광학 트랩의 초점 평면은 구슬의 이미지가 가장 높은 직경에 도달 할 때까지 z 축에서 위 또는 아래로 이동합니다. 이 위치에서, 구슬 사이에 테더드된 분자로부터의 형광 신호를 측정할 수 있다.</li>
	<li>kymograph 함수를 사용하려면 구슬 사이의 밧줄을 감지할 수 있도록 kymograph 축의 x-y 위치를 지정합니다.</li>
	<li>측정 전반에 걸쳐, 완충 조성물은 구슬을 다른 채널로 이동하거나 미세 유체 시스템에 제공된 버퍼를 변경하여 쉽게 변경할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>원시 데이터 사전 처리<ol>
<li>간단한 스크립트를 사용하여 원시 데이터를 다운샘플링하여 (i) 더 빠른 후속 데이터 처리를 허용하지만 (ii) 여전히 모든 중요한 정보(그림 4A)가 포함되어 있습니다. 일반적으로 100-5000 Hz는 이 목적에 적합합니다. 참고: 광학 핀셋 실험에서 데이터 수집 빈도는 분석에 필요한 것보다 더 높은 경우가 많습니다 - 제시된 실험에서 데이터 수집 빈도는 기본적으로 78 125Hz로 설정됩니다. 저장 공간이 제한되어 있으므로 데이터의 샘플링 속도를 줄이기 위해 편리하고 시간 절약이 가능합니다. 여기서 원시 데이터는 30배로 다운샘플링되었습니다.</li>
		<li>다음으로 신호 필터를 사용하여 신호에서 고주파 측정 노이즈를 줄입니다(그림 4A). 필터 정도 및 컷오프 주파수 매개변수를 적절히 조정하여 다양한 실험의 데이터 출력을 최적화합니다(그림 5). 참고: 신호 필터 중, 버터 워스 필터51 은 가장 널리 사용되는 중 하나입니다. 원시 데이터의 사전 처리를 허용하는 맞춤형 파이썬 스크립트가 추가 데이터에 제공됩니다. 다운샘플링 및 신호 필터링 매개 변수(컷오프 주파수, 필터 정도)는 다양한 실험에 최적화되어야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>강제 램프 데이터 분석을 보려면 다음 단계를 사용합니다.<ol>
<li>힘 궤적 플롯에서 해당 점을 찾거나 사용자 지정 작성된 스크립트를 사용하여 수동으로 단계를 표시합니다. 전개 단계는 포스 거리(FD) 곡선의 거리 증가와 함께 급격한 힘의 하강이 특징입니다.</li>
		<li>전개 이벤트가 표시되면 적절한 모델을 사용하여 FD 곡선의 다른 영역에 적합합니다(그림 4D). 참고: 첫 번째 전개 단계 이전의 영역의 경우 밧줄은 "이중 좌초"로 간주될 수 있으며 일반적으로 확장 가능한 웜 유사 체인 모델(WLC)47,52,53을 사용하여 적합합니다. 첫 번째 전개 사건 이후에 부품은 이중 가닥 뉴클레오티드(handles) 및 단일 가닥 뉴클레오티드(전개된 RNA 분자)의 조합으로 간주됩니다. 따라서 데이터 피팅은 더 복잡합니다 - 일반적으로 2개의 WLC 모델 또는 WLC 및 자유 조인트 체인(FJC) 모델의 조합이 36,39,52로 채용된다. 확장 가능한 WLC 모델에는 등고선 길이(LC)와 지속성 길이(LP)가 두 가지 주 맞춤 매개 변수가 있습니다. 윤곽 길이는 완전히 늘어난 분자의 길이와 지속성 길이에 해당하며 관심 있는 분자의 굽힘 특성을 정의합니다. 모델은 다음 방정식(1)으로 설명할 수 있다. WLC는 서로 다른 매개 변수를 가진 각각의 별도의 모델을 사용해야 하지만 접힌 영역과 전개된 영역의 동작을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. (1) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq01.jpg"> 여기서 x는 확장, LC 는 윤곽 길이, F는 힘, LP 는 지속성 길이, kB 는 볼트만 상수, T는 열역학 온도, S는 스트레치 계수이다. Freely-jointed 체인(FJC)이라고 하는 두 번째 모델은 일반적으로 전개된 단일 좌초 영역의 동작을 설명하는 데 사용됩니다. 그것은 중합체의 유사한 매개 변수를 사용하지만 "사슬"의 각 단위를 단단한 막대로 취급하며, 여기서 전개 된 단일 좌초 영역의 뉴클레오티드에 해당합니다. 다음 방정식(2)은 이 모델을 설명합니다. (2) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq02.jpg"> 참고: 우리 연구소는 최근 "실용적인 광학 핀셋 분석 TOol (감자)54"라는 원시 힘 램프 데이터의 배치 처리를 허용하는 알고리즘을 개발했습니다. 알고리즘은 데이터를 다운샘플링하고 필터링한 다음 가능한 전개 단계를 식별하고 마지막으로 데이터 피팅을 수행합니다. 감자는 사용자 친화적인 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO)로 구축되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다음과 같이 일정한 힘 데이터를 처리합니다. 참고: 다음 지침은 상수 위치 데이터에 유사하게 적용할 수 있습니다.<ol>
<li>상수 력 데이터의 경우 시간별 거리를 플롯합니다(그림 5). 위치의 상대적 변화에 대한 상이한 적합성의 주파수(counts)를 나타내는 히스토그램은 다양한 지배적및 소소상태를 특성화하는 유용한 방법이다(도 7).</li>
		<li>(여러) 가우시안 함수를 사용하여 히스토그램에 맞게 지정된 힘에서 개별 순응의 전체 비율을 추정합니다(그림 7C). 가우시안은 적합, 평균 위치, 표준 편차는 다른 인구 사이의 힘 관련 관계를 설명합니다. 참고: 상수 데이터의 사전 처리 및 기본 바이모달 가우시안 피팅을 허용하는 맞춤형 파이썬 스크립트가 추가 데이터에 제공됩니다. 매개 변수(차단 주파수, 필터 정도, 예상 수단, 표준 편차 값 및 진폭)는 다양한 실험에 최적화되어야 합니다.</li>
		<li>다음으로, 숨겨진 마르코프 모델을 사용하여 상태를 추가로 분석하여 추가 접이식 중간(conformers)55를 발견할 수 있습니다. 상수력 및 히든 마르코프 모델에 대한 자세한 내용은 55,56,57,58을 참조할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기서는 다양한 리간드를 사용한 RNA 분자의 상호 작용과 동적 행동을 연구하기 위해 형광 결합 광학 핀셋의 사용을 입증합니다. 아래에서 현재 기술의 중요한 단계와 한계에 대해 설명합니다.
프로토콜의 중요한 단계 다른 많은 방법에 관해서는, 샘플의 품질은 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해 중추적 인이다. 따라서 가능한 최고 품질의 샘플을 얻으려면 시료 준비를 위한 절차를 최적화하는 데 시간을 할애할 가치가 있습니다. 최적화 단계에는 적절한 프라이머 설계, 어닐링 온도, RNA 및 단백질 정화 단계가 포함됩니다.
RNase 가 없는 조건을 유지하기 위해서는 실험 전반에 걸쳐 필터링된 팁과 솔루션을 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 미세 유체 시스템은 사용하지 않을 때 표백제에 보관됩니다. 측정을 시작하기 전에 티오술파테 나트륨과 RNase 가 없는 물로 시스템을 적절하게 세척하여 시스템에서 표백제...

