Name: 근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 배우세요 근접 리깅 분석을 이용해 전단 응력 조건에서 내피세포의 SMAD 복합체를 시각화하고 정량화하는 방법을. 혈관생물학 연구에 유용한 이 기법은 미세유체 채널을 활용합니다.

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우리는 마리아 라이헨바흐 박사와 크리스티안 히펜 박사가 흐름 설정 시스템에 대한 지원에 감사를 표하고 엘리너 폭스와 윤윤 샤오는 원고를 비판적으로 읽었습니다. P-L.M. 국제 막스 플랑크 연구 학교 IMPRS 생물학 및 계산에 의해 투자되었다 (IMPRS-BAC). PK는 DFG-SFB1444에 의해 자금을 받았다. 그림 1은 BioRender를 사용하여 만들어졌습니다.

1. 세포 배양 및 유체 전단 응력 노출
참고: 인간 배꼽 정맥 IC(HUVECs)는 SMADs의 SS 유도 상호 작용을 연구하는 예로 사용되었습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 모든 SS 반응형 세포 유형에 적용될 수 있다.
<ol><li>PBS에서 0.1% 돼지 피부 젤라틴으로 6채널 슬라이드를 37°C에서 30분 동안 코팅합니다.</li>
	<li>M199 풀 배지의 30 μL에서 mL당 2.5 x 106 셀의 밀도로 미리 코팅된 6채널 슬라이드의 시드 HUVECs. 참고: 유량 슬라이드에서 셀을 시드하는 방법에 대한 자세한 내용은 참조24를 참조하십시오24를 참조하십시오.</li>
	<li>가습 된 인큐베이터에서 세포가 37 °C에서 1 h를 부착하십시오.</li>
	<li>미리 따뜻해지는 M199 전체 매체의 60 μL을 각 저장소에 추가합니다.</li>
	<li>가습 인큐베이터에서 하루에 한 번 37 °C에서 부드러운 중간 교환으로 2 일 동안 배양하십시오.<ol>
<li>저수지를 완전히 흡인시키고, 미리 따뜻워진 M199의 120 μL을 저수지 중 하나에 넣고 다른 쪽에서 흡인합니다.</li>
		<li>미리 따뜻워진 M199 전체 중간 크기의 60 μL을 두 저장소에 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>참조25에 자세히 설명된 대로 흐름 설정을 어셈블하고 시작합니다.<ol>
<li>유체 단위에 마운트 튜브. 여기서 직경 0.8mm 및 1.6mm의 실리콘 튜브는 각각 1 dyn/cm2 및 30 dyn/cm2의 전단 응력에 사용됩니다. 참고: 변경사항이 결과 전단 응력에 영향을 줄 수 있으므로 재료 및 튜브 길이는 일정하게 유지되어야 합니다. 일반적으로 펌프 시스템과 튜빙의 다른 조합은 결과 전단 응력이 알려져 있는 한 사용할 수 있으며 펌프는 꾸준한 라미나르 흐름을 생성합니다.</li>
		<li>미리 데워진 M199 전체 매체(최소 10mL)의 적절한 양으로 저장소를 채웁니다.</li>
		<li>유체 단위를 튜브와 펌프 시스템에 연결하고 세포 없이 사전 실행을 수행하여 배지를 평형화하고 나머지 air25를 제거합니다.</li>
		<li>직렬 연결 튜브를 사용하여 6채널 슬라이드의 단일 채널을 서로 연결합니다. 슬라이드의 첫 번째 채널과 마지막 채널은 1.6.1로 조립된 튜빙에 연결됩니다(구성표 의 그림 1A 참조). 이 심각하게 세포를 해칠 수 있기 때문에 시스템에 공기를 도입하지 않도록주의하십시오. 직렬 연결에 대한 자세한 내용은 참조26에서 찾을 수 있습니다.</li>
		<li>전단 응력 (>20 dyn/cm2)에 세포의 노출을 위해 램프 단계, 즉 적응 단계와 함께 단계적으로 전단 응력을 증가시면 됩니다. 단계는 30분당 5dyn/cm2 단위로 설정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 고정
<ol><li>유체 SS 노출 후 펌프에서 슬라이드를 분리합니다. 배양기에서 중간 유출을 방지하기 위해 분리 할 때 튜브에 클램프를 사용합니다.</li>
	<li>얼음에 흐름 슬라이드를 즉시 옮기고 나머지 튜브는 순차적으로 분리됩니다. 저수지에서 튜브를 제거할 때, 다른 쪽의 저수지는 채널에 기포를 포획하지 않도록 손가락으로 닫혀 있어야 합니다. 이렇게 하면 고정 단계가 방해가 될 수 있습니다.</li>
