Name: 1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보라산염(CDAP)을 이용한 용용다당류의 활성화 및 융합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 배우세요 CDAP을 이용한 용용다당류 활성화 및 융합 방법을 통해 백신과 진단 시약 개발을 위한 효율적인 다당류-단백질 결합 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 75% 이상의 높은 결합 수율을 제공합니다.

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<ol><li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEllis%2C+RW+%22Development+and+clinical+uses+of+Haemophilus+B+conjugate+vaccines%22">Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines</a>. , CRC Press. (1994).</li>
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</ol>

앤드류 리스는 피나 바이오솔루션스의 창립자이자 소유주입니다. 그는 CDAP 화학과 관련된 여러 특허를 보유하고 있으며 화학 및 CDAP 융합 노하우의 라이센스혜택을 보유하고 있습니다.

CDAP는 다당류를 유도하고 컨쥬게이트하는 편리한 시약입니다. 이 문서에서는 CDAP를 사용하여 히드라지드(PS-ADH)로 다당류를 유도하고 최근에 발표된 개선사항 8을통합하는 일반적인 방법을 설명합니다. 첫째, 이 기술은 활성화 공정을 제어하기 위해 대상 pH를 유지하는 것의 중요성을 강조한다. 많은 일반적인 버퍼가 CDAP 활성화 반응을 방해하지만 DMAP을 pH 8을 관리하는 버퍼로 성공적으로 사용할 수 있음을발견했습니다. 또한 DMAP은 이미 CDAP 활성화의 반응 부산물입니다. 마지막으로 CDAP를 추가하기 전에 DMAP로 다당류 용액을 버퍼링하면 반응 pH의 정밀한 타겟팅 및 유지 관리가 용이합니다. 우리가 설명하듯이, 농축된 DMAP 스톡 솔루션의 pH를 조정하여 희석시, 표적 pH에 도달하는 것이 유용하다. 둘째, 추위 에 과정을 수행하면 반응 시간이 느려졌고 활성화 과정이 덜 열광적이고 용서합니다. 낮은 온도는 CDAP 가수분해의 속도를 감소시키고, pH 9에서 최적의 활성화 시간이 ~3분에서 ~15분으로 증가합니다. 또한 실온에서 수행될 때보다 동일한 수준의 활성화를 달성하기 위해 CDAP가 적습니다. 
ADH-파생다당류는 카보디미드(예를 들어, EDAC)7을이용하여 단백질에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 여러 허가된 혈우병 인플루엔자 b(Hib) 백신은 EDAC를 사용하여 파상풍톡소이드를 컨쥬게이트하기 위해 ADH와 함께 파생된 폴리리보실리비톨포스페이트(PRP)를 사용한다. CNBr은 처음에 고용되었지만 CDAP는 이 목적을 위해 사용하기가 훨씬 쉽습니다. 우리의 경험에서, ADH 파생을 위한 좋은 표적 범위는 100 kDa polysaccharide 또는 ~1-3% ADH 당 10-30 히드라지드 입니다 무게에 의해. 
동일한 프로세스는 디아민에 대 한 ADH를 대체 하 여 기본 아민으로 다 당 산화를 유도 하는 데 사용할 수 있습니다. 헥산 디아민을 사용하여 아민8로다당류를 유도하는 것이 좋습니다. 아미네이트 다당류(PS-NH2)는단백질유도제(11)를위해 개발된 시약을 사용하여 공주할 수 있다. 전형적으로, PS-NH2는 말레니드(예를 들어, succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) 또는 N-γ-maleimido부트리닐 옥시스쿠치니미드 에스테르 (GMBS) 및 단백질은 succinimidyl 3-(2-pyriddithio)로 티오(예: 2-pyriddithio)를 함유하고 있습니다. 틸-말레니드 화학은 매우 효율적입니다.
단백질은 또한 리신에 있는 아민을 통해 CDAP 활성화 된 다당류에 직접 결합 될 수 있습니다. 사용되는 활성화 프로토콜은 일반적으로 여기에 기재된 것과 유사하지만, 단백질:다당류비5,6,8뿐만아니라 활성화, 다당류 및 단백질 농도의 수준을 최적화할 필요가 있다.
Dextran은 하이드록실 그룹의 상대적으로 높은 밀도로 인해 CDAP로 활성화하는 가장 쉬운 다당류 중 하나이지만 Vi 항원과 같은 일부 다당류는 어려울 수 있습니다. 따라서, 단백질에 직접 CDAP 연상을 위한 단일 "최고" 프로토콜이 없습니다. 먼저 히드라지드 파생의 정도에 의해 결정된 바와 같이 적절한 수준의 활성화를 달성하기 위한 프로토콜을 개발한 다음 CDAP 활성화 다당류로 단백질 컨쥬게이션을 직접 진행하는 것이 좋습니다.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Hydrazide standard curve, resorcinol assay graphs, tabulated data for glucose and dextran analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Resorcinol/sulfuric acid assay graph and table; hydrazide TNBS standard; data comparison." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