MRNAs를 통해 DNA에서 단백질로 유전 정보의 전송은 세포 내의 거대 분자 상호 작용을 통해 모든 수준에서 정확하게 규제되는 복잡한 생화학 과정입니다. 번역 조절을 위해 RNA-단백질 상호 작용은 다양한 자극및 신호1,2에 신속하게 반응하는 중요한 역할을 부여합니다. 일부 RNA 단백질 상호 작용은 mRNA 안정성에 영향을 미치고 따라서 RNA가 번역 활성시간을 변경합니다. 그밖 RNA 단백질 상호 작용은 정지 코돈 판독과 같은 재코딩 기계장치와 연관됩니다, 우회, 또는 프로그램된 리보소말 프레임 변속 (PRF)3,4,5,6,7. 최근에는 다수의 RNA 결합 단백질(RBP)이 자극성 mRNA 원소 및 번역 기계와 상호 작용하여 셀7,8,9,10,11에서 언제 그리고 얼마나 많은 재코딩이 발생할지 지시하는 것으로 입증되었다. 따라서, 번역에서 RNA 결합 단백질의 역할을 해부하고 RNA 구조 및 안정성을 조절하는 방법, 이러한 RNA-단백질 복합체의 상호 작용 원리 및 기계적 특성을 자세히 연구하는 것은 중추적인 것이다.
수십 년의 작업은 속도와 정확성을 달성하기 위해 번역 기계의 RNA와 단백질 구성 요소 사이의 복잡한 통신에 의존하는 다단계 및 다중 구성 요소 번역 과정을 연구하는 토대를 마련했습니다12,13,14. 복잡한 규제 이벤트를 이해하는 중요한 다음 단계 는 고정밀12,15,16,17에서 번역 하는 동안 힘, 기간 및 구조 결정자를 결정 하는. RNA 형태 역학및 특히 번역 도중 RNA 구조 에 작용하는 트랜스 작용 보조 요인의 연구는 광학 핀셋 또는 제로 모드 파도관을 포함하여 단하나 분자 공구의 출현에 의해 더 조명되었습니다16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
광학 핀셋(OT)은 매우 정밀한 단일 분자 기법을 나타내며, 전사를 포함한 많은 종류의 RNA 의존적 동적 공정을 연구하고, 번역26,27,28,29,30,31,32를 연구한다. 광학 핀셋의 사용은 분자 상호 작용, 핵산 구조 및 열역학 적 특성, 운동학 및 이러한 공정의 정력적 16,17,17,22,34,35,35,37,38,38,39의 탐구를 허용했습니다. . 광학 핀셋 분석은 집중 된 레이저 빔과 미세한 물체의 함정을 기반으로합니다. 일반적인 OT 실험에서, 관심 있는 분자는 2개의 투명한 (일반적으로 폴리스티렌) 구슬 사이 테더드됩니다 (그림 1A)27. 이 구슬은 스프링처럼 행동 광학 트랩에 의해 잡힐 수 있습니다. 따라서, 분자상에 가해지는 힘은 집중된 레이저 빔(trap center)의 중심으로부터의 비드변위에 기초하여 계산될 수 있다. 최근에는 광학 핀셋이 공초점 현미경검사(도 1B)와 결합되어 형광 또는 Förster 공명 에너지 전달(FRET) 측정40,41,42를 가능하게 합니다. 이렇게 하면 동시 측정을 가능하게 하는 완전히 새로운 실험 분야가 열리므로 힘 분광법과 형광 데이터의 정확한 상관 관계가 있습니다.
여기서는, 우리는 번역 프레임 이동을 조절하는 단백질-RNA 상호 작용을 연구하기 위하여 공초점 현미경검사법과 결합된 광학 핀셋을 사용하여 실험을 보여줍니다. 목표와 응축기 사이에 5개의 채널이 있는 플로우 셀은 라미나르 흐름을 통해 연속 적인 샘플 응용을 가능하게 합니다. 미세 유체 채널을 통해 다양한 구성 요소를 직접 주입하여 실습 시간을 줄이면서 실험 전반에 걸쳐 샘플 소비가 거의 되지 않습니다.
첫째, OT 실험의 설계를 지원하는 기본 지침이 제안되고 다양한 설정의 함정뿐만 아니라 장점이 논의됩니다. 다음으로, 샘플 및 실험 워크플로우의 준비가 설명되고, 데이터 분석을 위한 프로토콜이 제공됩니다. 예를 나타내기 위해, 우리는 RNA 스트레칭 실험으로부터 얻은 결과를 설명하고, 다른 판독 프레임으로부터 바이러스 RNA의 번역을 변화시키는 아연 핑거 항바이러스 단백질(ZAP)의 짧은 이소폼을 트랜스-작용 인자로 SARS-CoV-2 프레임 이동 RNA 요소(도 2A)를 연구하는 결과를 설명한다. 또한, 형광 라벨리보솜이 OT 공초점 분석에서 사용될 수 있음을 입증하여 번역 기계의 공정성과 속도를 모니터링하는 데 유용할 것입니다. 여기에 제시된 방법은 번역의 다양한 측면을 연구하기 위해 다른 버퍼, 리간드 또는 기타 세포 구성 요소의 효과를 빠르게 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로 일반적인 실험적 함정과 문제를 해결하는 방법에 대해 논의합니다. 아래, 실험 디자인의 몇 가지 중요한 포인트가 설명되어 있습니다.
구성 설계 원칙적으로 OT 호환 RNA 구조를 만드는 두 가지 일반적인 접근 방식이 있습니다. 첫 번째 접근법은 보완적인 DNA 손잡이로 혼성화되는 긴 RNA 분자를 채택하여 중간에 단일 좌초 RNA 서열을 측면시키는 2개의 RNA/DNA 하이브리드 영역으로 구성된 구조를 산출한다(도 2B). 이 접근법은 대부분의 OT RNA 실험에서 33,44,45에 사용됩니다.
두 번째 접근법은 짧은 (약 20 nt) overhangs15,17로 dsDNA 핸들을 활용합니다. 이 돌출은 RNA 분자로 혼성화됩니다. 디자인에서 더 복잡하더라도, dsDNA 처리의 사용은 DNA/RNA 하이브리드 시스템의 몇몇 한계를 극복합니다. 원칙적으로 매우 긴 핸들(>10kb)을 구현할 수 있어 공초점 측정에 더 편리합니다. 또한, RNA 분자는 테더 안정성을 높이기 위해 DNA 손잡이로 회개될 수 있다.
최종 라벨링 전략 구조는 강력한 분자 상호 작용을 통해 구슬에 묶여 있어야합니다. 구슬46에 손잡이의 공유 결합에 사용할 수있는 접근 방법이 있지만, 스트렙타비딘 - 비오틴 및 디곡시게닌 항체와 같은 강력하지만 비 공유 상호 작용은 OT 실험에서 일반적으로 사용된다15,33,35,45. 설명된 프로토콜에서, 구조는 비오틴 또는 디곡시게닌으로 표지되고, 구슬은 디곡시게닌에 대하여 스트렙타비딘 또는 항체로 각각 코팅된다(도 1A). 이 방법은 최대 약 60 pN(밧줄 당)47까지 힘을 적용하는 데 적합합니다. 더욱이, 다른 5' 및 3'라벨링 전략을 사용하면 구슬사이에 형성된 밧줄의 방향을 결정할 수 있다17.
형광 측정을 위한 단백질 라벨링 공초점 화상 진찰을 위해, 형광 표지를 위한 몇몇 일반적으로 이용된 접근이 있습니다. 예를 들어, 형광은 단백질에서 기본적으로 발견되거나 반응성 유기 그룹을 통해 현장 지향 돌연변이 발생에 의해 도입되는 아미노산 잔류물에 공유적으로 부착될 수 있다. 티올 또는 아민 반응성 염료는 각각 시스테인 및 리신 잔류물의 라벨링에 사용할 수 있습니다. 라벨링48,49의 특이성을 증가시키는 몇 가지 가역적인 보호 방법이 있지만, 토착 단백질은 일반적으로 여러 잔류물에서 표지될 것입니다. 형광의 작은 크기는 이점을 부여 할 수 있지만, 비 특이적 라벨은 단백질 활성을 방해할 수 있으며 따라서 신호 강도는 다를 수 있습니다49. 또한 라벨링 효율에 따라 신호 강도는 상이한 실험 간에 다를 수 있다. 따라서 실험 전에 활동 검사를 수행해야 합니다.
관심 있는 단백질에 His-tag 또는 스트렙 태그와 같은 N-또는 C 단말 태그가 포함된 경우 이러한 태그의 특정 라벨링은 또 다른 인기 있는 접근 방식을 나타냅니다. 더욱이, 태그 표적 라벨링은 플루오로포어가 단백질 활성을 방해할 가능성을 감소시키고 용해도를 향상시킬 수 있다49. 그러나 태그별 라벨링은 일반적으로 모노 플루오로포어 표지 단백질을 생성하므로 감지하기가 어려울 수 있습니다. 특정 라벨링의 또 다른 방법은 항체를 채택함으로써 달성될 수 있다.
미세 유체 설정 OT와 미세 유체 시스템의 조합은 다른 실험 조건 사이의 빠른 전환을 허용합니다. 더욱이, 현재 시스템은 유동 방향에 비해 수직 방향으로 다른 채널에서 액체의 혼합을 배제하는 유동 셀 내부의 라미나르 흐름을 유지하는 것을 활용한다. 따라서, 라미나르 유량은 실험 설계에 특히 유리하다. 현재 최대 5개의 채널을 사용하는 유동 셀이 일반적으로 사용됩니다(그림 3).

