근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

이 프로토콜은 과학자들이 다른 전단 응력 조건하에서 전사 인자 복합체의 수를 정량적으로 비교할 수 있게 해주며 혈관 생물학 연구에 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 각각의 대조군을 포함하여 여러 항체 쌍의 조사를 동시에 허용하는 미세 유체 흐름 채널의 사용입니다. 우선, PBS에서 제조된 0.1%의 돼지 피부 젤라틴을 37도에서 30분간 채널에 추가하여 6개의 채널 슬라이드를 코팅합니다.

M199 의 30 마이크로리터에서 밀리리터당 6세포로 2.5배 10배 의 밀도로 미리 코딩된 6개의 채널 슬라이드에서 젤라틴 용액및 종자 Huvecs에서 채널을 비웁니다. 가습 된 인큐베이터에서 세포가 섭씨 37도에서 1 시간 동안 부착되도록하십시오. 미리 경고된 M199 의 마이크로리터 60개를 각 저장소에 추가합니다.

24 시간 후에 중간 보충을 가진 가습된 인큐베이터에서 2 일 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 실리콘 튜브를 유체 단위에 장착하고, 미리 경고된 M199 의 최소 10 밀리리터로 저장소를 채웁니다. 유체 단위를 튜브와 튜브를 펌프 시스템에 연결하고 세포 없이 사전 실행을 수행하여 배지를 평형화하고 남은 공기를 제거합니다.

직렬 연결 튜브를 사용하여 6개 채널 슬라이드의 단일 채널을 연결합니다. 슬라이드의 첫 번째 및 마지막 채널을 유체 장치에 장착된 튜브에 연결합니다. 높은 수준의 스트레스에 세포를 노출하려면 적응 단계에서 현명하게 스트레스 단계를 늘려 30분당 평방 센티미터당 5개의 왕조의 증분 단계를 설정합니다.

튜브의 덩어리를 사용하여 유체 전단 응력 노출 후 펌프에서 슬라이드를 분리하고 인큐베이터의 중간 유출을 피하고 얼음에 흐름 슬라이드를 전달합니다. 저수지에서 튜브를 분리하는 동안 손가락을 사용하여 저장소의 반대편을 닫아 채널의 기포를 포획하지 마십시오. 얼음에 흐름 슬라이드를 유지, 조심스럽게 저수지에서 매체를 흡인하지만 세포가 거주하는 채널에서.

한 저수지에 PBS를 추가하고 다른 저수지에서 조심스럽게 흡인하여 90 마이크로리터의 냉멸 PBS로 샘플을 세척한 다음 모든 채널에서 반복합니다. PBS가 첨가된 동일한 저장소에 완충된 4%PFA 용액90마이크로리터를 추가하여 세포를 수정하고 입증된 바와 같이 다른 저수지에서 액체를 흡인시합니다. 6개의 채널에서 세포를 고정한 후, 샘플을 얼음에서 실온으로 옮기고 20분 동안 배양합니다.

PBS를 하나의 저수지에 추가하고 모든 채널의 다른 저수지에서 조심스럽게 흡입하여 PBS로 세포를 세 번 세척하여 채널을 건조시키지 않도록주의하십시오. PBS에서 제조된 주변 15 밀리머암모늄 염화암모늄의 90마이크로리터를 저수지 중 하나에 추가하여 PFA에 대한 담금질 액세스 PFA. 다른 저수지에서 흡인하고 10 분 동안 세포를 배양합니다.

빈 저수지에서 PBS에서 제조된 0.3%트리톤 X 100의 90 마이크로리터를 추가하여 세포를 투과화한다. 각 채널에 대한 다른 저수지에서 흡인하고 10 분 동안 배양 한 다음 이전에 설명 한 대로 PBS로 세 번 세척했습니다. 멸균 PLA 차단 용액의 90 마이크로 리터에서 하나의 저수지에.

각 채널에 대해 다른 쪽에서 흡인하고 가습 챔버에서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다. PLA 항체 희석제 및 소용돌이에 1 차적인 항체를 추가합니다. 조심스럽게 저수지와 채널에서 차단 솔루션을 흡인.