	<li>얼음에 세포를 유지, 조심스럽게 저수지에서 매체를 흡인하지만 세포가 거주하는 채널에서. 이어서, 차가운 멸균 PBS(4°C)로 시료를 3배 채널 부피(90μL)로 세척한다. 한 저장소에 PBS를 추가하고 다른 저수지에서 조심스럽게 흡인합니다. 슬라이드당 6개 채널 각각에서 이 단계를 반복합니다. 참고: 모든 세척 및 배양 단계의 경우 각 솔루션이 저장소 중 하나에 추가되어 채널의 솔루션 교환이 됩니다. 채널에서 솔루션을 완벽하게 대체할 수 있도록 하려면 초과 솔루션이 다른 저장소에서 흡입됩니다. 채널내 셀 상단의 용액은 제거되지 않습니다. 세포는 언제든지 건조해서는 안됩니다. 따라서 슬라이드에 기포를 삽입하지 않고 신중하게 세척하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>PBS가 미리 첨가된 것과 동일한 저장소에 버퍼링된 4% PFA 용액의 90 μL을 추가하여 세포를 수정하고 다른 저장소에서 액체를 유사하게 흡인시합니다. 각 슬라이드의 각 채널에서 이 단계를 반복합니다. PFA 용액을 추가한 후 샘플을 얼음에서 실온(RT)으로 옮기고 20분 동안 배양합니다. 주의: PFA는 독성이 있으며 신중하게 처리해야 합니다. 장갑을 사용하고 연기 후드 아래에서 작업하십시오.</li>
	<li>PBS (RT)로 셀 을 3 배 세척하여 하나의 저수지에 추가하고 다른 저수지에서 조심스럽게 흡입하십시오. 저수지만 비우면 채널을 건조시키지 않도록 합니다. 슬라이드당 6개 채널 각각에 대해 이 단계를 반복합니다.</li>
	<li>PBS에 주변 50mM 암모늄 염화암모늄의 90 μL을 저수지 중 하나에 추가하여 PFA 고정을 담금질하십시오. 다른 저수지에서 과도한 용액을 흡인합니다. 슬라이드의 각 채널에 대해 반복합니다. RT에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>2.5 단계에서 설명한 대로 씻으세요. 참고: 이 시점에서, 샘플은 하룻밤 사이에 4°C로 저장될 수 있거나, 프로토콜은 차단 및 1차 항체 배큐어로 즉시 계속될 수 있다(3단계 참조).</li>
</ol>3. 차단 및 1 차 항체 배큐어
<ol><li>세포를 투과화하려면 비운 저수지에 PBS에 0.3% 트리톤-X-100의 90 μL을 추가하고 각 채널에 대해 다른 저장소에서 흡인합니다. RT에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>2.5 단계에서 설명한 대로 씻으세요.</li>
	<li>90 μL의 멸균 PLA 차단 용액을 채널의 한 저장소에 추가하고 다른 쪽에서 흡인합니다. 각 채널에 대해 이 단계를 반복합니다. 가습 챔버에서 37 °C에서 1 h에 대한 블록.<ol>
<li>가습 챔버를 만들려면 왁스 필름으로 밀봉 된 젖은 티슈가있는 10cm 접시를 사용하여 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 또는 습한 대기를 공급하는 다른 습도 챔버 형식을 사용할 수 있습니다. 참고: 또는, 자체 제작 차단 솔루션(예: PBS, 멸균 여과된 BSA)을 3%(w/v) BSA로 사용할 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PLA 항체 희석제에서 1차 항체(1:100)를 준비한다. 채널당 용액의 30 μL을 준비합니다. 1 차적인 항체와 소용돌이 둘 다 동시에 추가하십시오. 참고: 대안적으로, 자체 만든 항체 희석제(예를 들어, PBS에서 1%(w/v) BSA)를 사용할 수 있다. 여기에 사용되는 항체는 SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 및 인-SMAD1/5-SMAD4의 조합입니다. 자세한 정보는 재료 표에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>1차 항체를 적용하기 전에, 저수지로부터 차단 용액을 흡인시키고, 또한 채널에서 신중하게 흡입한다. 1차 항체 용액의 파이펫 30 μL은 용액을 추가하는 동안 채널을 기울여 빈 채널로 즉시 들어갑니다. 참고: 차단 용액의 제거및 항체 용액 채널별 채널의 추가를 수행하여 세포가 그 사이에 건조하지 않도록 합니다.</li>
	<li>4°C에서 가습 챔버에서 하룻밤 동안 1 차 항체를 가진 시료를 배양한다. 참고: 같은 날 다음 단계를 계속 진행하려면 실온에서 1시간 동안 인큐베이션을 수행할 수도 있습니다.</li>
</ol>4. PLA 프로브 인큐베이션
참고: 4.1-7.3 절의 모든 단계에 대해, 세척 버퍼 A와 B는 4°C에 저장되며 사용하기 전에 RT로 데워져야 합니다.
<ol><li>PLA-프로브(+)-마우스 및 (-)-토끼를 PLA 항체 희석제(또는 1% BSA) 용액에서 1:5로 희석한다. 채널당 30μL를 준비합니다.</li>
