마우스의 칼슘 과도 연구를 위해 대물 렌즈가 사전 고정된 베이스플레이팅과 미니스코프 사용

이 미니스코프는 베이스 플레이트 시술 중 치과용 시멘트의 수축 문제를 줄이고 두 가지 길이 구성에서 형광 신호의 미니스코프 기록 성공률을 높일 수 있습니다. 베이스도금 중에 형광 과도 현상이 관찰되지 않으면 칼슘 지시약의 발현과 뇌 슬라이스의 릴레이 렌즈 위치를 확인하십시오. 직경 1mm의 20게이지 정맥 카테터의 내부 바늘을 정위 암에 장착하는 것으로 시작하십시오.

카테터를 복부 옥수수 암모니스 1 안으로 목표 부위로 내립니다. 이어서, 미세주입 바늘을 복부 산수유암모니스 1 내로 분당 100 내지 200 마이크로미터의 속도로 내리고, 200 나노리터의 바이러스 벡터를 분당 25 나노리터의 속도로 표적 부위에 주입한다. 바이러스가 10 분 동안 확산되도록 허용 한 후 분당 100-200 마이크로 미터의 속도로 미세 주사 바늘을 빼냅니다.

릴레이 렌즈를 소독 한 후 이식 될 때까지 차가운 발열원이없는 식염수에 렌즈를 담그십시오. 열수축 튜브가있는 마이크로 불독 클램프를 사용하여 릴레이 렌즈를 잡고 분당 100-200 마이크로 미터의 속도로 대상 영역 위에 놓습니다. 그런 다음 치과 용 시멘트로 렌즈를 안정화시킵니다.

미니스코프를 설정하려면 대물 렌즈를 바닥에 고정하고 베이스 플레이트를 미니스코프에 조립합니다. 베이스 플레이트 외부에 10cm의 파라핀 필름을 감쌉니다. 재사용 가능한 접착 점토를 사용하여 정위 암 프로브로 미니스코프를 잡습니다.

대물 렌즈를 릴레이 렌즈 상단에 정렬하여 렌즈 사이에 가능한 한 적은 공간을 확보하십시오. 치과용 시멘트를 사용하여 시멘트가 파라핀 필름에만 닿도록 베이스 플레이트의 위치를 고정합니다. 치과용 시멘트가 건조되면 파라핀 필름, 베이스 플레이트 및 미니스코프를 제거하여 치과용 시멘트 베이스를 속이 빈 상태로 유지합니다.

성형 실리콘 고무로 릴레이 렌즈를 밀봉하고 실리콘 고무를 얇은 치과용 시멘트 층으로 덮습니다. 입체 기구에서 마우스를 분리하고 마우스를 회복실에 넣습니다. 베이스 도금의 경우 치과 용 시멘트 지붕의 얇은 층을 뼈 론저로 조심스럽게 자르고 실리콘 고무를 제거하십시오.

릴레이 렌즈 표면을 75 % 알코올로 청소하십시오. 조립판 옆에 고정 나사를 고정하여 미니스코프 바닥에 고정합니다. 초점 슬라이드를 주 하우징에서 약 2.7-3mm 떨어진 곳으로 조정합니다.

설정이 완료되면 미니스코프를 데이터 수집 보드에 연결하고 미니스코프를 컴퓨터의 USB 3.0 포트에 연결합니다. UCLA 팀에서 개발한 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다. 노출을 255, 게인을 64x로, 여기 LED를 5%로 조정미니스코프를 데이터 수집 소프트웨어에 연결하려면 연결 버튼을 클릭하고 릴레이 렌즈의 여백을 랜드마크로 고려하여 데이터 수집 소프트웨어의 라이브 스트림을 시청하십시오.

릴레이 렌즈를 찾으면 미니스코프 대물 렌즈를 릴레이 렌즈에 손으로 정렬합니다. 미니스코프의 다양한 각도와 거리를 조정하여 형광 신호 검색을 시작합니다. 미니스코프를 최적의 위치에 놓고 스테레오탁스 암을 미니 스코프로 이동하고 재사용 가능한 접착 점토로 미니스코시프를 스테레오택시 암에 부착합니다.

X, Y 및 Z 암을 약간 조정하여 최상의 보기를 검색합니다. Z 축에서 이어 바, 톱니 바 또는 재사용 가능한 접착 점토를 돌려 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 표면 사이의 각도를 조정합니다. 바이러스 발현 및 수정체 이식은 염기도금 동안 적어도 하나의 세포가 형광 과도 상태를 대체할 때 성공적입니다.

최적의 위치가 변경되지 않도록 관심 영역을 모니터링하면서 가능한 한 적은 양의 치과용 시멘트로 베이스 플레이트를 단단히 고정합니다. 대표적인 연구에서, 더미 베이스 플레이팅의 절차는 원래 절차보다 베이스 플레이트 위치의 이동이 더 작기 때문에 유리한 것으로 입증되었습니다. 베이스 플레이트의 이동은 치과용 시멘트의 높이에도 영향을 받았습니다.

두개골 위 0.5cm에 고정 된베이스 플레이트는 두개골 위 1cm에 고정 된베이스 플레이트보다 훨씬 덜 이동했습니다. 염기 도금 절차 동안 성공적인 영상화의 예에서 혈관과 함께 형광 과도 현상이 마취된 동물에서 발견되었다. 형광 과도 현상은 베이스도금 후 5일 후에 관찰되었는데, 마우스가 홈 케이지에서 위치를 약간만 이동하면서 자유롭게 행동하는 경우에도 관찰되었습니다.

후속 마우스의 칼슘 영상화가 수행되었다. 몇몇 경우에, 균일한 배경이나 백혈구 여백의 가시성을 제외하고는 아무것도 없는 것과 같은 기저 도금 절차 중에 문제가 발생했습니다. 형광 과도 현상 없이.

베이스 플레이트를 가능한 한 적은 양의 치과 용 시멘트로 대상 부위에 단단히 고정하는 것이 중요합니다. 슬레이트 기술을 통해 연구원은 이 전반에 걸쳐 신경 활동을 종단적으로 관찰할 수 있습니다. 적절한 라이센스가 있으면이 절차는 시야에서 신경망을 관찰하는 데에도 적용될 수 있습니다.