<table><tbody><tr><td>Bacterial Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli HB101</td><td>lab collection</td><td>벡터</td><td>의 클로닝</td></tr><tr><td>Chemicals and enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31424</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Biotin-16-dUTP</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td>Biotinylation</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>산소 scavanger 시스템</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford Labs</td><td>D11000</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>DNAse I from bovine pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>in vitro transcription</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Th.Geyer</td><td>11786181</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 -알드리치</td><td>E9884</td><td>완충액</td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>11814320001</td><td>완충액</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마 -알드리치</td><td>G8270-1KG</td><td>산소 scavanger 시스템</td></tr><tr><td>포도당 - 산화 효소</td><td>Lumicks</td><td>N / A</td><td>산소 scavanger 시스템</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>HN78.3</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>완충</td></tr>액 <tr><td>Phusion DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Gibson 어셈블리, 클로닝</td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Merck</td><td>529552-1KG</td><td>완충액</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA 중합효소</td><td>Takara Bio Clontech</td><td>R050A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>피로인화효소, 열안정제, 무기</td><td>NEB</td><td>M0296L</td><td>체외 전사</td></tr><tr><td>RNase 억제제</td><td>Molox</td><td>1000379515</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>rNTPS</td><td>life technologies</td><td>R0481</td><td>in vitro transcription</td></tr><tr><td>sodium thiosulophate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6672-500G</td><td>Bleach deactivation</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>컨포칼 측정</td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>비오틴화,</td></tr><tr><td>T5 엑소뉴클레아제</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>Gibson 어셈블리, T7</td></tr><tr><td>RNA 중합효소</td> 복제 사<td>내</td><td>생산 N/A</td><td>체외 전사</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq 리가제</td><td>Biozym</td><td>L6060L</td><td>Gibson 어셈블리, 복제</td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>모놀리식 단백질 라벨링 키트 RED-NHS 2세대(아민 반응성)</td><td>나노템</td>퍼 <td>MO-L011</td><td>리보솜 라벨링에 사용</td></tr><tr><td>Purefrex 2.0</td><td>GeneFrontier</td><td>PF201-0.25-EX</td><td>리보솜 라벨링에 사용</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5' 핸들 T7 포워드</td><td>Microsynth</td><td>맞춤 주문</td><td>5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', PCR 1</td></tr><tr><td>3' handle reverse</td><td>Microsynth</td><td>custom order</td><td>5' -&nbsp에서 OT in vitro transcription template을 생성하는 데 사용됩니다. GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', PCR 1</td></tr><tr><td>5' 핸들 포워드</td><td>Microsynth</td><td>사용자 정의 순서</td><td>5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , PCR 2에서 5' 핸들을 생성하는 데 사용</td></tr><tr><td>5' 핸들</td><td></td><td></td> 5<td>' - CATAAATACCTCTCTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', PCR 2에서 5' 핸들을 생성하는 데 사용</td></tr><tr><td>3' 핸들 포워드</td><td>Microsynth</td><td>사용자 정의 주문</td><td>5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', PCR 3에서 3' 핸들을 생성하는 데 사용</td></tr> 3<tr><td>' 핸들 역방향 5' digoxigenin</td><td>Microsynth</td><td>사용자 정의 주문</td><td>5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', PCR 3</td></tr><tr><td>DNA vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr>에서 3' 핸들을 생성하는 데 사용됨<tr><td>pMZ_OT</td><td>사내에서 생산된</td><td>N/A</td><td>추가 설명 "Cardiovirus 2A 단백질의 구조 연구는 RNA 인식 및 번역 제어를 위한 분자 기초를 밝힙니다" 크리스 H. 힐, 소산 냅틴, 루카스 페카렉, 아누자 키베, 앤드류 E. 퍼스, 스티븐 C. 그레이엄, 네바 칼리스칸, 이안 브라이얼리 bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atom</td><td></td><td>https://atom.io/packages/ide-python N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad</td><td>https://www.graphpad.com/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>InkScape 0.92.3</td><td>https://inkscape.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>감자 https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RNA 구조</td><td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>스파이더</td><td>https://www.spyder-ide.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 코팅 폴리스티렌 입자, 1.5-1.9 &마이크로; m, 5 ml, 1.0% w/v</td><td>Spherotech</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr><tr><td>안티-디곡시제닌 코팅 폴리스티렌 입자, 2.0-2.4 &마이크로; m, 2 ml, 0.1% w/v</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>VWR</td><td>TERUMO SS+03L1</td><td></td></tr><tr><td>Devices</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-trap</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>&nbsp; 컨포칼 현미경과 결합된 광학 핀셋</td></tr></tbody></table>

