Name: 알레르기 진단을 위한 호염기구 활성화 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 학습하세요 호염기구 활성화 검사를 이용한 알레르기 진단 방법을. 유속 세포 분석술로 IgE 매개 반응을 측정하여 약물 및 식품 알레르기를 평가하고 중증 환자의 유발 시험을 대체하는 데 활용됩니다.

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클라우디아 코라자의 귀중한 영어 지원에 감사드립니다. 이 작업은 MIECO의 보건 연구소 '카를로스 III'(ISCIII) (ERDF가 공동 자금을 지원하는 보조금: "Una manera de hacer Europa"; 보조금 번호 PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 및 레틱 아라디알 RD16/0006/0001; 안달루시아 지역 보건부(보조금 번호 PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID는 임상 조사자(B-0001-2017)이고 AA는 수석 박사후 계약(RH-0099-2020)을 보유하고 있으며, 둘 다 안달루시아 지역 보건부(ESF 공동 자금 지원: "Andalucía se mueve con Europa")의 지원을 받습니다.

의정서 수행은 헬싱키 선언 원칙에 따라 수행되었으며 지역 윤리위원회 (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spain)의 승인을 받았습니다. 모든 피험자는 연구 조사에 대해 구두로 통보 받았으며 해당 정보에 입각 한 동의서에 서명했습니다.
참고: 현재 프로토콜은 저자가 매일 사용하는 BAT 절차에 대해 자세히 설명합니다. 그러나 이것은 표준화 된 방법이 아니며 다른 저자가 발표 한 절차와의 차이점이 있습니다. 주요 프로토콜 변형은 자극 완충액에서 IL-3의 사용, 자극과의 인큐베이션 시간, 호염기구 탈과립을 중지하는 방법 및 유세포 분석 전략과 관련이 있습니다. 더욱이, BAT를 위한 상이한 상업적으로 이용가능한 키트는 제조자에 의해 추천된 특정 프로토콜들을 포함한다.
1. 샘플 준비
<ol><li>9mL 헤파린화 튜브에서 말초 혈액을 수집하고 실험 프로토콜에 필요할 때까지 로터에서 샘플을 실온(RT)으로 유지합니다.</li>
	<li>음성 대조군(튜브 2개), 양성 대조군(튜브 2개) 및 다양한 농도의 알레르겐/약물(테스트한 각 알레르겐/약물 농도당 튜브 1개)에 대해 5mL 세포분석기 튜브에 라벨을 붙입니다. 튜브가 미끄러지지 않고 완벽하게 맞는 랙에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>2 % (v / v) hepes, 78 mg / L NaCl, 3.7 mg / L KCl, 7.8 mg / L CaCl 2, 3.3 mg / L MgCl2, 1 g / L HSA를 포함하는 이중 증류수에 자극 완충액을 준비하십시오. pH를 7.4로 조정하고 IL-3을 2ng/mL로 추가합니다. 보통 100mL를 준비하고 2.5mL 분취량으로 나누어 -20°C에서 동결시킨다.</li>
	<li>PBS-트윈-20 0.05%(v/v)(PBS-T)에서 양성 대조군 준비: 양성 대조군 1, N-포르밀메티오닐-류실-페닐알라닌(fMLP)(4μM), 호염기구의 품질을 확인; 양성 대조군 2, IgE 매개 양성 대조군으로서의 항 -IgE (0.05 mg / mL).</li>