담즙 단백질에 동적으로 연결된 다당류로 구성된 컨쥬게이트 백신은 박시가지1,2의놀라운 발전 중 하나이다. 다당류는 T 세포 독립적 인 항원으로서 유아의 면역 원화가 좋지 않으며 항체3의메모리, 클래스 스위칭 또는 친화성 성숙을 유도하지 않는다. 이러한 단점은 다당류 컨쥬게이트 백신4에서극복된다. 대부분의 다당류는 연상에 편리한 화학 적 손잡이가 없기 때문에 먼저 반응성 또는 "활성화"해야합니다. 활성화된 다당류는 단백질(또는 변형된 단백질)과 직접 연결되거나 컨쥬게이션4전에 추가 적인 파생을 위해 기능화된다. 대부분의 허가 된 다당류 컨쥬게이트 백신은 다당류 하이드록실을 활성화하기 위해 환원 아미네이션 또는 시안화를 사용합니다. 이전에 크로마토그래피 수지 활성화에 사용되었던 시약인 시아노겐 브로마이드(CNBr)는 처음에는 다당류 발출에 사용되었습니다. 그러나, CNBr은 높은 pH를 필요로, 전형적으로 ~ pH 10.5 이상, 부분적으로 탈화 다당류 하이드록실을 필요로하기 때문에 그들은 충분히 뉴클레오필로시아노 그룹을 공격한다. 높은 pH는 기저음 파수성 에타카라이드에 해로울 수 있으며, CNBr이나 활성 시아노 에스테르가 처음에 형성되지 않은 것은 이러한 높은 pH에서 충분히 안정되지 않는다.
CDAP (1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보산염; 그림 1) 리외에 의해 도입된 것은 다당류의활성화를 위한 원안제제로서 사용하기 위해5,6. 결정적이고 다루기 쉬운 CDAP는 CNBr보다 낮은 pH에서 다당류를 활성화하고 측면 반응이 적다는 것을 발견했습니다. CNBr과 달리, CDAP 활성화 다당류는 단백질에 직접 컨쥬게이트되어 합성 과정을 단순화할 수 있습니다. CDAP 활성화 다당류는 아미노 또는 하이드라지드-파생다당류를 만들기 위해 디아민(예를 들어 헥산 디아민) 또는 디하이드라지드(예: 아디픽 디하이드라지드, ADH)로 기능화될 수 있다. 다당류의 교차 연결을 억제하기 위해 호모기능 시약의 고농도가 사용됩니다. 아미노 다당류는 단백질 융합에 사용되는 무수한 기술을 사용하여 공주 할 수 있습니다. 히드라지드-파생다당류는 종종 카르보디미드 시약을 사용하여 단백질과 결합된다(예를 들어, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필))carbodiimide (EDAC))7. CDAP 다당류 활성화의 추가 최적화는 Lees etal.8에 의해 설명되었으며 여기에 기재된 프로토콜에 통합된다.
CDAP 컨쥬게이션 개요 CDAP 프로토콜은 2상으로 개념화될 수 있다: (1) 단백질 또는 리간드(그림2)를가진 활성 폴리자카라이드의 다당류 활성화 및 (2) 컨쥬게이션. 첫 번째 단계의 목표는 다당류를 효율적으로 활성화하는 반면, 두 번째 단계의 목표는 활성 다당류에 효율적으로 컨쥬게이트하는 것입니다. 활성화된 다당류는 두 단계를 함께 연결합니다. 이 개념화는 각 단계의 중요한 요소에 집중하는 데 도움이 됩니다. 도 2는 가수분해 반응 및 측면 반응과 함께 원하는 활성화 및 결합 반응을 나타내며, 이러한 개념화를 확장한다.
활성화 단계에서, 3개의 주요 관심사는 CDAP 안정성, 다당화물 하이드록실을 가진 CDAP 반응, 및 활성화된 다당류의안정성(도3)이다. CDAP 가수분해는 pH로 증가하며, 활성성 다당류 및 측면 반응의 가수분해와 마찬가지로 증가합니다. 그러나, 다당류를 가진 CDAP 반응은 pH를 증가시킴으로써 촉진된다. CDAP를 통해 다당류를 효율적으로 활성화하려면 1) 다당류와 CDAP 및 2) 시약 및 활성화된 다당류의 가수 분해 및 측면 반응 사이의 균형을 필요로 한다.