번역 조절에서 rna 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA는 기능에 필수적인 다양한 구조 접을 채택하여 세포의 다양한 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, RNA의 구조 및 기능은 단백질, 대사산물 또는 기타 RNA와 같은 다양한 트랜스 작용 요인에 의해 변조될 수 있다. 프레임 변속 RNA 분자는, 예를 들면, 다른 개방독서 프레임으로 리보솜을 직접 번역하는 코딩 지구에 있는 규제 RNA이고, 그 에 의해 유전자 스위치로 작동합니다. 그(것)들은 또한 단백질 또는 그밖 트랜스 인자에 결합한 후에 다른 주름을 채택할 수 있습니다. 번역에서 RNA 결합 단백질의 역할을 해부하고 RNA 구조와 안정성을 조절하는 방법을 해부하기 위해 이러한 RNA 단백질 복합체의 상호 작용 및 기계적 특징을 동시에 연구하는 것이 중요합니다. 이 연구는 단일 분자 형광 결합 광학 핀셋을 사용하여 고해상도로 RNA 단백질 복합체의 형성 및 열역학 적 풍경을 탐구하는 방법을 보여줍니다. 예를 들어, ZS-CoV-2 프로그래밍된 리보소말 프레임 변속 요소와 아연 핑거 항바이러스 단백질의 짧은 이소폼을 결합한 상호작용이 정교화된다. 또한, 형광 라벨리보솜은 공초점 유닛을 사용하여 모니터링하여 궁극적으로 번역 신장의 연구를 가능하게 했습니다. 형광 결합 OT 분석은 다양한 RNA 단백질 복합체 또는 번역을 조절하는 트랜스 작용 인자를 탐구하기 위해 널리 적용 될 수 있으며 RNA 기반 유전자 조절의 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