	<li>PBS-T에서 알레르겐 / 약물을 원하는 최종 농도의 2x로 준비하십시오. 참고: 사용되는 최적의 알레르겐/약물 농도는 광범위한 농도를 사용하여, 용량-반응 곡선에 의해, 그리고 동일한 프로토콜 단계139에 따른 세포독성 연구에 의해 미리 결정되어야 한다.</li>
</ol>2. 염색 혼합 준비
<ol><li>형광 색소로 표지된 단클론 항체를 제조업체의 권장 항체 농도 또는 이전 항체 적정에 따라 자극 완충액에 추가합니다. 이 프로토콜에서는 호염기구 식별을 위해 각 항체 (CCR3-APC 및 CD203c-PE)를 1μL를 추가합니다. 호염기구 활성화를 위한 CD63-FITC)자극 완충액 20μL당 140 . 알림: 염색 혼합물 준비를 빛으로부터 보호하십시오.</li>
	<li>각 튜브에 23μL의 염색 혼합물을 추가합니다.</li>
</ol>3. 혈액 자극
<ol><li>튜브 1과 2(음성 대조군)에 100μL의 PBS-T를, 튜브 3에 100μL의 fMLP를, 튜브 4에 100μL의 항-IgE를, 다음 튜브에 다양한 알레르겐/약물 농도 100μL를 추가합니다. 시약을 예열하기 위해 중간 교반이 있는 항온조에서 37°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>용혈을 피하기 위해 각 튜브에 100μL의 혈액을 부드럽게 추가합니다. 튜브를 부드럽게 와동시키고 중간 교반이 있는 자동 온도 조절 욕조에서 37°C에서 25분 동안 배양합니다.</li>
	<li>튜브를 4 ° C에서 최소 5 분 동안 유지하면서 탈과립을 중지하십시오. 참고: 필요한 경우 프로토콜을 4°C에서 30-45분 동안 일시 중지할 수 있습니다.141,142,143.</li>
</ol>4. 적혈구 용해
<ol><li>적혈구를 용해시키기 위해 각 튜브에 2mL의 1x 용해 완충액을 추가합니다. 각 튜브를 소용돌이하고 RT에서 5 분 동안 배양합니다. 참고: 이 단계에서 세포는 완충액에 포함된 고정제(포름알데히드)로 인해 고정됩니다.</li>
	<li>4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 따라 내서 랙을 싱크대로 뒤집습니다. 세포는 튜브의 바닥에 남아 있습니다.</li>
	<li>세포를 세척하기 위해 각 튜브에 3mL의 PBS-T를 추가합니다. 각 튜브를 소용돌이.</li>
	<li>4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 따라 내서 랙을 싱크대로 뒤집습니다. 알림: 유세포 분석기가 획득 될 때까지 빛으로부터 보호되는 샘플을 4 ° C에 보관하십시오.</li>
</ol>5. 유세포 분석 획득
<ol><li>유세포분석기(예: BD FACSCalibur 유세포분석기)로 샘플을 수집합니다. 유세포 분석기를 컴퓨터 소프트웨어에 연결하고 세포 분석기가 준비 될 때까지 기다립니다. 템플릿 및 계측기 설정을 로드합니다(표 1).</li>
	<li>샘플 수집을 시작합니다.</li>
	<li>활성화된 호염기구(139)의 선택을 위해 다음의 세포분석기 전략을 사용한다.<ol><li>측면 산란 (SSC)-전방 산란 (FSC) 플롯에서 림프구를 게이트합니다.</li>
		<li>림프구 집단에서 호염기구를 CCR3+CD203c+ 세포로 게이트합니다. 튜브 당 최소 500 개의 호염기구를 획득하십시오.</li>
		<li>CCR3 - CD63 플롯을 표시하여 활성화 마커로 CD63을 사용하여 활성화를 분석합니다. 음성 대조군 튜브를 사용하여 CD63 음성 역치를 약 2.5%로 설정합니다.</li>
		<li>모든 샘플을 수집합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

