분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

이 프로토콜에 기재된 지질 이중층 막의 건설은 제약 에이전트, 환경 독성제 및 생물학적 화합물과의 막 상호 작용에 대한 중요한 정보를 얻기 위해 사용될 수 있습니다. 이러한 기술은 다양한 액체 복잡성의 막을 제조하고 막 내의 화합물 투과성, 흡수 및 임베먼트를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면, 깨끗한 유리 사악한에 지질 스톡 솔루션의 적절한 볼륨을 추가하여 수분 후 밀리리터 당 2.5 밀리그램의 최종 소포 농도를 달성하십시오.

질소 가스의 스트림을 사용하여 지질 용액에서 클로로포름을 제거합니다. 클로로폼을 완전히 제거하려면 말린 지질 필름을 진공필름에 적어도 4시간 동안 연결합니다. 건조지질막을 트리스 나트륨 염화환 버퍼의 필수 부피로 재수화하여 밀리리터당 2.5밀리그램의 최종 소포 농도를 산출하고, 약 15~30초 동안 소용돌이를 생성한다.

소포 현탁액을 드라이 아이스가 있는 용기에 넣고 약 30분 동안 얼어 붙을 때까지 옮습니다. 샘플이 완전히 얼어 붙은 후 30 섭씨 에서 40섭씨 급수 욕조에서 서스펜션을 해동하십시오. 해동 된 소포 서스펜션을 소용돌이.

1 밀리리터 이하의 소포를 만들려면 미니 압출기를 얻습니다. 초순수물로 필터 지지체를 미리 적시한 다음 O 링 내부의 멤브레인 지지면에 놓습니다. 두 번째 내부 멤브레인 지원에 대해 반복합니다.

하나의 내부 멤브레인 지지체를 압출기 외부 케이스에 배치합니다. 100나노미터 폴리카보네이트 멤브레인 을 내부 멤브레인 에 배치하여 필터 지지대 위에 직접 배치합니다. 폴리카보네이트 멤브레인을 향한 O 링 및 필터 지지측을 통해 제2 내부 멤브레인 지지체를 압출기 외부 케이스에 배치합니다.

폴리테트라플루오로틸렌 베어링을 리테이너 매듭에 부착하고 압출기 외부 케이스로 닫힙을 나사로 닫습니다. 압출기를 가열 블록에 잘라냅니다. 지질 소포 현탁액을 주사기 중 하나에 적재하고 주사기를 압출기 열 블록에 배치하여 바늘을 압출기의 한쪽 끝에 완전히 삽입합니다.

두 번째 빈 주사기를 반대쪽에 삽입하고 열 블록의 팔 클립을 사용하여 두 주사기를 모두 잠급니다. 소포 현탁액을 빈 주사기에 천천히 밀어 넣은 다음 원래 주사기로 돌아갑니다. 폴리카보네이트 멤브레인을 통과하는 총 21회 동안 20회 더 반복합니다.

지질 소포를 깨끗한 유리 사블으로 옮겨 보관하십시오. 소포의 5~50밀리리터를 돌출하려면 큰 구멍 스크린 지지대, 중앙 디스크, 드레인 디스크 및 폴리카보네이트 멤브레인을 압출기 의 공간에 배치하여 큰 압출기를 조립한다. 4개의 나사를 사용하여 압출기 상부 및 하부 지지대를 연결하고 조입니다.

압출기 유닛을 바닥으로 스크러빙하고 렌치로 조여서 시료 실린더에 부착하여 고정합니다. 샘플 실린더를 초순수물로 채우고 샘플 실린더에 샘플을 추가하기 전에 압출기 장치를 통해 물을 돌출합니다. 지질 소포 서스펜션을 샘플 실린더에 넣고 상단을 닫은 나사로 닫습니다.

샘플이 초당 약 2~3방울의 속도로 압출기 장치에서 물방울을 떨어뜨리기 시작할 때까지 천천히 압력을 증가시면 깨끗한 유리 사악하게 넣습니다. 모든 샘플이 압출되면 질소 공급을 끄고 압력 릴리프 밸브를 천천히 열어 샘플 실린더의 압력을 방출합니다. 지질 소포를 다시 샘플 실린더에 붓고 총 10개의 압출을 위해 이전 단계를 9번 더 반복합니다.