이 섹션에서는, 초점은 주로 형광 광학 핀셋에 의한 RNA 단백질/리간드 상호작용의 측정에 주어집니다. 일반적인 RNA 광학 핀셋 실험 및 해당 대표 결과에 대한 설명을 보려면 see32. RNA/DNA 단백질 상호 작용 에 대한 자세한 논의를 위해 1,26,59,60을 참조하십시오.
원칙적으로, RNA에 대한 관심의 RBP 또는 다른 트랜스 작용 계수의 결합은 분자의 형성을 안정화, 불안정성 또는 변경할 수 있습니다. 아래, 각 효과에 대한 기계적 관찰의 묘사가 표시됩니다. 그러나, 주어진 RNA 단백질 복합체에 대해 관찰된 실제...

이 프로토콜은 광학 핀셋을 사용하여 RNA 단백질 상호 작용을 연구하기위한 완벽한 실험 워크플로우를 제공합니다. 공초점 현미경 검사법과 광학 핀셋의 조합을 포함하여 몇 가지 가능한 실험 설정이 설명되어 있습니다.

번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

다음 방법 문서의 전반적인 목표는 공초점 현미경 검사법과 결합된 광학 핀셋을 사용하여 단백질 또는 기타 요인과의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 유용한 프로토콜을 입증하는 것입니다. 지난 10 년 동안, 단일 거대 분자의 특성을 조사하기 위해 몇 가지 정교한 기술이 개발되었습니다. 이러한 기술 중 하나는 단일 분자 광학 핀셋입니다.새로운 형광 보조 광학 핀셋으로 RNA 분자의 전개에 필요한 힘뿐만 아니라 번역 중 바인딩 이벤트를 자세히 모니터링 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 RNA 분자가 번역을 통제하는 요인을 유무에 관계없이 뻗어 있는 측정에 집중합니다. 또한 라벨이 부착된 리보솜을 사용하여 번역을 모니터링하기 위해 이 기술을 적용할 수 있는 방법을 설명합니다.이 프로토콜은 루카스 페카렉과 스테판 파크의 두 대학원생에 의해 입증될 것입니다. 이 비디오에서는 광학 핀셋 실험의 설정 및 실행을 안내할 것입니다. 또한 간단한 데이터 분석 워크플로우에 대해서도 설명합니다.이 기술의 장점은 간단하고 견고하다는 것입니다. 분자는 레이저 빔의 초점에 묶여 두 구슬 사이에 묶여 있으며, 변위 시 의 변화와 힘은 소위 힘 램프 실험에서 정확하게 측정될 수 있습니다. 테더 내부의 이차 구조는 분자의 내부 에너지에 따라 특정 힘으로 전개됩니다.여러 구조 간의 동적 전환은 일정한 힘 측정을 통해 더 자세히 조사할 수 있습니다. 더욱이, 형광 이미징의 병렬 사용은 실시간으로 결합 이벤트를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 테더의 고유한 힘 거리 프로파일은 안정성에 영향을 미치는 잠재적 인 트랜스태이트 요인을 결합 한 후 달라질 수 있습니다.첫째, 관심있는 RNA는 DNA 벡터로 복제되어야합니다. 이 서열의 상류 및 하류, 추가 부품, 핸들은 구슬 사이의 최종 DNA-RNA 구조를 연결하는 데 필요합니다. 플라스미드의 성공적인 복제 및 증폭 후, 세 가지 다른 PCR 반응이 수행됩니다.각 PCR 반응에 대해 프로토콜의 표 하나에 따라 시약을 혼합합니다. 적절한 열 사이클러에서 50 마이크로리터 알리쿼트에서 PCR을 실행합니다. 첫 번째 는 후속 시험관 내 전사를 위한 T7 프로모터와 함께 전체 구조의 이중 좌초 된 DNA를 초래합니다.두 번째 PCR은 다섯 개의 주요 핸들을 생성합니다. 마지막 반응은 세 가지 주요 핸들을 초래하는 반면. 5 개의 프라임 핸들과 3 개의 프라임 핸들은 사용 된 구슬에 따라 레이블을 지정해야합니다.3개의 프라임 핸들은 PCR 중에 디곡시게닌 라벨이 부착된 역프라이머를 사용하여 표지되며, 5개의 프라임 핸들은 생물성 화를 통해 추가 단계로 레이블을 지정해야 합니다. 5개의 프라임 핸들의 3개의 주요 생체화는 T 40 및 폴리머라제를 사용하여 수행됩니다. 반응은 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 수행됩니다.다음으로, T7 폴리머라제를 사용하여 체외 내 전사를 수행한다. RNA의 길이에 따라 2~4시간 동안 37도에서 반응을 배양한다. 