Lees외. 5에의해 기술된 원래 CDAP 활성화 프로토콜에서, 다당류의 CDAP 활성화는 버퍼링되지 않은 pH 9 용액에서 실온에서 수행되었다. 활성화의 비율은이 조건 하에서 급속한 것으로 나타났습니다, 활성화는 3 분 안에 완료될 것입니다. 반응은 또한 CDAP의 급속한 가수 분해를 동반하여 완충되지 않은 반응 용액의 빠른 pH 낙하를 일으켰습니다. 이러한 짧은 시간 프레임에서 목표 값에서 반응 pH를 신속하게 올리고 유지하는 것은 어려웠습니다. 설명된 프로토콜에서, 100 mg/mL 스톡 솔루션으로부터 버퍼링되지 않은 다당류 용액에 CDAP를 추가하여 활성화를 수행하였다. pH는 "0.2 M 트리에틸라민의 동일한 볼륨"으로 30 초 후에 제기되었습니다. 수렴되는 단백질은 활성화 반응에 2.5 분 후에 첨가되었다. 특히, 활성화 단계의 pH는 잘 제어되지 않았고 대부분 처음에는 대상 pH를 초과했을 가능성이 큽분. 신속한 pH 조정이 필요한 빠른 반응으로 활성화 프로세스를 제어하기가 어렵고 확장하기가 어려웠습니다.
원래 프로토콜과 달리 여기에 설명된 수정된 프로토콜에는 두 가지 주요 개선 사항이 있습니다. 첫째, 다당류 용액의 pH는 CDAP를 첨가하기 전에 DMAP를 버퍼로 사용하여 표적 활성화 pH에 미리 조정된다. DMAP은 9.5의 pKa를 가지고 있으며 따라서 pH 9 주위에 좋은 버퍼링 전력을 가지고 있으며, 다른 많은 버퍼와달리, DMAP은 CDAP 가수 분해8을촉진하는 것으로 발견되지 않았다. 더욱이, DMAP는 이미 공정 중간이며 따라서 반응 혼합물에 새 성분을 추가하지 않습니다. CDAP를 추가하기 전에 pH를 사전 조정하면 반응 의 시작 부분에 큰 pH 스윙을 제거하고 반응 중에 대상 pH의 보다 효율적인 유지 보수를 가능하게 합니다. 두 번째 개선사항은 CDAP 가수분해의 속도가 실온에서보다 현저히 느린 0°C에서 활성화 반응을 수행하는 것입니다. 0°C에서 시약 반감기가 길어지면, 낮은 온도에서 느린 활성화 속도를 보정하기 위해 활성화 시간이 3분에서 15분으로 증가합니다. 반응 시간이 길수록 반응 pH를 보다 쉽게 유지할 수 있습니다. 0°C를 사용하면 pH 에민감한 다당류의 분해가 느려지므로 이러한 유형의 다당류의 컨쥬게이트를 준비할 수 있습니다. 프로토콜이 개선되면 활성화 프로세스가 열광적이고, 제어하기 쉬워지고, 재현가능하며, 확장이 더 쉬워집니다.
이 문서에서는 0°C에서 다당류의 제어된 CDAP 활성화를 수행하고 지정된 표적 pH에서 활성 다당류의 후속 파생을 수행하기 위한 향상된 프로토콜을 설명한다. 또한 기일루벤젠 설포닉산(TNBS) 분석법은, Qi 외9의방법에 기초하여, 수정된 다당류에 대한 히드라지드 레벨의 판정을 위한 것이다. 레소시놀 및황산(10)에 기초한 육소에 대한 변형된 분석체도 설명되어 있으며, 이는 더 넓은 범위의 다당류를 결정하는 데 사용될 수 있다. CDAP 활성화 및 컨쥬게이션에 대한 자세한 내용은 리더가 이전 간행물5,6,8 을 Lees 등으로 지칭한다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>아디픽산 디하이드라지드</td><td>시그마</td><td>A0638</td><td>MW 174</td></tr><tr><td>아미콘 울트라 15 10 kDa</td><td>밀리포어</td><td>UFC901008</td><td>MW 컷오프는 200 kDa PS 분석 저울</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>에 대해 30 kDa가 될 수 있습니다. <tr><td>자동 적정기 또는 전자 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비커&nbsp; 2-4 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDAP</td><td>SAFC</td><td>RES1458C</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>107700</td><td>MW 122.2</td></tr><tr><td>플레이크 얼음</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl 1 M</td><td>VWR</td><td>BDH7202-1</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 