	<li>저수지 중 하나에 추가하고 다른 저수지에서 조심스럽게 흡입하여 RT에서 세척 버퍼 A의 90 μL을 사용하여 5 분 동안 샘플을 2 배 세척하십시오. 슬라이드당 6개 채널 각각에 대해 이 단계를 반복합니다.</li>
	<li>세척 버퍼 A를 조심스럽게 흡인시키고 3.5 단계에서 1차 항체를 첨가하는 것과 유사한 PLA 프로브 용액(단계 4.1에서 제조됨)의 30 μL을 추가한다.</li>
	<li>가습 챔버에서 37 °C에서 1 h에 대한 샘플을 배양합니다.</li>
</ol>5. 결찰
<ol><li>4.2에 설명된 대로 RT에서 세척 버퍼 A의 90 μL을 사용하여 5 분 동안 샘플을 2 배 세척하십시오.</li>
	<li>디온화된 물에 결찰 버퍼의 1:5 희석을 준비합니다. 이 버퍼를 사용하여 리구효소 효소를 1:40(얼음)으로 희석시 보세요. 채널당 30μL을 사용합니다.</li>
	<li>세척 버퍼 A를 완전히 흡인하고 3.5에 설명된 대로 계합 용액을 추가합니다.</li>
	<li>가습 챔버에서 37 °C에서 30 분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
</ol>6. 증폭
<ol><li>4.2에 설명된 대로 RT에서 90 μL의 세척 버퍼 A를 사용하여 2 분 동안 샘플을 2 배 세척하십시오.</li>
	<li>증액 을 1:5로 희석하여 증폭 완충액을 준비하고 폴리머라제 효소를 1:80(얼음)으로 희석하는 데 사용합니다. 빛으로부터 보호하십시오. 채널당 30μL를 준비합니다.</li>
	<li>세척 버퍼 A를 완전히 흡인하고 즉시 3.5에 설명된 대로 준비된 증폭 용액을 빈 채널에 추가합니다. 가습 챔버에서 37 °C에서 100 분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
</ol>7. 마운팅
<ol><li>4.2에 설명된 대로 RT에서 90 μL의 워시 버퍼 B를 사용하여 10분 동안 샘플을 2배 세척합니다. 염색 핵에 첫 번째 세척에 1 mg /mL 재고 용액 (탈화 된 물에)에서 DAPI (1:500)를 추가합니다. 채널을 건조하지 마십시오.</li>
	<li>세척 버퍼 B를 탈이온 수분(1:10)으로 희석하고 4.2에 설명된 대로 0.1x 버퍼 B 용액의 90 μL로 1배 세척합니다.</li>
	<li>세척 버퍼 B를 완전히 흡인하고 즉시 액체 장착 매체의 2-3 방울을 하나의 저장소에 추가합니다. 슬라이드를 기울여 채널에 배포합니다. 이미징까지 가습 된 환경에서 4 °C에서 샘플을 저장합니다.</li>
</ol>8. 이미지 수집
<ol><li>형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득하십시오. 형광 PLA 프로브에 맞는 각 필터를 사용할 수 있는지 확인합니다. 참고: 가능한 한, 획득한 PLA 반점이 더 정의되기 때문에 공초점 현미경을 사용하는 것이 유익합니다. 이를 통해 추가 이미지 처리 및 데이터 분석을 지원합니다.</li>
</ol>9. ImageJ/FIJI를 이용한 이미지 분석 및 정량화
<ol><li>ImageJ27과 같은 이미지 프로세싱 프로그램을 통해 내보낸 이미지(.tiff)를 처리합니다. 참고: 본 연구에서 사용되는 모든 스크립트는 셀룰러, 핵 및 셀당 모든 PLA 이벤트(셀당)의 자동 계수에 필요한 스크립트를 GitHub 리포지 https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis 토리에서 찾을 수 있습니다. 적합한 프로그램이나 도구를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에 설명된 PLA 기반 프로토콜은 정량적 및 공간 해상도를 가진 전단 응력에 노출된 IC에서 두 가지 단백질(예를 들어, 그들의 직접적인 상호 작용)의 근접성을 결정하는 효율적인 방법을 제공합니다. 여러 병렬 채널을 가진 유량 슬라이드를 사용하여 동일한 기계적 조건하에서 세포에서 동시에 여러 가지 단백질 상호 작용을 검사 할 수 있습니다. 대조적으로, 사용자 정의 빌드 흐름 챔버 시스템은 종종 슬라이드와 펌프 당 필요한 컨트롤없이 하나의 PLA 실험을 허용 유리 커버 슬립 주위에 구축 된 단일 채널을 사용합니다. 이 프로토콜은 SMAD 상호 작용의 검출에 초점을 맞추고 있지만, 다른 단백질 상호 작용을 감지하도록 조정할 수 있습니다. 그러나, 결과의 분석은 2개의 단백질이 또한 복합체를 형성하지 않고 가까운 근접에 상주할 수 있기 때문에 주의 깊게 행해져야 합니다. 단백질의 상호 작용에 대한 명확한 진술이 바람직한 경우에, PLA 실험은 공동 면역 침전과 같은 추가 적인 방법으로 보완되어야 합니다. 또한, PLA는 샘플이 후...