BAT는 IgE 매개 알레르기 반응의 평가를위한 보완적인 체외 진단 검사로, 약물, 음식 또는 흡입제와 같은 다양한 유발 요인에 의해 유도 된 반응의 진단뿐만 아니라 일부 형태의 만성 두드러기에서 유용한 것으로 나타났습니다. 일반적으로 i) 알레르겐/약물이 ST에서 위양성 결과를 생성하는 경우 BAT 성능을 고려해야 합니다. ii) 알레르겐 / 약물을 ST 또는 sIgE 정량화에 사용할 수 없습니다. iii) 임상 병력과 ST 또는 sIgE 결정 사이의 불일치가 존재합니다. iv) 증상은 ST가 전신 반응을 유도 할 수 있음을 시사합니다. v) 범인 알레르겐 / 약물 확인을위한 CCT 이전10.
실험 프로토콜과 관련하여 테스트에 적합한 혈액 샘플을 얻기 위해 고려해야 할 여러 가지 중요한 측면이 있습니다. 전신 스테로이드 146 및 경구 코르티코 스테로이드를 포함한 면역 억제제 147은 호염기구 반응 146 (항히스타민 ...

IgE 매개 알레르기 진단은 임상 병력, 피부 검사(ST), 혈청 특이적 IgE(sIgE)의 정량화, 그리고 필요한 경우 통제 챌린지 검사(CCT)1,2,3,4,5,6을 기반으로 합니다. 그러나 정확한 정보가 부족할 수 있으므로 임상 병력을 신뢰할 수 없으며 ST 및 CCT는 심각한 생명을 위협하는 반응을 경험하는 피험자에게 금기 일 수있는 위험이없는 절차가 아닙니다 1,2,3,4,5,6 . 검증되고 상용화된 불소 효소 면역 분석법에 의한 sIgE 측정이 소수의 알레르겐 및 약물에만 사용할 수 있다는 사실과 함께 이러한 문제는 호염기구 활성화 검사(BAT)와 같은 다른 시험관 내 기능 분석의 중요한 역할을 강조했습니다.
호염기구는 알레르겐 / 약물 노출 후 세포 표면의 고 친화성 수용체 (FcεRI)에 결합 된 인접한 sIgE의 가교 결합시 활성화되는 IgE 매개 알레르기 반응에 관여하는 핵심 이펙터 세포입니다. 호염기구 활성화는 세포질 내 분비 과립 7,8,9에 포함 된 미리 형성된 새로운 합성 염증 매개체의 세포 탈과립 및 방출을 유발합니다. BAT는 자극 (알레르겐 또는 약물)의 존재하에 호염기구 활성화를 모방하려고 시도하고 유세포 분석 7,10에 의해 호염기구 활성화 마커의 발현 변화를 결정하는 시험관 내 방법입니다. 호염기구 (IgE +, CCR3 +, CRTH2 +, CD203c +)를 확인하고 형광 색소 표지 항체 7,10의 조합을 사용하여 세포 활성화 (주로 CD63 및 CD203c의 상향 조절)를 측정하는 다양한 전략이 있습니다. 임상적으로 검증된 최고의 활성화 마커 11,12,13,14인 CD63은 히스타민을 함유하는 분비 과립에 고정된 막 단백질로, 세포 활성화 및 과립과 막의 융합 후 호염기구 표면 15,16,17,18,19,20,21 에 발현됩니다. . CD203c는 호염기구에서 구성적으로 발현되고 FcεRI 자극 후에 상향조절되는 표면 마커이며, 이는 또한 BAT 15,22,23,24,25에서 신뢰할 수 있는 결과를 보여주었습니다. 게다가, CD6326과 동시 발현하는 것으로 보인다.
지난 수십 년 동안 BAT는 약물, 음식 또는 흡입제와 같은 다양한 유발 요인뿐만 아니라 아래에 설명된 대로 일부 형태의 만성 두드러기에서 유발되는 IgE 매개 알레르기 반응의 진단에 유용한 것으로 나타났습니다. 그러나 진단 알고리즘에서이 기술의 위치는 매우 다양하고 잘 결정되지 않습니다.
약물 과민증 BAT는 선택된 약물 및 환자, 특히 ST의 진단 가치가 대부분의 약물에 대해 잘 확립되지 않았기 때문에 심각한 반응을 경험하는 사람들에게 보완 검사로서 유용한 것으로 나타났습니다 제한된 수의 약물27,28,29,30에 대해 검증되고 표준화되기 때문입니다. 또한 sIgE의 정량화는 ST 27,28,29,30,31,32보다 민감도가 낮은 제한된 수의 약물에 대해서만 가능합니다. 따라서 약물 과민증의 진단은 일반적으로 약물 도발 테스트에 의존하며, 이는 심각한 생명을 위협하는 반응을 경험하는 피험자에게 금기 일 수 있습니다33.