교반 막대</td><td>VWR</td><td>76001-878</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 fuge 튜브 (CDAP용)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td></td><td></td>BDH9286</tr><tr><td>NaOH 1 M</td><td>시그마</td><td>1099130001</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 10 M</td><td>시그마</td><td>SX0607N-6</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 전극</td><td>Cole Parmer</td><td>55510-22</td><td>6 mm x 110 mm 에폭시 단일 접합</td></tr><tr><td>pH 온도 전극</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 및 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>식염수 또는 PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소형 비커 5-20 mL</td><td>VWR</td><td>10754-696</td><td>A 10 mL 비커로 pH 프로브 및 피펫을 위한 공간 허용</td></tr><tr><td>소형 얼음 양동이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소형 주걱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>교반 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resorcinol assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Combitip</td><td>Eppendorf</td><td>10 ml</td><td></td></tr><tr><td>DI water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>Repligen</td><td>132650T</td><td>Spectra/Por 6-8kDa</td></tr><tr><td>투석 튜빙 클립</td><td>Repligen</td><td>142150</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>반복 피펫터</td><td>Eppendorf</td><td>M4</td><td></td></tr><tr><td>Resorcinol</td><td>Sigma</td><td>398047</td><td></td></tr><tr><td>설탕 표준</td><td></td><td>적절한</td><td></td> 경우</tr><tr><td>&nbsp; 황산 75%</td><td>VWR</td><td>BT126355-1L</td><td></td></tr><tr><td>타이머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강>TNBS 분석</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아디픽 디히드라지드</td><td>시그마</td><td>A0638</td><td>MW 174</td></tr><tr><td>붕실케이트 시험관 12 x 75</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td></td></tr><tr><td>붕산나트륨, 0.5M pH 9</td><td>Boston Biologicals</td><td>BB-160</td><td></td></tr><tr><td>TNBS 5% w/v</td><td>시그마</td><td>P2297</td><td>MW 293.17</td></tr></tbody></table>