변형 성장 인자 베타 (TGFβ) 슈퍼 패밀리의 단백질은 TGFβs, 뼈 형태 유전학 단백질 (BmPs), 및 Activins1,2를 포함한 다양한 구성원을 가진 흉골 사이토카인이다. 리간드 결합은 인산화로 이어지는 수용체 올리고머의 형성을 유도하고, 이에 의해, 세포조절SMAD(R-SMAD)의 활성화를 유도한다. 리간드의 하위 패밀리에 따라 다른 R-SMAD가 활성화됩니다1,2. TGFβs 및 액티빈은 주로 SMAD2/3의 인산화를 유도하는 반면, BMP는 SMAD1/5/8 인산화를 유도합니다. 그러나, BmPs와 TGFβs/Activins는 또한 '측면 신호'3,4,5,6,7,8로 불리는 프로세스에서 각각다른 하위 가족의 R-SMADs를 활성화하고 SMAD1/5 및 SMAD2/3, 회원 으로 구성된 혼합 SMAD 복합체가 있다는 증거가 축적되어 있습니다. . 두 개의 활성 R-SMADs는 이후 공통 중재자 SMAD4와 트리메릭 복합체를 형성한다. 이러한 전사 인자 복합체는 핵으로 배분하고 표적 유전자의 전사를 조절할 수 있습니다. SMADs는 다양한 상이한 전사 공동 활성제 및 공동 억압자와 상호 작용할 수 있으며, 표적 유전자10을 조절할 수 있는 가능성의 다양화로 이어집니다. SMAD 신호의 규제 완화는 다양한 질병에 심각한 영향을 미칩니다. 이에 따라 불균형한 TGFβ/BMP 시그널링은 폐 동맥 고혈압, 유전출혈성 혈관기암증 또는 죽상 경화증3,11,12,13,14와 같은 심한 혈관 병리로 이어질 수 있다.
내피 세포 (EC)는 혈관의 가장 안쪽 층을 형성하고, 따라서, 전단 응력 (SS),에 노출, 혈액의 점성 흐름에 의해 가해지는 마찰 력. 흥미롭게도, 균일한, 라미나르 SS의 상부에 노출되는 혈관의 부분에 거주하는 IC는, 정각적이고 정지상태에 보관됩니다. 대조적으로, 비균일한 SS를 경험하는 EC는, 예를 들면, 양면 또는 대동맥 아치의 더 적은 곡률에서, 증식하고 선동적인 통로를 활성화합니다15. 차례로, 기능 장애 PC의 사이트는 동맥 경화증을 개발하는 경향이있다. 흥미롭게도, 이러한 atheroprone 지역에 있는 EC는 활성화된 SMAD2/3 및 SMAD1/516,17,18의 비정상적으로 높은 수준을 표시합니다. 이러한 맥락에서, 향상된 TGFβ/BMP 시그널링은 동맥경화성 병변19의 개발초기 발생으로 밝혀졌으며 BMP 신호와의 간섭은 혈관 염증, 무종 형성 및 관련 석회화20을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
근접 결찰 분석법(PLA)은 situ21,22에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 생화학 적 기술입니다. 그것은 관심있는 표적 단백질을 결합할 수 있는 상이한 종의 항체의 특이성에 의존하여 단일 세포 수준에서 내인성 단백질 상호 작용의 매우 특이적인 검출을 허용합니다. 여기서, 1차 항체는 검출을 허용하기 위해 40nm 미만의 거리에서 표적 에피토프에 결합해야 한다.23. 따라서 PLA는 내인성 단백질 상호 작용을 감지하기 위해 수백만 개의 세포가 필요한 전통적인 공동 면역 침전 접근 에 크게 유용합니다. PLA에서, 종 특정 이차 항체는, DNA 단편에 공유하게 연결됩니다 (플러스와 마이너스 프로브라고 합니다), 1 차적인 항체를 묶고 관심의 단백질이 상호 작용하는 경우에, 플러스와 마이너스 프로브는 가까이에 옵니다. DNA는 다음 단계에서 결찰되고 원형 DNA의 롤링 원 증폭이 가능하게 된다. 증폭 하는 동안, 형광 표지 보완 올리고 뉴클레오티드 합성 된 DNA에 바인딩, 이러한 단백질 상호 작용을 허용 하는 기존의 형광 현미경 검사법에 의해 시각화 될 수.
여기에 설명된 프로토콜은 과학자들이 PLA를 사용하여 시험관내 의 에로히어로프로텍션 및 아로테경향이 있는 SS 조건에서 활성 SMAD 전사 복합체의 수를 정량적으로 비교할 수 있게 합니다. SS는 정의된 레벨의 라미나르 단방향 흐름을 생성할 수 있고 유량의 단계별 증가를 허용하는 프로그래밍 가능한 공압 펌프 시스템을 통해 생성됩니다. 이 방법을 사용하면 SMAD1/5 또는 SMAD2/3과 SMAD4 및 혼합 R-SMAD 복합체 간의 상호 작용을 감지할 수 있습니다. SMAD와 전사 공동 규제 기관과의 상호 작용을 분석하거나 SMAD 이외의 전사 인자 복합체로 쉽게 확장할 수 있습니다. 그림 1 은 아래에 제시된 프로토콜의 주요 단계를 보여 주세요.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> 그림 1: 설명된 프로토콜의 회로도 표현입니다. (A) 6채널 슬라이드에서 시드된 셀은 공압 펌프 시스템으로 전단 응력에 노출된다. (B) 고정 셀은 PLA 실험 또는 제어 조건에 사용됩니다. (C) PLA 실험의 이미지는 형광 현미경으로 획득하고 ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>&마이크로;-슬라이드 VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>6채널 슬라이드</td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>Carl Roth</td><td>K298.1</td><td>담금질</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Carl Roth</td><td>8076.4</td><td>차단</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마 Aldrich/ Merck</td><td>D9542</td><td>염색 DNA/핵</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>듀올링크 