Name: 유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 배우세요 유방암 뇌 전이 종양의 실시간 약물 및 방사선 반응을 측정하는 ex vivo 뇌 슬라이스 모델을 사용하는 방법입니다. 이 기법은 생리학적으로 관련된 환경에서 뇌-종양-숙주 상호작용을 유지하며 다중 치료제를 신속하게 테스트할 수 있습니다.

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Julia Farnan, Kayla Green 및 Tiziana DeAngelis의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 펜실베니아 연방 유니버설 연구 향상 보조금 프로그램 (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) 및 W.W. Smith Charitable Trusts (EjH)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

이 프로토콜은 Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 동물 관리 지침을 승인하고 준수합니다. Nu/Nu 흉선 여성 마우스(6-8주령)를 본 연구에 사용하였다.
1. 종양 세포의 두개내 주사
<ol><li>모든 장비 (핀셋, 가위, 봉합 가위, 핸드 드릴)를 오토클레이브의 건조 사이클 하에서 살균 표시기를 포함한 살균 파우치에서 최대 45 분 동안 멸균하십시오. 여러 동물에 대한 수술을 실시하는 경우 가열 된 구슬 살균기 (최대 3x)를 사용하여 동물 사이의 도구를 멸균하십시오.</li>
	<li>수술 시작 전에 사용자의 동물 관리 프로토콜 (예 : 이소플루란 (유도 4 %, 유지 1-2 %)에 따라 마우스를 마취시키고 진통 (피하, 0.1mg / kg 부프레노르핀 SR-LAB의 0.1mL)을 투여하십시오. 발가락을 꼬집고 최적의 마취 깊이를 보장하십시오.</li>
	<li>마우스를 입체 택시 프레임에 넣고 표준 이어 바를 사용하여 머리를 고정시킵니다 (그림 1A). 안과 연고를 눈에 바르십시오.</li>
	<li>절개 전에 요오드 면봉과 70 % 에탄올의 반복적이고 번갈아 가며 적용하여 머리 표면을 살균하십시오.</li>
	<li>외과 적 메스를 사용하여 마우스의 뇌를 두 개의 대칭 반쪽으로 나누어 두개골을 노출시키는 상상의 선에 약간 대각선 각도로 피부를 통해 1cm 중간 선을 절개하십시오. 면봉으로 피를 닦으십시오.</li>
	<li>주사 부위를 노출시키기 위해 피부를 옆으로 편향시킵니다 : 오른쪽 2mm, 브레그마 (+2 평측 (+2ML), +1 로스트랄 / 코달 (+1RC)을 기준으로 앞으로 1mm.</li>
	<li>버 비트 (0.73 mm)를 사용하여 두개골 +2ML, + 1RC를 브레그마에 관통하고 약간의 압력과 비틀림 동작으로 구멍을 뚫습니다.</li>
	<li>뇌 주사 주사기를 사용하여 초기에 3.5mm 깊이의 주사기를 뇌에 삽입하여 멸균된 1x PBS에 100,000 MDA-MB-231BR (GFP-루시페라아제를 안정적으로 발현하는) 세포/μL 용액 5μL를 주입합니다.</li>
	<li>주사기가 2 분 동안 정착하도록하십시오. 약 1mm를 위로 당기고 2 분 후에 천천히 볼륨의 전반부를 주입하십시오.</li>
	<li>나머지 주사를 주입하기 전에 2 분 정도 더 기다린 다음 최종 주사 후 3 분 후에 주사기를 천천히 당깁니다. 참고 : 느린 주사는 부피가 뇌 조직에 잘 흡수되고 주사기를 당긴 후 누출이 발생하지 않도록하여 암세포가 의도 된 부위 외부에서 자랄 수 있음을 경험적으로 보여줍니다.</li>
	<li>두개골의 주사 부위에 뼈 왁스를 바른 다음 폴리 프로필렌 봉합사를 사용하여 조직을 봉합하십시오. 마우스는 마취 제거 후 5 분 이내에 회복됩니다.</li>
	<li>수술 직후 약 10 분, 3 시간 후 및 다음날 행동을 모니터링하여 식염수 주사, 부드러운 음식 등을 포함한 특별한 치료가 빠른 회복을 돕기 위해 필요한지 확인하십시오.</li>
	<li>이미징 시스템에서 생체 발광 이미징을 통해 종양 성장을 모니터링합니다.<ol>
<li>이를 위해 먼저 이미징 시스템에서 산소와 이소플루란을 켭니다. 둘 다 이미징 박스 외부의 별도의 챔버에 분배되도록 허용하십시오.</li>
		<li>그런 다음 소프트웨어를 켜고 계측기를 초기화 한 다음 마우스 몸체 전체를 시각화하고 캡처하는 데 적합한 옵션을 선택하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스를 이소플루란으로 별도의 챔버에 놓고 발가락을 꼬집어 최적의 마취 깊이를 보장하십시오. 마우스를 30mg/mL 루시페린 200μL로 복강내 주사한다.</li>