1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보라산염(cdap)을 이용한 용용다당류의 활성화 및 융합

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

공주 백신은 백신학에서 놀라운 발전입니다. 다당류 컨쥬게이트 백신의 제조를 위해 다당류는 1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보레이트(CDAP)를 사용하여 백신 담체 단백질과 편리하게 기능화되고 연결될 수 있으며, 취급하기 쉬운 시안광과식 시약제입니다. CDAP는 pH 7-9에서 탄수화물 하이드록실 그룹과 반응하여 다당류를 활성화합니다. CDAP의 안정성과 반응성은 pH에 따라 매우 의존적입니다. 반응의 pH는 또한 CDAP의 가수분해로 인해 활성화 하는 동안 감소, 좋은 pH 제어 재현 가능한 활성화에 키를 만든다. 원래 CDAP 활성화 프로토콜은 버퍼링되지 않은 pH 9 솔루션의 실온에서 수행되었습니다.
이러한 조건하에서의 신속한 반응(<3분)과 빠른 cdAP 가수분해로부터의 빠른 pH 낙하로 인해 짧은 시간 내에 표적 반응 pH를 신속하게 조정하고 유지하는 것이 어려웠다. 여기에 설명된 개선된 프로토콜은 CDAP 가수분해를 늦추고 활성화 시간을 3분에서 ~15분으로 연장하는 0°C에서 수행됩니다. 디메틸아미노피리딘(DMAP)은 CDAP 시약을 첨가하기 전에 표적 활성화 pH에 대한 다당류 용액을 미리 조정하는 버퍼로 도용하였다. 느린 CDAP 가수분해 및 DMAP 버퍼의 사용과 결합된 긴 반응 시간을 통해 활성화 프로세스의 전체 기간 동안 활성화 pH를 보다 쉽게 유지할 수 있습니다. 향상된 프로토콜을 통해 활성화 프로세스는 열광적이고 재현가능하며 확장이 더 가능합니다.

CDAP 화학을 이용한 다당류의 활성화 및 파생을 설명하기 위해, dextran은 0.25 및 0.5 mg CDAP/mg dextran에서 활성화되었다. 각 반응에 대해, 물에 10 mg/mL dextran 용액이 얼음에 냉각되었고, 2.5 M DMAP 스톡의 1/10제부(섹션 3에 설명된 대로 제조)가 추가되었다. 최종 용액은 10 μL 알리쿼트에 0.1 M NaOH를 추가하여 pH 9로 가져왔습니다. 용액은 냉각 및 교반, CDAP 첨가, pH는 pH 9에서 0.1 M NaOH의 10 μL 알리쿼트10μL 알리쿼트만 15분 동안 유지하였다.
라벨이 붙은 덱은 6항에 설명된 대로 M NaCl 1, 0.15 M NaCl 및 물에 대해 순차적으로 투석되었다. ADH-dextran은 다음 레소시놀/황산 분석(섹션 7.2)을 사용하여 dextran에 대해 분석하였다. 당 표준으로 포도당을 사용하는 전형적인 표준 곡선은 도 4A에도시된다. 상기 히드라지드 함량은 7.3항에 기재된 TNBS 분석체를 사용하여 결정되었다. 표준으로 ADH를 사용하는 전형적인 히드라지드 표준 곡선은 도 4B에부여된다.
두 단계의 활성화에서 dextran의 활성화에서 대표 계산은 그림 4A,B에표시됩니다. 이 데이터는 도 4C에서각각 7.9.3.4 및 7.9.3.5 항에 설명된 바와 같이 dextran 폴리머의 100kDa 당 히드라지드와 ADH의 중량 퍼센트로 제시된다. CDAP 비율이 두 배로 증가함에 따라 파생정도가 약 두 배로 증가하였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> 그림 1: CDAP의 화학 구조. CDAP = 1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보레산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> 그림 2: CDAP 활성화 및 컨쥬게이션 프로세스. 이 프로세스는 개념적으로 두 단계로 나뉘며, 활성 된 다당류는 둘 다에 공통적으로 공통됩니다. 기본 조건하에서 CDAP는 다당류 하이드록실을 활성화하여 DMAP(반응 1)을 방출합니다. CDAP 가수 분해도 DMAP(반응 3)를 방출한다. 시아노 에스테르가 표시되지만, 이것은 실제 중간되지 않을 수 있습니다. 따라서 중간체는 (CDAP) "활성화된" 다당류라고 합니다. 제1 활성화 단계 동안, 활성화된 다당류는 가수분해(reaction 4) 또는 측면 반응(reaction 5)을 겪을 수 있다. 제2 발생상(reaction2)에서, 활성화된 다당류는 반응 4 및 5 이외에 안정된 이소레아 결합을 형성하기 위해 아민과 반응한다. 약어: CDAP = 1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보산물; DMAP = 4-디메틸아미노피리딘; R-NH2 = 아민. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> 그림 3: CDAP 활성화 및 컨쥬게이션. 이 공정은 CDAP 반응성, CDAP 및 활성화된 다당류의 안정성, 그리고 활성된 다당류의 반응성아민과의 균형을 필요로 한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg"> 그림 4: dextran의 CDAP 활성화에 대한 대표 결과. (A)레소시놀/황산 및(B)TNBS 에 대한 전형적인 표준 곡선. 0.25 및 0.5 mg CDAP/mg dextran으로 활성화 된 dextran에 대한 분석 결과가 표시됩니다. 포도당은 레소시놀 분석의 표준으로 사용되었다. Dextran, mg/mL에서, 어금니 농도를 제공하기 위해 100 kDa로 나뉩니다. 상기 히드라지드 농도는 ADH를 표준으로 사용하여 결정되며, 상기결과는 μM Hz로 발현되고(C) 히드라지드의 계산: dextran 비율. 파생수준은 다른 평균 분자량의 폴리머 간의 비교를 용이하게 하기 위해 100kDa당 히드라지드로 계산되었다. g ADH/g dextran의 %의 중량 비는 ADH에 대한 174 g/mole의 MW를 사용하여 계산하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