In 현장 검출 시약: 녹색</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92014</td><td>리가제, 결찰 완충액, 중합효소 및 증폭 완충액이 포함된 PLA 키트(녹색 라벨이 붙은 올리고뉴클레오티드 포함)</td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA 프로브 안티 마우스 MINUS</td><td>시그마 Aldrich/ Merck</td><td>DUO92004</td><td>MINUS 프로브</td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA 프로브 Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92002</td><td>PLUS 프로브</td></tr><tr><td>Duolink 현장 세척 버퍼, 형광</td><td>시그마 Aldrich/ Merck</td><td>DUO82049</td><td>PLA 세척 버퍼 A 및 B</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 보충제</td><td>매체용 코닝</td><td></td><td>보충제(ECGS)</td></tr><tr><td>매체용</td> <td>태아 종아리 혈청</td><td></td><td></td> 보충제</tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>포름알데히드 용액 4% 완충</td><td>KLINIPATH/VWR</td><td>VWRK4186. BO1</td><td>PFA</td></tr><tr><td>전체 매체</td><td></td><td></td><td>M199 기초 매체 +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&nbsp; 25 &마이크로; g/mL 간염 +&nbsp; &nbsp; 50 &마이크로; 돼지 껍질의 g/mL ECGS</td></tr><tr><td>젤라틴, A형</td><td>시그마 알드리치</td><td>G2500</td><td>흐름 채널 코팅을 위해 PBS에 0.1% 사용</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.7</td><td>GarphPad</td><td></td><td>통계 프로그램 플롯 및 통계 계산에 사용</td></tr><tr><td>돼지 장 점막의 헤파린 나트륨 염</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784-250MG</td> 보충제 매체(<td>Hep)</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ibidi 장착 매체</td><td>ibidi</td><td>50001</td><td>액체 장착 매체</td></tr><tr><td>ibidi 펌프 시스템</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>공압 펌프</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>L-글루타민 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>매체 (L-Glu)</td></tr> <tr><td>매체 용 보충제 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td>기본 매체</td></tr><tr><td>마우스 안티 SMAD1 항체</td><td>Abcam</td><td>ab53745</td><td>PLA</td></tr><tr><td>마우스 안티 SMAD2 / 3 항체</td><td>BD Bioscience</td><td>610843</td><td>CST 9515</td></tr><tr><td>마우스 안티 SMAD4 항체</td><td>Sanata Cruz Biotechnology</td>와 함께 PLA<td>에 적합하지</td>않음 <td>sc-7966</td></tr><tr><td>PLA 페니실린 10.000U / ml / 스트렙토 마이신 10mg / ml</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>보충제 (P / S)</td></tr> <tr><td>관류 세트 WHITE</td><td>ibidi</td><td>10963</td><td>튜빙 1 dyn / cm2</td></tr><tr><td>관류 세트 노란색 및 녹색</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>튜빙 30 dyn / cm2 / sup><</td></tr> <tr><td>토끼 SMAD1 / 5 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>9516</td><td>PLA</td></tr><tr><td>토끼 항 SMAD2 / 3 XP 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>8685</td><td>적합에 사용 PLA</td></tr><tr><td>토끼 항 SMAD4 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9515</td><td>BD 610843 직렬 커넥터와 함께 PLA에 적합하지 않음</td></tr><tr><td>&micro;-슬라이드</td><td>ibidi</td><td>10830</td><td>직렬 연결 튜브</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>6683.1</td><td>투과화</td></tr></tbody></table>