베타락탐(BL)20,34,35,36,37,38,39, 신경근 차단제(NMBA)19,22,40,41,42, 43,44,45, 플루오로 퀴놀론 (FQ) 46,47,48,49, 피라 졸론50,51,52, 방사선 조영제 (RCM) 53,54,55,56 및 백금 화합물 57,58,59 . BAT는 각각 51.7-66.9 %와 89.2-97.8 % 사이의 민감도와 특이도를 갖는 것으로보고되었습니다. 양성 및 음성 예측값은 각각 93.4% 및 66.3% 사이의 범위로 기재되어있다 27,31. 더욱이, BAT는 약물 탈감작 동안 부작용의 위험이 높은 환자에서 CD63에 비해 CD203c 발현이 증가하기 때문에 백금 화합물로 탈감작하는 동안 획기적인 반응에 대한 예측 바이오마커로서 제안되었다57.
BAT는 반응이 호염기구 탈과립을 수반 할 때 약물 과민증에만 유용하다는 점에 유의해야합니다. 따라서, 사이클로옥시게나제 142의 효소적 억제로부터 발생하는 반응에는 유용하지 않다.
음식 알레르기 BAT는 전체 알레르겐 추출물 또는 단일 알레르겐에 대한 혈청 sIgE의 측정이 종종 모호하기 때문에 식품 알레르기에 대한 잠재적 인 진단 도구로 부상했으며, 이는 약물 과민증과 유사하게 비용이 많이 들고 위험이없는 절차60입니다. 여러 연구에서 우유 61,62, 계란 61,63, 밀 64,65,66,67,68, 땅콩 63,69,70,71,72, 헤이 즐 넛 73,74,75,76과 관련된 결과를 보여주었습니다. ,77, 조개78, 복숭아 79,80,81, 사과 21, 셀러리, 당근82,83.
혈청 내 ST 및 sIgE에 비해 식품 알레르기 진단에서 BAT의 주요 부가가치는 더 높은 특이성과 유사한 민감도를 나타낸다는 것입니다. 따라서 BAT는 임상적으로 알레르기가 있는 환자와 높은 특이도(75-100%)와 민감도(77-98%)63,69,84를 모두 갖는 민감하지만 내성이 있는 피험자를 구별하는 데 유용한 도구입니다. 민감도 및 특이도 값은 알레르겐 및 표현형(예: 구강 알레르기 증후군 대 아나필락시스), 연령 및 지리 관련 감작 패턴과 같은 기타 요인에 따라 달라집니다(63,85).
단일 알레르겐 성분을 사용하는 BAT는 잠재적으로 일부 식품 알레르겐61,80에 대한 진단 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 종자 저장 단백질 (예 : 땅콩의 Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 및 Ara h 6)을 사용한 연구가 있습니다 86; 지질 전달 단백질 (예를 들어, 복숭아로부터의 Prup3 및 땅콩으로부터의 Ara h9)80,86; 및 Bet v 1 동족체 (예 : 땅콩의 Ara h 8) 87. 다른 잠재적 유용성은 꽃가루-음식 알레르기 증후군 21,87,88, 붉은 고기에 대한 알레르기89, 또는 음식-의존적 운동-유도된 아나필락시스(66)의 경우에 범인 알레르겐의 확인과 관련된다.
흥미롭게도 BAT는 땅콩 및 우유 알레르기 환자의 연구에서 관찰 된 바와 같이 더 심한 반응을 가진 환자가 활성화 된 호염기구의 비율이 더 높기 때문에 알레르기 반응의 중증도 및 역치에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다 84,90,91; 미량의 알레르겐에 반응하는 환자는 더 큰 호염기구 민감도 84,90,92를 보입니다. 이러한 데이터는 BAT가 면밀한 추적 관찰 및보다 강화 된 교육이 필요한 고위험 알레르기 환자를 식별하는 데 유용 할 수 있음을 시사합니다93. 더욱이, BAT는 식품 챌린지 반응(70,91,92,94) 및 반응성 임계값(90,95)을 예측하여 식품이 언제 안전하게 (재)도입될 수 있는지를 결정하는 데 도움을 줄 수 있다고 보고 되었다(84). 그러나 이러한 결과는 일부 연구에서 논란의 여지가 있습니다 63,96 더 많은 연구가 필요합니다.