	<li>마우스의 위를 산소와 이소플루란이 공급된 이미징 챔버의 코렛으로 옮깁니다. 챔버를 잠그고 2분 노출을 선택하여 이미징을 시작합니다.</li>
	<li>소프트웨어의 ROI (관심 영역) 도구를 사용하여 종양의 생체 발광 신호를 정량화하십시오.</li>
	<li>종양 크기를 분석하려면 원 모양 도구를 선택하고 종양 모양과 크기 주위에 맞춥니다. ROI를 측정하고 총 판독값을 보고합니다.</li>
	<li>뇌 절편을 생성하기 전에 12-14일 동안(또는 루시퍼라제가 약 7.0 x 106 단위에 도달할 때까지) 고형 종양 성장을 허용하십시오(그림 1B). 참고: 주사할 세포의 수를 늘리면 종양이 더 빨리 성장할 수 있습니다. 따라서 뇌 조각의 생성은 12 일 이전에 발생할 수 있습니다. 반면에, 더 큰 종양은 14 일 동안 성장하도록 허용되면 더 많은 GFP + 슬라이스로 이어질 것입니다. 14 일 후, 생쥐의 건강은 빠르게 악화되기 시작합니다. 따라서 동물 건강 모니터링은 10 일 시점 이후에 하루에 한 번으로 증가해야하며, 통증 및 / 또는 불편 함의 징후를 보이는 마우스는 조각을 생성하는 데 사용해야합니다.</li>
</ol>2. 뇌 조각 생성
참고: 멸균된 층류 후드에서 뇌 분리 후 단계를 수행하십시오. 전형적으로 MDA-MB-231BR 세포를 주입한 마우스로부터 종양 세포(루시퍼라제 신호)를 포함하는 35-40개의 개별 슬라이스를 생성할 수 있다(도 1C).
<ol><li>오토클레이브의 모든 수술 도구를 멸균하십시오. 멸균 층류 후드에 티슈 슬라이서를 놓고 70 % 에탄올로 모든 도구와 도구를 청소하십시오.</li>
	<li>두개내 MDA-MB-231BR 세포 주사 후 12-14일 후, 1.2에 기재된 바와 같이 사용자의 동물 관리 프로토콜에 따라 마우스를 마취한다. 발가락을 꼬집고 최적의 마취 깊이를 보장하십시오.</li>
	<li>그들의 뇌를 얼음처럼 차가운 (4°C) 내로 급속히 (45초 이내) 놓고, 다음으로 구성된 수크로스-ACSF를 제거한다: 280 mM 수크로스, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mMCaCl2,20 mM 글루코스, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-아스코르베이트, 3 mM 티오우레아, 2 mM Na+, 29 mM 피루베이트; pH = 7.3.</li>
	<li>날카롭고 멸균 된 메스 또는 면도날을 사용하여 뇌의 바닥 부분을 포함하여 모든면에서 종양이 포함되지 않은 뇌의 과도한 부분을 잘라냅니다.</li>
	<li>뇌의 모양을 완벽하지 않은 큐브로 가져와 60mm 접시 뚜껑의 ACSF 젖은 여과지에 평평하게 앉아 슬라이스를 용이하게하십시오. 참고 : 종양이 자랄 것 같지 않은 뇌의 여분의 조직은 슬라이스하기 전에 제거되어 대부분 GFP + 슬라이스를 생성 할 수 있으며 기기 표면에 안정적이며 슬라이스로 인한 진동에 의해 방해받지 않는 뇌 모양을 만듭니다.</li>
	<li>미리 젖은 (ACSF 포함) 여과지 원 몇 장을 절단 플랫폼 위에 놓고 차단 된 조직을 그 위에 놓습니다.</li>
	<li>제공된 눈금자에서 계측기의 절단 크기를 2 또는 2.5 단위로 설정하여 조직을 200-250 μm 섹션으로 슬라이스합니다. 참고: 최대 350μm 또는 100μm의 얇은 슬라이스가 가능합니다. 200μm 이< 조각의 경우 비브라톰 또는 압축기를 사용하십시오.</li>
	<li>페인트 브러시 (sable)를 사용하여 뇌 조각을 자당 ACSF가 들어있는 접시로 옮기고 27G 바늘을 사용하여 가벼운 현미경으로 조각을 분리하십시오.</li>
	<li>형광 현미경으로 GFP 양성 슬라이스를 확인하고 멸균된 1mL 분리 피펫(와이드 오프닝)을 사용하여 2-3mL의 성인 슬라이스 배지(뉴로베이스 배지 A, 2% B12 보충제, 1% N2 보충제, 1% 글루타민, 0.5% 글루코스, 10U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신)가 들어있는 새로운 60mm 접시로 옮깁니다. 참고 : 뇌 표면 위로 자라는 종양 세포를 포함하는 뇌 조각 (아마도 주사 세포 누출 등으로 인한 것일 수 있음)은 제외됩니다.</li>
	<li>3-5 슬라이스를 각각 30 mm, 0.4 μm 공극 크기 조직 배양 삽입물 상에 6-웰 플레이트에 넣고 서로 성장할 수 없는 거리로 옮긴다.</li>
	<li>P1000 피펫을 사용하여 인서트의 표면으로부터 과량의 배지를 제거하고, 각 인서트 아래에 1 mL의 성인 마우스 슬라이스 배지를 첨가하고, 슬라이스하기 전에 인큐베이터에서 배지를 평형화시킨다.</li>
	<li>영상화하기 전에 조직을 24시간 동안 37°C, 5%CO2, 및 95% 습도에서 인큐베이션한다.</li>
</ol>3. 조각의 IVIS 이미징
참고: 멸균된 층류 후드에서 루시퍼라아제 및 억제제 첨가 단계를 수행하십시오.
