알레르기 진단을 위한 호염기구 활성화 검사

호염기구 활성화 검사는 약물, 음식 또는 흡입제에 의해 유발 된 반응뿐만 아니라 일부 형태의 만성 두드러기에서 유용한 것으로 밝혀진 IgE 매개 알레르기 반응의 평가를위한 무료 체외 진단 검사입니다. 이 검사는 유세포 분석에 의한 활성화 마커의 측정을 통해 알레르겐 또는 약물 가교 IgE 활성화에 대한 호염기구 반응을 결정하는 것을 기반으로합니다. 호염기구 활성화 검사는 특히 심각한 생명을 위협하는 반응을 경험하는 피험자에서 알레르기 진단을 확인하기 위해 통제된 챌린지 검사를 피하는 데 유용하고 보완적인 도구가 될 수 있습니다.

또한이 검사는 일부 약물 및 알레르겐에만 사용할 수있는 다른 in vitro 방법에 비해 모든 약물 또는 알레르겐에 대한 반응을 분석 할 수 있다는 장점이 있습니다. 검사의 주요 한계는 특히 약물 알레르기에서 최적이 아닌 민감도와 관련이 있습니다. 샘플 추출 후 24 시간 이내에 테스트를 수행해야하며 실험실과 진단 알고리즘 간의 표준화가 부족합니다.

9 밀리리터 헤파린 화 된 튜브에서 말초 혈액을 수집하는 것으로 시작하고 샘플을 로터에 넣어 실험 프로토콜에 필요할 때까지 실온에서 유지합니다. 음성 대조군과 양성 대조군을 위해 각각 2개의 5밀리리터 세포분석기 튜브에 라벨을 붙입니다. 또한 테스트 중인 다양한 알레르겐 또는 약물 농도에 대해 각각 하나의 튜브에 라벨을 붙입니다.

그런 다음 튜브가 미끄러지지 않고 완벽하게 맞도록 튜브를 랙에 놓습니다. 첫 번째 양성 대조군의 경우 0.05%PBS-T에서 N-포르밀메티오닐-류실-페닐알라닌 또는 fMLP의 4 마이크로몰 용액을 준비하여 호염기구의 품질을 확인합니다. 두 번째 양성 대조군의 경우 PBS-T를 사용하여 밀리리터 항 -IgE 용액 당 0.05 밀리그램을 준비하십시오.

자극 완충액 20 마이크로리터당 각각 1 마이크로리터의 CCR3-APC, CD203c-PE, 및 CD63-FITC 항체를 첨가하여 염색 혼합물을 준비한다. 그런 다음 23 마이크로 리터의 염색 혼합물을 각 튜브에 첨가하십시오. 음성 대조군 튜브에 100마이크로리터의 PBS-T를 추가합니다.

양성 대조군 튜브 중 하나에 100 마이크로 리터의 fMLP를 추가하고 나머지 튜브에 100 마이크로 리터의 항 -IgE E를 추가합니다. 100 마이크로 리터의 다른 알레르겐 또는 약물 농도를 추가하고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양하십시오. 배양 후 용혈을 피하기 위해 각 튜브에 100 마이크로 리터의 혈액을 부드럽게 첨가하십시오.

그런 다음 튜브를 부드럽게 와동시키고 중간 교반으로 자동 온도 조절 욕조에서 섭씨 37도에서 25 분 동안 배양합니다. 탈과립을 막기 위해 튜브를 섭씨 4도에서 최소 5 분 동안 유지하십시오. 각 튜브에 2 밀리리터의 용해 완충액을 추가하여 적혈구를 용해시킵니다.

각 튜브를 와동시킨 다음 튜브를 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 300g의 튜브를 5 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 랙을 싱크대로 뒤집어 세포가 튜브 바닥에 남아있는 동안 상층액을 따라 내립니다.

각 튜브에 3 밀리리터의 PBS-T를 추가하여 세포를 씻고 튜브를 와동시킵니다. 동일한 매개 변수 세트를 사용하여 두 번째 원심 분리를 수행하고 랙을 싱크대로 뒤집어 상청액을 따라 내십시오. 그런 다음 유세포 분석까지 빛으로부터 보호 된 섭씨 4도에서 샘플을 유지하십시오.

유세포 분석기를 컴퓨터 소프트웨어에 연결하고 세포 분석기가 준비 될 때까지 기다리십시오. 텍스트 원고에 설명된 대로 템플릿과 기기 설정을 로드합니다. 샘플 수집 프로세스를 시작합니다.

활성화된 호염기구를 선택하려면 먼저 측면 산란-전방 산점도에서 림프구를 게이트합니다. 그런 다음 림프구 집단에서 호염기구를 CCR3+CD203c+세포로 게이트하고 튜브당 최소 500개의 호염기구를 획득합니다. 음성 대조군을 사용하여 CD63 역치를 약 2.5%로 설정하고 샘플을 분석합니다.

IgE 의존성 과민 반응은 알레르겐과 약물을 사용하여 호염기구 활성화 검사 또는 BAT를 수행하여 조사되었습니다. 호염기구 민감도는 50% 호염기구 또는 EC50의 반응을 유도하는 알레르기 농도를 결정하는 데 도움이 되는 여러 감소 알레르겐 농도에서 반응성을 측정하여 분석되었습니다. 먼저, 림프구를 측면 산란-전방 산점도로부터 게이팅하였다.

그런 다음 호염기구를 림프구 집단에서 CCR3+CD203c+세포로 게이트했습니다. 그런 다음 CCR3-CD63 플롯을 사용하여 CD63을 두 약물 및 다른 농도의 알레르겐에 대한 활성화 마커로 사용하여 호염기구 활성화를 분석했습니다. 검사는 신선한 전혈로 수행되며 혈액 추출 후 24 시간 이내에 수행해야합니다.

시험에 사용 된 자극에는 부형제가 포함되어서는 안되며 약물의 화학적 특성을 고려해야합니다. IgE 매개 알레르기 반응의 진단, 또는 sIgE의 측정, 또는 히스타민 방출 검사를위한 다른 추가 시험관 내 방법.