근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 tgfβ/bmp/smad 신호의 시각화 및 정량화

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

성장인자 β 변형(TGFβ)/뼈 형태유전학 단백질(BMP) 시그널링은 혈관시스템의 발달 및 항상성 동안 엄격하게 조절되고 균형을 이루며, 따라서 이 신호 경로에서 의변조절은 폐동맥 고혈압, 유전출혈성 및 혈관경화와 같은 심한 혈관 병리를 초래한다. 혈관의 가장 안쪽 층인 내피 세포(EC)는 유체 전단 응력(SS)에 지속적으로 노출됩니다. 유체 SS의 비정상적인 패턴은 TGFβ/BMP 시그널링을 향상시키는 것으로 나타났으며, 이는 다른 자극과 함께, 괴로발생을 유도한다. 이와 관련하여, 아테로경향이, 낮은 라미나르 SS는 TGFβ/BMP 신호를 향상시키는 동시에 높은 라미나르 SS를 향상시키는 것으로 밝혀졌으며, 이 신호는 감소시킨다. 이러한 경로의 활성화를 효율적으로 분석하기 위해, 우리는 상용 공압 펌프 시스템과 근접 계합 분석 (PLA)를 사용하여 낮은 라미나르 SS 및 높은 라미나르 SS 조건하에서 전사 인자 복합체의 형성을 조사하기 위해 워크플로우를 설계했습니다.
활성 TGFβ/BMP 신호는 두 개의 규제 SMADs(R-SMAD)로 구성된 트리메릭 SMAD 복합체의 형성을 필요로 한다. SMAD2/3 및 SMAD1/5/8 TGFβ 및 BMP 시그널링에 대한 각각)을 공통 중재자 SMAD(공동 SMAD; SMAD4). 트리메릭 SMAD 복합체, 즉 R-SMAD/공동 SMAD 또는 R-SMAD/R-SMAD의 상이한 하위 단위를 대상으로 하는 PLA를 사용하여 활성 SMAD 전사 인자 복합체의 형성은 형광 현미경을 사용하여 정량적으로 그리고 공간적으로 측정될 수 있다.
6개의 작은 병렬 채널이 있는 플로우 슬라이드를 사용하면 연재하여 연결할 수 있으며, 전사 인자 복합 형성 및 필요한 컨트롤의 포함에 대한 조사를 가능하게 합니다. 
여기에 설명된 워크플로우는 다른 유체 SS 조건에서 SMAD가 아닌 다른 전사 인자 복합체에 대한 SMAD의 근접성을 대상으로 하는 연구에 쉽게 적응할 수 있습니다. 여기에 제시된 워크플로우는 정량적으로나 공간적으로 모두 EC에서 유도된 TGFβ/BMP 신호를 연구하는 빠르고 효과적인 방법을 보여줍니다.

우리는 이전에 다른 SMAD 단백질3의 상호 작용을 검출하기 위하여 PLA를 사용하고 SMAD 인산화28에 있는 전단 응력 유도한 변경을 분석했습니다.
여기서, 두 방법은 위에서 설명한 프로토콜과 결합되었다. HUVECs는 1 dyn/cm2 및 30 dyn/cm2 의 전단 응력에 복종하고 SMAD 전사 요인의 상호 작용을 위해 분석되었습니다. 높은 전단 응력(30dyn/cm2)과 비교했을 때, 낮은 전단 응력(1dyn/cm2)은 SMAD1-SMAD2/3 상호작용의 현저한 증가로 이어져 있으며, 소위 혼합-SMAD 복합체는 분석된 세포의 사이토솔 및 핵(그림 2A, 하부 패널)을 보여준다. PLA 이벤트는 두 샘플 모두에서 뚜렷한 반점으로 표시되며, 하나는 DAPI ...

여기서, 병리학및 생리학적 유체 전단 응력 조건에 노출된 내피 세포에서 근접 계각 분석(PLA)을 사용하여 여러 SMAD 복합체를 동시에 시각화하고 분석하는 프로토콜을 수립합니다.