소포 현탁액을 적절한 큐벳에 적재하고 동적 광 산란 기기에 삽입하고 샘플 세부 정보를 입력하고 관련 소프트웨어를 사용하여 측정을 수행합니다. 제타 셀을 샘플 챔버에 놓고 전극이 접촉하고 있는지 확인하여 샘플 홀더 뚜껑을 닫습니다. 관련 소프트웨어에서 샘플 세부 정보를 입력하고 측정을 수집합니다.

실리카 코딩석영액 센서를 유량 모듈에 삽입하여 결정의 T 형상이 모듈의 T 형상과 정렬되고 유동 모듈이 닫히도록 합니다. 여러 챔버가 있는 계측기에서는 추가 이중레이어를 병렬로 형성할 수 있습니다. 유입구와 콘센트 튜브를 유량 모듈 및 펌프에 연결합니다.

튜브를 홀딩 가드에 넣고 분석기 시스템의 뚜껑을 닫습니다. 펌프 의 콘센트에 폐기물 용기를 배치하여 사용 된 솔루션을 수집합니다. 청소를 수행하려면 먼저 펌프를 켜고 유동 속도를 분당 400 마이크로리터로 설정합니다.

유입구 튜브를 초순수 물에 삽입하고 모듈을 통해 5~10밀리리터를 흘릴 수 있습니다. 튜브를 SDS로 전환하고 모듈을 통해 5~10밀리리터를 플로팅합니다. 튜브를 다시 초순수물로 전환하고 모듈을 통해 10~20밀리리터를 플로팅합니다.

마지막으로 남은 솔루션이 수집되지 않고 모듈을 통해 공기를 흐르게 합니다. 유량 모듈에서 센서를 제거하고 초순수로 센서를 헹구는 다. 센서와 유량 모듈을 질소 가스 스트림으로 구동하여 전극이 항상 액체가 없는지 확인합니다.

화학 연기 후드에 실리카 코팅 석영 크리스탈 센서를 자외선 또는 오존 세정 기구에 삽입하십시오. 기기를 켜고 적어도 2 분 동안 치료를 허용하십시오. 센서를 조심스럽게 제거하고 유량 모듈로 반품합니다.

분석기 기기를 켜서 관련 소프트웨어를 연결하고 지지 지질 이중층을 형성하기 위해 원하는 값으로 온도를 설정합니다. 온도가 원하는 입력으로 안정화되도록 허용합니다. 측정을 구성하고 측정을 시작하기 전에 모든 센서 공명 주파수를 찾고 배음 3, 5, 7, 9, 11 및 13에 대한 소멸을 찾습니다.

염화 나트륨이 모듈을 5~10분 동안 흐르도록 허용하여 기준주파수 변경 또는 델타 F 및 방출 변경 또는 액체의 델타 D 값이 안정적으로 유지되도록 합니다. 펌프를 멈추고, 트리스 나트륨 염화나트륨 용액에서 입구 튜브를 제거하고 지질 소포 용액에 조심스럽게 삽입하십시오. 5초 동안 역류하여 입구 튜브에서 기포를 제거한 다음 전진 흐름을 계속합니다.

소프트웨어의 측정을 다시 시작하여 기준선을 0으로 설정합니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 이중층 형성이 실시간으로 관찰될 때까지 지질 소포를 플로우합니다. 그런 다음 지질 소포에서 염화 나트륨 버퍼로 입구 튜브를 변경하려면이 단계를 반복하십시오.

기증자 구획에 지질 용액 5 마이크로리터를 추가하면 0.45 마이크로 미터 의 모공 크기가있는 다공성 폴리 비닐리데네 디플루오라이드 96 우물 멀티 스크린 필터 플레이트입니다. 즉시 인산염 완충식식염 300 마이크로리터를 포함하는 수송 수신기 플레이트인 감수용구에 필터 플레이트를 침수합니다. 수송 기증자 구획에 인산염 완충식식염 200 마이크로리터를 추가합니다.