반면에 BAT는 시간이 지남에 따라 자연적으로 또는 면역 조절 치료하에 식품 알레르기의 해결을 모니터링하는 데 사용되어 왔으며, 지금까지 경구 식품 챌린지에 의해서만 평가되었으며 관련 위험 및 비용은 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106입니다. ,107,108. 또한, 오말리주맙 치료 동안 호염기구 활성화가 감소하지만 치료 중단 후 증가함에 따라 식품 알레르기에서 오말리주맙의 효과를 모니터링하는 데에도 사용되었습니다109.
흡입제 알레르기 BAT는 sIgE 정량화 및 ST에 의해 진단이 일상적으로 확립 될 수 있기 때문에 흡입 알레르기에 거의 도움이되지 않습니다. 그러나 국소 알레르기 성 비염 (검출 할 수없는 수준의 sIgE 및 양성 비강 도발 검사가있는 음성 ST)의 경우 BAT는 사례110의 50 %에서 진단을 허용했습니다. 호염기구 민감도와 비강/기관지 도발 검사에 대한 반응, 천식 중증도와 오말리주맙111,112 치료의 효능 사이의 상관관계가 추가로 보고되었습니다.
BAT는 또한 IgG 항체 113,114,115,116,117을 차단하는 간섭으로 인해 면역 요법 동안 호염기구 감수성이 감소함에 따라 집 먼지 진드기 및 꽃가루에 대한 알레르겐 면역 요법을 모니터링하는 데 사용되었습니다.
Hymenoptera독 알레르기 hymenoptera 독 알레르기의 진단은 일상적으로 ST 및 혈청 sIgE를 기반으로합니다. BAT는 높은 민감도 (85-100 %)와 특이도 (83-100 %)를 보여 주었으며 모호한 결과를 산출하는 경우 또는 독 알레르기의 암시적인 임상 병력이 있지만 검출 할 수없는 sIgE 및 음성 ST118,119가있는 환자에게 유용하다고보고되었습니다. 그러나, BAT는 이들 반응(120,121)에 대한 중증도를 예측하지 못하는 것으로 보인다.
환자의 최대 60 %가 말벌과 봉독 모두에 sIgE를 나타내며 우성 알레르겐의 식별은 적절한 면역 요법 치료에 중요합니다. 이러한 경우, BAT는 우성 알레르겐119122123124의 확인에 유용한 것으로 보고되었다. 꿀벌 및 말벌 독의 주요 알레르겐에 대한 sIgE는 두 독 모두에 대해 이중 양성인 환자에서 BAT의 유용성을 감소시킬 수 있지만, 주로 sIgE 결정에서 음성 결과를 가진 대상체에서 유용한 정보를 제공합니다123.
일부 연구에서는 BAT가 독 면역 요법의 축적 단계에서 부작용에 대한 예측 바이오마커로 유용할 수 있다고 제안하는데, 이는 이 치료 옵션이 호염기구 감수성을 감소시키는 것으로 보고되었기 때문입니다. 그러나 반응성은 감소하지 않으며이 BAT 유틸리티는 오늘날 논란의 여지가있는 13,120,125,126,127,128,129,130입니다.
두드러기 및 혈관 부종 만성 두드러기 환자의 서브세트는 비만 세포 표면 상에 존재하는 FcεRI 또는 IgE-FcεRI 복합체를 표적으로 하는 자가알레르겐에 대한 IgE 자가항체 및 IgG 자가항체로 인해 자가면역 병태생리학을 갖는다(131,132). 임상 실습에서 이러한 유형의 만성 두드러기의 진단은 우발적 인 감염의 위험이있는 양성자가 혈청 ST에 의존했습니다. BAT는 만성 두드러기가 의심되는 환자를 진단하고 모니터링하기위한 체외 검사로 제안되었습니다. 호염기구의 표면에서 CD63 및 CD203c 발현은 모두 만성 두드러기 환자로부터의 혈청 자극 후에 증가되는 것으로 보고되었으며, 활성 자가항체 133,134,135,136,137의 검출을 보여준다. 최근 BAT 양성 환자는 두드러기 활동 점수로 평가되는 가장 활동적인 질병 상태를 경험하는 경우가 많으며 BAT138 음성인 환자에 비해 3차 치료(사이클로스포린 A 또는 오말리주맙)와 함께 더 많은 용량의 항히스타민제가 필요한 것으로 보고되었습니다.