단백질과 아민 함유 리간드는 시안화 시약, 1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보레이트(CDAP)에 의해 활성화된 다당류에 공유하여 공유 단백질(ligand)-다당류 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 이 문서에서는 0°C에서 제어된 CDAP 활성화를 수행하고 pH를 다양화하고 활성화된 다당류의 후속 컨쥬게이션을 수행하기 위한 향상된 프로토콜을 설명합니다.

1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보라산염(CDAP)을 이용한 용용다당류의 활성화 및 융합

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

다당류는 단백질에 연결되지 않는 한 면역원성이 좋지 않으며 단백질에 대한 유도 또는 융합을 위해 활성화될 필요가 없습니다. 이 방법에서 CDAP는 모래 를 하는 시약으로 사용됩니다. CDAP는 파생용 다당류 하이드록실을 활성화하거나 백신 또는 진단 시약에 사용하기 위해 단백질과 연결됩니다.CDAP는 주로 다당류 모래 사락 시약으로 시아노겐 브로마이드를 대체했다. CDAP는 더 간단하게 사용하기 쉽고, 더 효율적이며, 시아노겐 브로마이드보다 더 낮은 pH에서 사용할 수 있습니다. 그것은 훨씬 더 나은 활성화 시약입니다.CDAP는 대부분의 다당류와 함께 사용할 수 있습니다. 화학은 단백질에 직접 및 간접적으로 수렴하는 데 사용할 수 있으며 진단 시약을 만드는 데 사용할 수 있습니다. CDAP 활성화 반응은 원래 설명된 바와 같이 매우 빠르고 제어하기 어려웠습니다.여기에 제공된 프로토콜은 화학을 훨씬 쉽게 수행하고 훨씬 더 재현 할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에, 교반하는 동안 디메틸 아미노피리딘 스톡 용액 200 마이크로리터를 첨가하여 다당류 용액의 pH를 9로 조정한다. 활성화의 전체 과정에 대한 얼음 물 욕조에서 반응을 차가운 유지.교반하는 동안 CDAP의 100 마이크로리터를 다당류 용액으로 전송하여 시아노-디메틸아미노피리딘-테트라플루오로보라테 또는 CDAP 활성화를 진행한다. 타이머를 시작하고 전체 활성화 중에 pH 변경 사항을 15분 동안 모니터링합니다. 0.1 어금량 나트륨의 10 마이크로리터 증분을 신속하게 추가하여 대상 pH에서 반응을 유지한다.최적의 활성화 시간에 도달하면 활성 폴리사카라이드에 0.5 개의 어진 이질이 있는 2밀리리터를 한 번에 추가합니다. pH가 수산화 기능화를 위해 필요한 범위에 있는지 확인합니다. 반응 혼합물을 1시간 이상 연속 교반한 후 반응 혼합물을 섭씨 4도로 옮기는다.제품으로부터 ADH 농도를 줄이기 위해 투석 장치를 사용하여 원유 파생 다당류 용액을 투석합니다. 투석에서 파생된 다당류를 회수하고 다당류 및 히드라지드의 농도를 결정하여 다당류 비로 히드라지드를 계산한다. 표준으로 사용할 밀리리터 수정되지 않은 다당류 용액당 1밀리그램을 준비합니다.안정적인 균일 한 온도를 달성하기 위해 최소 1 시간 동안 140섭씨140도로 가열 블록을 예열합니다. 산이 유출되는 경우 난방 블록 아래와 주변의 보호 패드를 사용하십시오. 