근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

이 프로토콜은 과학자들이 다른 전단 응력 조건하에서 전사 인자 복합체의 수를 정량적으로 비교할 수 있게 해주며 혈관 생물학 연구에 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 각각의 대조군을 포함하여 여러 항체 쌍의 조사를 동시에 허용하는 미세 유체 흐름 채널의 사용입니다. 우선, PBS에서 제조된 0.1%의 돼지 피부 젤라틴을 37도에서 30분간 채널에 추가하여 6개의 채널 슬라이드를 코팅합니다.M199 의 30 마이크로리터에서 밀리리터당 6세포로 2.5배 10배 의 밀도로 미리 코딩된 6개의 채널 슬라이드에서 젤라틴 용액및 종자 Huvecs에서 채널을 비웁니다. 가습 된 인큐베이터에서 세포가 섭씨 37도에서 1 시간 동안 부착되도록하십시오. 미리 경고된 M199 의 마이크로리터 60개를 각 저장소에 추가합니다.24 시간 후에 중간 보충을 가진 가습된 인큐베이터에서 2 일 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 실리콘 튜브를 유체 단위에 장착하고, 미리 경고된 M199 의 최소 10 밀리리터로 저장소를 채웁니다. 유체 단위를 튜브와 튜브를 펌프 시스템에 연결하고 세포 없이 사전 실행을 수행하여 배지를 평형화하고 남은 공기를 제거합니다.직렬 연결 튜브를 사용하여 6개 채널 슬라이드의 단일 채널을 연결합니다. 슬라이드의 첫 번째 및 마지막 채널을 유체 장치에 장착된 튜브에 연결합니다. 높은 수준의 스트레스에 세포를 노출하려면 적응 단계에서 현명하게 스트레스 단계를 늘려 30분당 평방 센티미터당 5개의 왕조의 증분 단계를 설정합니다.튜브의 덩어리를 사용하여 유체 전단 응력 노출 후 펌프에서 슬라이드를 분리하고 인큐베이터의 중간 유출을 피하고 얼음에 흐름 슬라이드를 전달합니다. 저수지에서 튜브를 분리하는 동안 손가락을 사용하여 저장소의 반대편을 닫아 채널의 기포를 포획하지 마십시오. 얼음에 흐름 슬라이드를 유지, 조심스럽게 저수지에서 매체를 흡인하지만 세포가 거주하는 채널에서.한 저수지에 PBS를 추가하고 다른 저수지에서 조심스럽게 흡인하여 90 마이크로리터의 냉멸 PBS로 샘플을 세척한 다음 모든 채널에서 반복합니다. PBS가 첨가된 동일한 저장소에 완충된 4%PFA 용액90마이크로리터를 추가하여 세포를 수정하고 입증된 바와 같이 다른 저수지에서 액체를 흡인시합니다. 6개의 채널에서 세포를 고정한 후, 샘플을 얼음에서 실온으로 옮기고 20분 동안 배양합니다.PBS를 하나의 저수지에 추가하고 모든 채널의 다른 저수지에서 조심스럽게 흡입하여 PBS로 세포를 세 번 세척하여 채널을 건조시키지 않도록주의하십시오. PBS에서 제조된 주변 15 밀리머암모늄 염화암모늄의 90마이크로리터를 저수지 중 하나에 추가하여 PFA에 대한 담금질 액세스 PFA. 다른 저수지에서 흡인하고 10 분 동안 세포를 배양합니다.빈 저수지에서 PBS에서 제조된 0.3%트리톤 X 100의 90 마이크로리터를 추가하여 세포를 투과화한다. 각 채널에 대한 다른 저수지에서 흡인하고 10 분 동안 배양 한 다음 이전에 설명 한 대로 PBS로 세 번 세척했습니다. 멸균 PLA 차단 용액의 90 마이크로 리터에서 하나의 저수지에.각 채널에 대해 다른 쪽에서 흡인하고 가습 챔버에서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다. PLA 항체 희석제 및 소용돌이에 1 차적인 항체를 추가합니다. 조심스럽게 저수지와 채널에서 차단 솔루션을 흡인.1차 항체 용액의 마이크로리터 30개를 즉시 빈 채널에 추가하여 슬라이드를 기울이면서 용액을 추가합니다. 모든 채널에 대해 반복하고 밤새 가습 챔버에서 섭씨 4도또는 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. PLA 항체 희석제에서 빼기 토끼와 마우스 PLA 프로브를 1~5개 희석시 희석시.90 마이크로리터의 워시 버퍼 A를 추가하고 입증된 대로 흡입하여 모든 채널을 두 번 세척하십시오. 세척 버퍼를 심은 후 PLA 프로브 용액 30 마이크로리터를 추가하고 가습 챔버에 배양합니다. 디이온화 수에서 결찰 버퍼를 1~5개 희석시키고 희석된 결찰 버퍼에서 1~40개의 리거스 효소를 희석시켰다.세척 버퍼 A를 세척하고 완전히 흡입한 후, 슬라이드를 기울이면서 빈 채널에 30 마이크로리터의 리칭 용액을 추가하고 가습 챔버에서 배양합니다. 증액 버퍼를 탈온화 된 물에 1 ~ 5 개를 희석 한 다음 얼음에 희석 된 증폭 완충제에서 폴리머 라제 효소를 1 ~ 80으로 희석시. 세척 버퍼 A를 세척하고 완전히 흡입한 후, 슬라이드를 기울이면서 빈 채널에 30 마이크로리터의 증폭 용액을 추가하고 가습 챔버에 배양합니다.DAPI를 세척 버퍼 B에서 1~500개까지 희석하고 세척 버퍼 B를 함유한 DAPI의 90마이크로리터를 추가하고 핵을 증기로 스며들기 위해 멸망시킴으로써 모든 채널을 한 번 세척한다. 그런 다음 모든 채널을 DAPI없이 세척 버퍼 B로 한 번 씻으시면됩니다. 세척 버퍼 B를 1~10으로 희석하고 희석된 세척 버퍼 B.aspirating wash 버퍼 B의 90 마이크로리터로 모든 채널을 한 번 세척한 후, 즉시 액체 장착 중간에 2~3방울을 넣고 모든 채널에 장착 매체를 분배합니다.이미징까지 가습된 환경에서 샘플을 섭씨 4도에 저장합니다. Huvecs는 높고 낮은 깎아지른 듯한 스트레스에 노출되었습니다. 낮은 전단 스트레스는 사이토솔과 핵에서 SMAD 단백질 상호 작용을 증가시켰습니다.단일 항체 대조군은 극소수의 신호에 나타나지 않았으며, 실험의 성공을 입증하였다. 항체 농도가 증가하여 세포당 PLA 이벤트가 더 많이 발생했지만, 높은 및 낮은 투명 응력 노출 세포 사이의 PLA 신호의 차이는 감소되었다. 차단 및 항체 희석을 위한 자체 제작 버퍼는 상업적 완충제의 대안으로 사용될 수 있다.상업 및 자체 수제 희석제 및 차단 용액에 대한 PLA 이벤트의 정량화는 세포및 핵 영역에서 PLA 신호의 동일한 패턴을 보여 주었다. 그러나 상업적 용액으로 셀당 총 PLA 이벤트 수가 더 많았습니다. SMAD 2/3의 조합, SMAD 4 항체는 면역 형광 실험에 적합하지 않은 곳에서 사용되었다.실험 대 대조군 조건에서 PLA 이벤트에 차이가 없었으며, PLA 이벤트를 검출하기 위해 올바른 항체 조합을 선택하는 것이 중요하다는 것을 나타낸다. 설명된 프로토콜은 SMAD와 다른 전사 인자 복합체의 상호 작용을 검출하기 위하여 적응될 수 있고 그러므로 영웅 경향이 있고 영웅 보호 조건에서 유전자 조절을 이해하는 것을 돕습니다.