마지막 단계에서, 손잡이는 이중 좌초된 손잡이 사이의 단일 좌초 된 영역을 가진 최종 DNA-RNA 구조를 얻기 위해 시험관 내 전사로부터 RNA로 어닐링된다.원하는 RNA-DNA 하이브리드를 음닐하려면 손잡이와 RNA를 아닐링 버퍼에 섞는다. 열, 10 분 동안 최대 85도의 혼합물을 가열한 다음 샘플을 4도로 천천히 식힙니다. 어닐드 샘플을 3개의 어금니 나트륨 아세테이트의 1/10부와 3권의 얼음 냉간 에탄올을 혼합하고 최소 한 시간 동안 마이너스 80도를 배양합니다.원심 분리시 샘플을 15, 000 xg에서 4도에서 30 분 동안 분리합니다. 상체를 버리고 진공 상태에서 펠릿을 말리십시오. 재부유된 펠릿의 작은 알리쿼트(aliquots)는 액체 질소로 동결되어 사용될 때까지 영하 80도까지 보관됩니다.먼저 주사기에서 표백제를 제거하고 RNase 무료 물 1 mL를 채웁니다. 0.5 개의 어금니 나트륨 티오술파테의 50 마이크로 리터를 추가하고 하나의 바로 시스템을 씻어. 미세 유체 시스템은 시스템의 기포를 피하기 위해 건조하게 실행되지 않도록주의하십시오.다음으로, 나머지 나트륨 티오술파테액을 버리고 주사기를 새로운 것으로 대체한다. 그런 다음 RNase 무료 물 0.5mL 이상으로 다시 씻으십시오. 기계의 광학 시스템을 설정하려면 두 방울의 침지 오일을 목표에 넣습니다.유동 셀을 제자리에 놓고 액체가 유동 셀에 닿을 때까지 목표를 상승시보입니다. 그런 다음 유량 셀 위에 침지 오일 2 방울을 넣습니다. 이제 트랩 스티어링 유닛과 트래핑 레이저를 켭니다.목표는 기계의 진단 카메라의 Z 파인더 도구를 사용하여 조정됩니다. 마이크로 나사를 돌리면 Z 축은 두 번째 와 세 번째 반사 사이의 챔버 의 중간으로 조정됩니다. 굴절 링이 가장 큰 곳입니다.진단 카메라를 달 모드로 전환하고 트래핑 레이저를 약 50 %로 줄인 다음 응축기를 낮추고 위치를 조정하여 약 10 개의 라이트 밴드를 볼 수 있습니다. 측정 챔버에는 5개의 채널이 있으며 실험 전에는 다른 설정 가능성을 고려해야 합니다. 간단한 힘 램프 실험을 위해 구슬 버퍼 구슬은 편리한 채널 배열입니다.형광 리보솜 이나 거래 인자와 같은 네 번째 화합물을 가진 측정의 경우 구슬 구슬 버퍼 계수는 더 나은 배열이지만 구슬을 잡기가 더 어려워집니다. 어닐링 된 구조의 알리쿼트는 3 개의 마이크로 리터 AD 비드 서스펜션, 1 개의 마이크로 리터 RNase 억제제 및 실온에서 분석 버퍼의 8 마이크로 리터로 10 ~ 20 분 동안 배양됩니다. 그런 다음 샘플은 500 마이크로리터 분석 버퍼로 희석되어 각 채널에 넣습니다.두 번째 종류의 구슬의 경우, 분석 구슬의 0.8 마이크로리터는 분석 버퍼의 1mL와 혼합되어 해당 채널로 투여된다. 채널은 열어 저압으로 세척됩니다. 이제 트랩핑 레이저를 켭니다.구슬을 잡기 위해 레이저는 서로 떨어져 이동하고 AD 비드는 함정 하나에 잡힙다. 다음으로 무대는 SA 비드 채널로 이동하고 비드는 트랩 2에 잡힌다. 구슬을 잃지 않도록 하거나 동일한 트랩에서 두 번째 트랩을 잡으려면 스테이지가 버퍼 채널로 이동하고 모든 채널이 닫힙습니다.버퍼에서 트랩 보정이 수행됩니다. 잡힌 구슬은 후속 측정을 위한 시각적 템플릿으로 설정해야 합니다. 그리고 유사성 점수는 비교를 보장하기 위해 측정 사이에 90 % 이상 유지해야합니다.마지막으로 구슬은 서로 더 가깝게 이동하고 하나의 밧줄을 잡기 시작할 수 있습니다. 이것은 몇 초 동안 구슬을 닫은 다음 천천히 구슬을 다시 출발합니다. 밧줄 형성은 두 구슬을 서로 떼어낼 때 측정된 힘의 증가를 초래한다.테더의 수와 품질은 오버스트레칭 고원을 찾아서 확인할 수 있으며, 궤적을 자유롭게 조인트 체인 또는 웜과 같은 체인 모델과 비교할 수 있습니다. 오버 스트레칭 고원은 단일 밧줄에 대한 50 에서 60 피코 뉴턴 사이여야한다. 형광 측정을 수행하려면 공초점 레이저와 광자 수를 단위 및 광학 핀셋 기계에 켭니다.그 후, 원하는 파장 및 소프트웨어 인터페이스의 흥분 레이저를 켜고 불소에 따라 레이저의 힘을 5% 이상으로 설정합니다. 이제 이미징은 소프트웨어의 이미지 또는 kymograph 기능을 사용하여 시작할 수 있습니다. 잘 초점을 맞춘 이미지를 얻으려면 공초점 현미경과 광학 트랩의 초점 평면이 정렬되어 있는지 확인하십시오.