<table><tbody><tr><td>5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 캡 없음, 비멸균</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-human CD193 (CCR3) 항체</td><td>BioLegend</td><td>310708</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-human CD63 항체</td><td>BioLegend</td><td>353006</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td> <td>Thermo-Fisher</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>용해 용액 10x 농축</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-human cd203c (E-NPP3) 항체</td><td>BioLegend</td><td>324606</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>정제 마우스 항인간 IgE</td><td>BD 생명과학</td><td>555857</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-3</td><td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>칼집 유체</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>TUBE 9mL LH 리튬 헤파린</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455084</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

알레르기 진단을 위한 호염기구 활성화 검사

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

호염기구 활성화 검사(BAT)는 식품, 곤충독, 약물 및 일부 형태의 만성 두드러기에 대한 IgE 매개 알레르기 반응의 평가에서 임상 병력, 피부 검사(ST) 및 특이 IgE(sIgE) 판정 외에 사용할 수 있는 보완적인 체외 진단 검사입니다. 그러나 진단 알고리즘에서이 기술의 역할은 매우 다양하고 잘 결정되지 않습니다.
BAT는 유세포 분석에 의한 활성화 마커 (예 : CD63, CD203c)의 측정을 통해 알레르겐 / 약물 가교 IgE 활성화에 대한 호염구 반응의 측정을 기반으로합니다. 이 검사는 특히 심각한 생명을 위협하는 반응을 경험하는 피험자에서 알레르기 진단을 확인하기 위해 통제된 챌린지 검사를 피하는 데 유용하고 보완적인 도구가 될 수 있습니다. 일반적으로 BAT의 성능은 i) 알레르겐 / 약물이 ST에서 위양성 결과를 생성하는 경우 고려되어야합니다. ii) ST 또는 sIgE 측정에 사용할 알레르겐 / 약물 공급원이 없습니다. iii) 환자 병력과 ST 또는 sIgE 결정 사이에 불일치가 있습니다. iv) 증상은 ST가 전신 반응을 초래할 수 있음을 시사합니다. v) 범인 알레르겐 / 약물을 확인하기 위해 CCT를 고려하기 전에. 테스트의 주요 한계는 특히 약물 알레르기에서 최적이 아닌 민감도, 샘플 추출 후 24시간 이내에 테스트를 수행해야 하는 필요성, 절차, 농도 및 세포 마커 측면에서 실험실 간의 표준화 부족과 관련이 있습니다.

알레르겐 또는 약물로 수행 된 BAT는 IgE 의존성 과민 반응을 조사 할 수 있습니다. 호염기구 반응성은 최상의 결과(34 )를 얻기 위해 적어도 2개의 최적 농도로 측정되어야 하며, 활성화는 세포 표면 상의 CD63의 상향조절에 의해 가시화된다. 더욱이 알레르겐의 경우, 호염기구 반응성을 확인하기 위해, 다중 감소 알레르겐 농도에서 반응성을 측정함으로써 호염기구 민감도를 분석해야 한다(114). 이 측정을 통해 "CD-sens"141로 표현할 수있는 50 % 호염기구 (EC50)의 반응을 유도하는 알레르겐 농도를 결정할 수 있습니다. 투여량 곡선 (AUC) 아래 면적의 측정은 호염기구 반응성 및 호염기구 민감도 모두를 함께 평가하기 위해 최근에 제안되었다58.
BAT 결과를 분석하기 위한 유세포분석 전략은 ...

호염기구 활성화 시험은 유세포 분석에 의한 활성화 마커의 측정을 통해 특정 자극의 존재하에 호염기구 활성화의 검출을 기반으로 IgE 매개 알레르기 반응을 평가하기위한 보완적인 체외 진단 시험입니다.