1차 항체 용액의 마이크로리터 30개를 즉시 빈 채널에 추가하여 슬라이드를 기울이면서 용액을 추가합니다. 모든 채널에 대해 반복하고 밤새 가습 챔버에서 섭씨 4도또는 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. PLA 항체 희석제에서 빼기 토끼와 마우스 PLA 프로브를 1~5개 희석시 희석시.

90 마이크로리터의 워시 버퍼 A를 추가하고 입증된 대로 흡입하여 모든 채널을 두 번 세척하십시오. 세척 버퍼를 심은 후 PLA 프로브 용액 30 마이크로리터를 추가하고 가습 챔버에 배양합니다. 디이온화 수에서 결찰 버퍼를 1~5개 희석시키고 희석된 결찰 버퍼에서 1~40개의 리거스 효소를 희석시켰다.

세척 버퍼 A를 세척하고 완전히 흡입한 후, 슬라이드를 기울이면서 빈 채널에 30 마이크로리터의 리칭 용액을 추가하고 가습 챔버에서 배양합니다. 증액 버퍼를 탈온화 된 물에 1 ~ 5 개를 희석 한 다음 얼음에 희석 된 증폭 완충제에서 폴리머 라제 효소를 1 ~ 80으로 희석시. 세척 버퍼 A를 세척하고 완전히 흡입한 후, 슬라이드를 기울이면서 빈 채널에 30 마이크로리터의 증폭 용액을 추가하고 가습 챔버에 배양합니다.

DAPI를 세척 버퍼 B에서 1~500개까지 희석하고 세척 버퍼 B를 함유한 DAPI의 90마이크로리터를 추가하고 핵을 증기로 스며들기 위해 멸망시킴으로써 모든 채널을 한 번 세척한다. 그런 다음 모든 채널을 DAPI없이 세척 버퍼 B로 한 번 씻으시면됩니다. 세척 버퍼 B를 1~10으로 희석하고 희석된 세척 버퍼 B.aspirating wash 버퍼 B의 90 마이크로리터로 모든 채널을 한 번 세척한 후, 즉시 액체 장착 중간에 2~3방울을 넣고 모든 채널에 장착 매체를 분배합니다.

이미징까지 가습된 환경에서 샘플을 섭씨 4도에 저장합니다. Huvecs는 높고 낮은 깎아지른 듯한 스트레스에 노출되었습니다. 낮은 전단 스트레스는 사이토솔과 핵에서 SMAD 단백질 상호 작용을 증가시켰습니다.

단일 항체 대조군은 극소수의 신호에 나타나지 않았으며, 실험의 성공을 입증하였다. 항체 농도가 증가하여 세포당 PLA 이벤트가 더 많이 발생했지만, 높은 및 낮은 투명 응력 노출 세포 사이의 PLA 신호의 차이는 감소되었다. 차단 및 항체 희석을 위한 자체 제작 버퍼는 상업적 완충제의 대안으로 사용될 수 있다.

상업 및 자체 수제 희석제 및 차단 용액에 대한 PLA 이벤트의 정량화는 세포및 핵 영역에서 PLA 신호의 동일한 패턴을 보여 주었다. 그러나 상업적 용액으로 셀당 총 PLA 이벤트 수가 더 많았습니다. SMAD 2/3의 조합, SMAD 4 항체는 면역 형광 실험에 적합하지 않은 곳에서 사용되었다.

실험 대 대조군 조건에서 PLA 이벤트에 차이가 없었으며, PLA 이벤트를 검출하기 위해 올바른 항체 조합을 선택하는 것이 중요하다는 것을 나타낸다. 설명된 프로토콜은 SMAD와 다른 전사 인자 복합체의 상호 작용을 검출하기 위하여 적응될 수 있고 그러므로 영웅 경향이 있고 영웅 보호 조건에서 유전자 조절을 이해하는 것을 돕습니다.