visualization-quantification-tgfbmpsmad-signaling-under-different

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기 우리는 뼈 Morphogenetic의 단백질 (BMP) 고정 세포에 신호를 시각화하는 항체의 조합과 근접 내고 분석 (괞찮아)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 BMP4 자극을 아래에 효과기 - 단지를 활성화 내생 BMP의 핵 축적에 따라 자신의 수준 시간이 지남에를 정할 수있었습니다.

효과기 - 단지에게 사용 BMP4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

내 피 엽 전환 (EndMT)는 EndMT에 관련 된 세포 신호 경로 조사 하는 데 유용의 생체 외에서 유도 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 EndMT MS-1 내 피 세포에서 TGF-β와 치료에 의해 유발 됩니다.

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

여기, 우리는 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 하는 TGF-β/Smad3 신호 활동의 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜을 제시. 이 시스템 실시간 transcriptional 활동을 추적 하 고 두 단일 세포에 생체 외에서 그리고 살아있는 동물에 적용 될 수 있다모델.

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

우리는 실리콘 고무 (PDMS)로 제작 된 높은 처리량 견인력 분석방법을 제시한다. 이 새로운 분석은 다양한 생물학적 및 생물 의학 적 과정 및 질병 동안 세포 수축성의 물리적 변화를 연구하는 데 적합합니다. 우리는 상피-중간엽 전이 동안 수축성의 TGF-β 의존적 증가를 측정함으로써 이 방법의 유용성을 입증한다.

PDMS를 이용한 높은 처리량 견인력 현미경 검사법은 상피-중간엽 전이에 대한 성장 인자-β 변환의 용량 의존적 효과를 밝혀냅니다.

이 프로토콜의 목표는 관형 전기 스캐폴드에서 인간 대식세포와 근섬유세포의 동적 공동 배양을 실행하여 재료 중심 조직 재생을 조사하는 것이며, 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게 하는 생체 반응기를 사용하는 것입니다.

유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기

우리는 이 신호 통로에 관련시킨 단백질 및 유전자 발현을 공부해서 TGF β 신호 및 TGF-β 유도한 EMT를 조사하기 위하여 체계적인 워크플로우를 기술합니다. 방법은 서양 블로팅, 루시파라제 기자 분석, qPCR 및 면역 불피스테인링을 포함한다.

유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

골수 혈관 틈새의 시험관 내 모델은 중간엽 및 내피 세포를 프리캐스트 3D PEG 하이드로겔에 파종하여 설정됩니다. 틈새의 내피 네트워크, ECM 성분 및 ALP 활성은 사용된 성장 인자에 따라 다릅니다. 이 플랫폼은 진행된 암 모델에 사용할 수 있습니다.

이미징 마이크로플레이트에서 프리캐스트 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 하이드로겔을 사용하여 혈관화된 골수 틈새의 간단한 설정

배우세요 근접 리깅 분석을 이용해 전단 응력 조건에서 내피세포의 SMAD 복합체를 시각화하고 정량화하는 방법을. 혈관생물학 연구에 유용한 이 기법은 미세유체 채널을 활용합니다.

근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

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