이를 위해, 블루 레이저 채널에서 폴리스티렌 구슬의 자동 불발성을 사용할 수 있다. 구슬의 자동 불발성이 가장 높은 직경에 도달 할 때까지 광학 트랩의 초점 평면으로 위아래로 이동합니다. 이 위치에서, 테더드 분자에서 일어나는 형광 신호는 검출될 수 있다.두 함수 모두 관심 영역을 선택하는 것이 중요합니다. 측정 버퍼 조성 전반에 걸쳐 구슬을 다른 채널로 이동하거나 미세 유체 시스템에서 제공되는 버퍼를 변경하여 쉽게 변경할 수 있습니다. 광표백을 피하려면 측정하지 않을 때 항상 흥분 레이저를 끕니다.장치에서 원시 데이터 출력에는 많은 노이즈가 자주 포함되어 있습니다. 따라서 분산된 데이터를 추가로 분석하기 위해 먼저 미리 처리해야 합니다. 첫 번째 단계는 낮은 패스 버터 워스 필터로 샘플을 다운하고 데이터를 필터링하는 것입니다, 좋은 결과를 얻었다.힘 경사로 실험의 경우, 전개 이벤트는 웜과 같은 체인 또는 자유롭게 조인트 체인 모델을 사용하여 장착할 수 있는 제1 거리 곡선의 접히고 전개된 영역에 표시되어야 합니다. 상수 력 데이터의 경우, 시간이 지남에 따라 의 거리를 플로팅할 수 있으며 주어진 힘에서 우세한 변형을 정량화하기 위해 히스토그램을 생성하는 것이 유용하다. 여기서 필터 매개 변수는 다른 접이식 상태를 구별하는 데 중요한 것으로 나타났습니다.이 기술로 달성 할 수있는 것을 더 잘 이해하기 위해 몇 가지 대표적인 결과가 표시됩니다. 이것은 힘 램프 실험에서 표준 힘 거리 곡선처럼 보이는 방법입니다. 이 경우 SARS-코로나바이러스-2 프레임 이동 요소를 연구했습니다.우리는 15 피코 뉴턴 주위에 여러 단계에서 전개 관찰. 방향이 반전되고 구슬이 다시 가까워지면 밧줄이 약간 낮은 힘으로 다시 접습니다. 아연 손가락 항바이러스 단백질 ZAP의 존재에서 동일한 RNA를 측정했을 때, 유사한 전개 패턴이 관찰되었다.그러나 RNA의 이차 구조는 다시 접지하지 않았다. 이것은 단백질 결합이 RNA 운동학에 미칠 수 있는 어떤 큰 영향을 보여주기 위하여 좋은 보기입니다. 일정한 힘 데이터를 살펴보면 전개되는 운동학을 더 조사할 수 있습니다.시간이 지남에 따라 거리는 다른 힘에 대한 플롯과 다른 관찰 상태의 히스토그램이 오른쪽에 추가됩니다. 10 piconewton에서, RNA는 접힌 상태에 완전히 이다. 11.5 piconewton에서 그것은 상태 사이 전환, 그리고 13 piconewton에서 RNA는 전개 된 상태에서 영구적으로.그러나, SARS-코로나바이러스-2 프레임 이동 소자를 ZAP와 함께 측정했을 때, RNA는 11 piconewton에서 완전히 전개된 상태에 있었고, 심지어 10 piconewton에서 접힌 상태로 거의 전환되지 않았다. 이는 ZAP가 단일 좌초프레임 이동 요소에 바인딩되어 보조 구조의 형성을 방지한다는 것을 나타냅니다. 마지막으로, 우리는 공초점 현미경 검사법과 결합된 몇몇 광학 핀셋 데이터를 볼 것입니다.이 실험에서, 형광염은 이중 가닥 핵산을 라벨을 붙이는 데 사용되었으며, 이는 특별히 증가하는 힘으로 비하여 사용되었다. kymograph는 구슬이 서로 떨어져 이동함에 따라 형광 강도가 증가하고 밧줄이 너무 많이 뻗어 나면 완전히 사라진다는 것을 보여줍니다. 마지막 그림에서 형광으로 표시된 리보솜은 채널 4를 통해 첨가되었다.본 실험에서 RNA 밧줄에 특이적인 리보솜 결합이 관찰되었다. 이 비디오가 광학 핀셋에 대한 통찰력을 주었고 이 놀라운 기술을 수행할 수 있는 것이 무엇인지 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 mRNA에서 아데닐레이트-우리딜레이트-풍부 요소(ARE) 염기서열과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질(RBP)을 식별하기 위한 체외 RNA 풀다운 분석을 보여줍니다. 세포 용해물의 표적 RBP는 RNA 프로브와 혼합되어 RNA 단백질 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 RNA 프로브의 desthiobiotin 라벨과 streptavidin-labeled magnetic bead의 친화성을 활용하여 친화성 정제를 통해 분리됩니다.