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

호염기구 활성화 검사는 약물, 음식 또는 흡입제에 의해 유발 된 반응뿐만 아니라 일부 형태의 만성 두드러기에서 유용한 것으로 밝혀진 IgE 매개 알레르기 반응의 평가를위한 무료 체외 진단 검사입니다. 이 검사는 유세포 분석에 의한 활성화 마커의 측정을 통해 알레르겐 또는 약물 가교 IgE 활성화에 대한 호염기구 반응을 결정하는 것을 기반으로합니다. 호염기구 활성화 검사는 특히 심각한 생명을 위협하는 반응을 경험하는 피험자에서 알레르기 진단을 확인하기 위해 통제된 챌린지 검사를 피하는 데 유용하고 보완적인 도구가 될 수 있습니다.또한이 검사는 일부 약물 및 알레르겐에만 사용할 수있는 다른 in vitro 방법에 비해 모든 약물 또는 알레르겐에 대한 반응을 분석 할 수 있다는 장점이 있습니다. 검사의 주요 한계는 특히 약물 알레르기에서 최적이 아닌 민감도와 관련이 있습니다. 샘플 추출 후 24 시간 이내에 테스트를 수행해야하며 실험실과 진단 알고리즘 간의 표준화가 부족합니다.9 밀리리터 헤파린 화 된 튜브에서 말초 혈액을 수집하는 것으로 시작하고 샘플을 로터에 넣어 실험 프로토콜에 필요할 때까지 실온에서 유지합니다. 음성 대조군과 양성 대조군을 위해 각각 2개의 5밀리리터 세포분석기 튜브에 라벨을 붙입니다. 또한 테스트 중인 다양한 알레르겐 또는 약물 농도에 대해 각각 하나의 튜브에 라벨을 붙입니다.그런 다음 튜브가 미끄러지지 않고 완벽하게 맞도록 튜브를 랙에 놓습니다. 첫 번째 양성 대조군의 경우 0.05%PBS-T에서 N-포르밀메티오닐-류실-페닐알라닌 또는 fMLP의 4 마이크로몰 용액을 준비하여 호염기구의 품질을 확인합니다. 두 번째 양성 대조군의 경우 PBS-T를 사용하여 밀리리터 항 -IgE 용액 당 0.05 밀리그램을 준비하십시오.자극 완충액 20 마이크로리터당 각각 1 마이크로리터의 CCR3-APC, CD203c-PE, 및 CD63-FITC 항체를 첨가하여 염색 혼합물을 준비한다. 그런 다음 23 마이크로 리터의 염색 혼합물을 각 튜브에 첨가하십시오. 음성 대조군 튜브에 100마이크로리터의 PBS-T를 추가합니다.양성 대조군 튜브 중 하나에 100 마이크로 리터의 fMLP를 추가하고 나머지 튜브에 100 마이크로 리터의 항 -IgE E를 추가합니다. 100 마이크로 리터의 다른 알레르겐 또는 약물 농도를 추가하고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양하십시오. 배양 후 용혈을 피하기 위해 각 튜브에 100 마이크로 리터의 혈액을 부드럽게 첨가하십시오.그런 다음 튜브를 부드럽게 와동시키고 중간 교반으로 자동 온도 조절 욕조에서 섭씨 37도에서 25 분 동안 배양합니다. 탈과립을 막기 위해 튜브를 섭씨 4도에서 최소 5 분 동안 유지하십시오. 각 튜브에 2 밀리리터의 용해 완충액을 추가하여 적혈구를 용해시킵니다.각 튜브를 와동시킨 다음 튜브를 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 300g의 튜브를 5 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 랙을 싱크대로 뒤집어 세포가 튜브 바닥에 남아있는 동안 상층액을 따라 내립니다.각 튜브에 3 밀리리터의 PBS-T를 추가하여 세포를 씻고 튜브를 와동시킵니다. 동일한 매개 변수 세트를 사용하여 두 번째 원심 분리를 수행하고 랙을 싱크대로 뒤집어 상청액을 따라 내십시오. 그런 다음 유세포 분석까지 빛으로부터 보호 된 섭씨 4도에서 샘플을 유지하십시오.유세포 분석기를 컴퓨터 소프트웨어에 연결하고 세포 분석기가 준비 될 때까지 기다리십시오. 텍스트 원고에 설명된 대로 템플릿과 기기 설정을 로드합니다. 샘플 수집 프로세스를 시작합니다.활성화된 호염기구를 선택하려면 먼저 측면 산란-전방 산점도에서 림프구를 게이트합니다. 그런 다음 림프구 집단에서 호염기구를 CCR3+CD203c+세포로 게이트하고 튜브당 최소 500개의 호염기구를 획득합니다. 음성 대조군을 사용하여 CD63 역치를 약 2.5%로 설정하고 샘플을 분석합니다.IgE 의존성 과민 반응은 알레르겐과 약물을 사용하여 호염기구 활성화 검사 또는 BAT를 수행하여 조사되었습니다. 호염기구 민감도는 50% 호염기구 또는 EC50의 반응을 유도하는 알레르기 농도를 결정하는 데 도움이 되는 여러 감소 알레르겐 농도에서 반응성을 측정하여 분석되었습니다. 먼저, 림프구를 측면 산란-전방 산점도로부터 게이팅하였다.그런 다음 호염기구를 림프구 집단에서 CCR3+CD203c+세포로 게이트했습니다. 그런 다음 CCR3-CD63 플롯을 사용하여 CD63을 두 약물 및 다른 농도의 알레르겐에 대한 활성화 마커로 사용하여 호염기구 활성화를 분석했습니다. 검사는 신선한 전혈로 수행되며 혈액 추출 후 24 시간 이내에 수행해야합니다.시험에 사용 된 자극에는 부형제가 포함되어서는 안되며 약물의 화학적 특성을 고려해야합니다. IgE 매개 알레르기 반응의 진단, 또는 sIgE의 측정, 또는 히스타민 방출 검사를위한 다른 추가 시험관 내 방법.