펌프를 중지하고 지질 소포 용액으로 입구 튜브를 변경하고 이중 층 형성을 관찰하는 이전 단계를 따라, 다음 알파 헬릭 또는 AH 펩티드 솔루션으로 입구 튜브를 변경합니다. 새로운 솔루션 추가에서 주파수 변경 및 소멸 변화가 관찰될 때까지 흐름 모듈에 솔루션을 도입합니다. 펌프를 멈추고 AH 펩타이드가 소포로 10분 동안 배양할 수 있도록 합니다.

입구 튜브를 염화 나트륨으로 전환하고 파열 된 소포에서 AH 펩티드를 제거하기 위해 흐름을 시작하여 지질 이중 층의 성공적인 형성을 초래합니다. 먼저 분자 용매를 플로우한 다음, 인렛 튜브를 관심 분자를 포함하는 용액으로 전환하여 최소 5분 동안 유동한다. 원하는 경우, 흐름을 중지하고 원하는 분자를 포함하는 액체가 바이레이어로 배양할 수 있도록 한다.

인렛 튜브를 분자 용매로 만 변경합니다. 적어도 5분 동안 흐르고, 입구 튜브를 염화나트륨으로 전환하고 적어도 5분간 흐르십시오. 소프트웨어에서 측정을 중지하고 파일을 저장하고 펌프를 중지합니다.

유니지질 일시 중단 된 이중 층 또는 다중 지질 일시 중단 된 이중 층에 대한 이전 단계에 대한 이전 단계에 이어 기증자 필터 플레이트 컴파트먼트에서 PBS를 제거하고 테스트 용액의 200 마이크로 리터로 대체하십시오. PBS 300 마이크로리터가 있는 새로운 운송 수신기 플레이트에 즉시 담급됩니다. 섭씨 25도에서 2시간 동안 부드러운 흔들림으로 잠복한 후 기증자와 수용자 구획에서 150마이크로리터의 용액을 수집합니다.

이 분자의 특성에 따라 적절한 방법을 사용하여 두 샘플모두에서 분자 농도를 측정합니다. 유니지질 계란 PC 소포의 크기, 다각형 및 제타 전위, 그리고 2개의 다중 지질 소포 조성물을 비교하였다. 계란 PC 소포와 멀티 지질 하나의 소포의 크기 분포는 거의 동일했다.

계란과 PC 멀티 지질 1 개의 소포는 음수 충전되었고 멀티 지질 2 개의 소포가 긍정적으로 충전되었습니다. 단지질 계란 PC 소포는 주파수 변화의 감소에 의해 도시된 바와 같이 표면에 쉽게 흡수되고, 소멸 변화의 증가, 그리고 자발적인 파열에 선행됩니다. 다중 지질 소포는 표면에 흡수되지만 소포를 파열시키기 위해 AH 펩타이드를 첨가하여 지질 이중층 형성을 초래합니다.

지원되는 지질 이중층으로, 주파수 변화 및 소멸 변화는 관심있는 화합물의 도입 전후에 분석될 수 있다. 예를 들어, 지원되는 유니와 다층층층의 DEHP 및 환경 독성제의 상호 작용이 조사되었다. DEHP 흡수의 유사한 수준은 두 지질 이중층 유형에 대해 관찰되었다.

그러나, 소멸 변화에 있어서의 차이는 다중 지질 1bilayer에 비해 계란 PC 이중층에 대해 볼 수 있는 더 큰 소멸 변화를 가진 양층 들 사이에서 관찰되었다. 유니 및 다중 지질 1개의 양층 모두에 대해 작은 투과가 관찰되었다. 이 절차에 따라, 지질 이중층을 모방하는 다양한 세포가 제약에서 환경 독성물질에 이르는 화합물과의 분자 상호 작용을 세포없는 선별할 수 있도록 개발될 수 있다.