친화성 추출을 통해 RNA 결합 단백질을 분리하기 위한 RNA-단백질 풀다운 분석

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

광학 핀셋은 5' 및 3' 말단에서 개별 분자를 늘려 RNA 접힘을 연구하는 데 사용되었습니다. 여기에서는 핀셋을 위한 RNA 분자를 합성하고, 기기를 보정하고, 단일 분자를 조작하는 방법을 설명하는 일반적인 절차에 대해 설명합니다.

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

Toeprinting 목표 체 외에서 의 능력을 측정 하는 다양 한 조건에서 리보솜과 양식 번역 개시 복합물에 RNA를 복사할 수 있습니다. 이 프로토콜 toeprinting 포유류 RNA에 대 한 메서드를 설명 하 고 모자-종속 및 IRES 기반 번역 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

이 방법에서, 우리는 세균 세포에서 단순, 살아있는, 리포터 분석법을 사용하여 동축 및 비동종 결합 부위에 RNA 결합 단백질(RBPs)의 결합 친화도를 정량화한다. 분석은 기자 유전자의 억압에 근거를 둔다.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

이중 DNA 눈자 분석은 형성된 DNA-mRNA 이중의 해리력에 의존하는 리보솜 전좌 동안 mRNA 위치를 결정하기 위하여 개발됩니다. 단일 뉴클레오티드 분해능과 mRNA의 양 단에 도달하는 기능을 통해 리보솜 전좌에 대한 기계적 통찰력을 제공하고 다른 핵산 변위를 조사할 수 있습니다.

단일 뉴클레오티드 해상도로 리보솜 전좌의 메커니즘을 연구하는 이중 DNA 통치자

단일 분자 형광 에너지 전달은 리보소말 단백질 합성 시 tRNA 역학을 추적하는 방법입니다. 개별 리보솜을 추적함으로써, 불동성 집단 집단이 식별되어 메커니즘에 빛을 비추게 됩니다. 이 방법은 다른 많은 복잡한 생물 시스템에서 동적 기능 관계를 밝히기 위해 일반적으로 생물학적 형성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 분자 방법은 평균 효과로 인해 기존의 앙상블 방법에 의해 접근할 수 없는 비비율 제한 단계 및 낮은 인구밀도키 중간체를 관찰할 수 있다.

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

여기에서 우리는 인간 세포의 총 단백질 추출물, 비오티닐화 RNA로 코팅된 스트렙타비딘 비드 및 질량 분석 분석을 사용하여 특정 RNA 서열의 단백질 상호작용자를 발견, 정량화 및 검증하기 위한 최적화된 시험관 내 방법을 제시합니다.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

배우세요 광학 핀셋을 이용한 RNA-단백질 상호작용 연구 방법을. 공초점 현미경과 결합하여 번역 조절 과정에서 RNA 전개 및 결합 사건을 실시간으로 측정하는 실험 프로토콜입니다.

번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

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