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의학

Basophil 인증 테스트 IGE에 의존 알레르기의 탐지를위한 강력한...

약물 과민성의 IGE - 중재 메커니즘을 조사 Basophil 인증 시험

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인간화 매개체 효소 방출 분석법: 체외에서 호염질 탈과립 반응을 모니터링하여 테스트 항원의 알레르기 가능성을 스크리닝하는 면역화학적 방법

이 비디오에서는 유세포 분석을 사용하여 테스트 알레르겐이 있는 상태에서 호염 활성화를 평가하는 테스트를 시연합니다.

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알레르겐 특이적 면역글로불린 E를 위한 미세유체 카트리지 기반 검출 시스템

여기서는 유동 세포 계측법에 의해 알레르겐 - 로딩 입자를 정량 할 수있는 프로토콜을 제시한다. 주변 미립 입자 흡착 알레르겐의 담체로서 작용할 수있다. 우리는 유동 세포 계측법, 방법은 널리 직경이 0.5㎛가 이러한 알레르겐 - 로딩 입자를 측정 할 수있다&gt; 부유 물질을 특성화하는 데 사용 여기 나타낸다.

PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

이 연구는 알레르기 성 비염 및 / 또는 천식을 앓고있는 중국 남부의 환자 집단에서 꽃가루 알레르겐에 대한 민감성을 연구하기 위해 성분 분석법을 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

알레르기 성 비염 및 / 또는 천식을 앓고있는 중국 남부의 잔디 꽃가루 알레르겐에 대한 연구를위한 성분 분석 진단법

이 종이 알레르기 진단에 미세 화학 카트리지 기반 시스템의 유용성 평가와 특정 혈 청 면역 글로불린 E를 탐지 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

검출 하는 혈 청 알레르기 항 원 특정 면역 글로불린 e (sIgE) 바이오 미세 기술의 응용

여기서 우리는 인간 IgE 수용체에 감염된 쥐 배혈세포세포를 사용하여, 제1형 알레르기 반응에서 전형적으로 관찰되는 이펙터 세포의 분해를 시뮬레이션하기 위해 중재자 방출 분석체를 제시한다. 이 방법은 매우 민감하고 재현 가능하며 맞춤성 방식으로 알레르겐의 생물학적 활성을 조사합니다.

인간화된 중재자 릴리스 분석으로 알레르겐 효능에 대 한 읽기-아웃

알레르겐 노출 챔버(AEC) 시설에서 챌린지를 수행하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. AEC는 안정적인 입자 농도 및 환경 조건을 유지하는 능력으로 인해 알레르기 증상 유도 또는 알레르겐 면역 요법의 효능 테스트에서 종점으로서 안전하고 효과적인 도구임이 입증되었습니다.

알레르겐 노출 챔버를 이용한 알레르기성 비염 환자의 증상 평가

학습하세요 호염기구 활성화 검사를 이용한 알레르기 진단 방법을. 유속 세포 분석술로 IgE 매개 반응을 측정하여 약물 및 식품 알레르기를 평가하고 중증 환자의 유발 시험을 대체하는 데 활용됩니다.

알레르기 진단을 위한 호염기구 활성화 검사

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