밀리리터 탄수화물 표준당 1밀리그램의 다양한 볼륨을 트리클리케이트 13x100의 보로실리케이트 테스트 튜브에 추가하고 원하는 표준 농도를 달성하기 위해 물로 100 마이크로리터로 볼륨을 구성합니다.마찬가지로, 3개의 견본관에 파생된 다당류의 5마이크로그램을 포함하는 부피를 추가하여 견본을 설치합니다. 각 튜브에 밀리리터 레소시놀당 갓 준비된 6밀리그램의 마이크로리터 100마이크로리터를 추가합니다. 반복 피터를 사용하여, 각 튜브에 준비된 75% 황산의 300 마이크로리터를 추가하고, 튜브를 적극적으로 소용돌이치며, 튜브를 가리키는 다음, 모든 튜브를 순차적 순서로 꾸준한 속도로 히터 블록에 넣고 즉시 3분 동안 타이머를 설정합니다.3분 만에 튜브를 같은 순서로 제거하고 얼음 수조의 랙에 직접 놓습니다. 얼음 차가운 튜브를 제거하여 실온에 5분 동안 평형화할 수 있습니다. 10mm 길이의 큐벳을 사용하여 430 나노미터의 UV-Vis 분광광미터에서 모든 튜브의 흡광도를 읽어보십시오.분석 반응을 설정하려면 농도가 증가하는 순서대로 튜브 랙에 표지된 표준 튜브를 정렬하고 정렬합니다. 보정된 마이크로파이프를 사용하여 각 해당 튜브에 표준 100 마이크로리터를 추가합니다. 제로 표준의 경우 샘플 버퍼의 100 마이크로리터를 사용합니다.마찬가지로 샘플 튜브를 준비하고 정렬합니다. 그런 다음 보정된 1, 000 마이크로리터 마이크로파이프를 사용하여 모든 분석 튜브에 875 마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다. 분석 반응을 시작하려면 5분 이내에 각 분석 관에 1%트리니로벤젠 설포닉산의 25마이크로리터를 첨가한다.고속으로 2초 동안 분석관을 소용돌이치며, 액체가 튜브 개구부에서 반 인치 높이로 소용돌이치는지 확인합니다. 분석 시작 시간을 기록하고 타이머를 2시간으로 설정합니다. 그런 다음 실온에서 2 시간 동안 분석 튜브 랙을 어둠 속에서 놓습니다.시간이 끝나면 튜브를 소용돌이쳐 데이터 수집으로 진행합니다. ADH dextran은 레소시놀 황산 분석제를 사용하여 dextran에 대해 분석되었다. 설탕 표준으로 포도당을 사용 하 여 전형적인 표준 튜브 플롯 되었다.유도된 다당류 또는 덱스텐의 히드라지드 함량은 TNBS 분석체를 사용하여 결정되었다. 파생수준은 다른 평균 분자량의 폴리머 간의 비교를 용이하게 하기 위해 100킬로톤당 수화물로 계산되었다. 여기에 설명된 프로토콜은 특정 다당류에 맞게 조정되어야 할 수 있다.CDAP 화학은 다양한 컨쥬게이션 시약과 함께 사용하기 위해 다당류를 기능화하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, ELISA에서 사용하기 위해 다당류를 바이오티니트하는 데 사용할 수 있습니다. 단백질은 CDAP 활성화 다당류에 직접 연결될 수 있습니다, 그러나 이것은 일반적으로 특정 polysaccharide를 위한 몇몇 최적화를 요구합니다.컨쥬게이션 수율은 75% 이상일 수 있으며 CDAP 화학의 사용은 인도 혈청 연구소가 만든 것과 같은 저비용 컨쥬게이트 백신을 가능하게 했습니다.

activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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