<ol><li>30mg/mL 루시페린 용액 5μL를 포셉으로 인서트를 들어올려 웰의 배지에 루시페린을 첨가한 후 다시 웰에 넣어 인서트 아래의 배지에 피펫을 넣습니다.</li>
	<li>뚜껑이 있는 6웰 플레이트를 고정식 카메라 아래의 기기의 이미징 챔버 안에 놓고 챔버 도어를 잠급니다.</li>
	<li>소프트웨어를 열고 계측기를 초기화합니다.</li>
	<li>이미지당 하나의 웰만 시각화하고 캡처할 수 있는 카메라 설정을 선택합니다. 스테이지를 위로 이동(5cm의 FOV)하고 카메라 바로 아래에 이미지화해야 하는 우물을 놓습니다.</li>
	<li>종양이 방출할 루시퍼라아제의 강도에 따라 이미징 시간을 가장 적절하게 설정하며, 이는 10초에서 5분까지 다양할 수 있습니다. 먼저 10초로 설정한 다음 신호가 낮으면 증가하되 실험이 끝날 때까지 모든 시점과 조건에 대해 일관성을 유지합니다(그림 1D).</li>
	<li>ROI 도구 (원 모양 도구)를 사용하여 종양 모양과 크기 주위에 맞추고, ROI를 측정하고, 슬라이스에서 각 종양의 생체 발광 신호를 정량화하기 위해 총 판독 값을보고하십시오.</li>
	<li>플레이트를 멸균 층류 후드로 다시 가져 와서 포셉을 사용하여 우물에서 인서트를 약간 들어 올립니다.</li>
	<li>배지를 흡인하고 1 mL의 신선한 배지로 교체 한 다음 삽입물을 웰에 다시 넣으십시오.</li>
	<li>슬라이스가 억제제, 대사산물 등과 같은 다양한 화합물로 처리되는 실험을 위해, 1.5 mL 튜브의 뇌 슬라이스 배지 1.2 mL에 적절한 농도의 시약을 준비한 다음 슬라이스가 들어있는 웰로 1 mL를 옮긴다.</li>
	<li>연구 기간 동안 48 시간마다이 과정을 반복하십시오.</li>
</ol>4. 생체외 뇌 조각에서 종양 성장의 라이브 이미징
참고: 라이브 이미징 중에 추가 매체를 추가할 수 없으므로 실험 기간을 지속하기에 충분한 배지(1.5mL)를 삽입하여 공급하십시오.
<ol><li>6-웰 플레이트를 인큐베이터 내부의 자동화된 현미경 플레이트 홀더 위에 놓는다(37°C, 5%CO2, 및 95% 습도).</li>
	<li>소프트웨어를 열고 첫 번째 사분면에서 밝은 필드를 켜서 슬라이스를 보는 데 필요한 노출을 조정합니다. 슬라이스의 위치(좌표 "xy")를 찾으려면 두 번째 사분면의 "xy"로 탐색하여 현미경의 좌표 "xyz"를 제어합니다.</li>
	<li>이 실험에 사용 된 랩웨어로 6 웰 플레이트를 선택하십시오. ROI 맵 편집기를 선택하고 새 ROI를 선택하여 해당 위치를 등록하고 해당 ROI를 추가 및 저장합니다.</li>
	<li>다른 웰의 다른 모든 관심 영역에 대해 동일한 단계를 반복합니다. 모든 ROI를 추가한 후 모든 ROI를 저장합니다.</li>
	<li>프로토콜에서 기존 항목 지우기를 선택하고 획득에서 타임랩스를 선택한 다음, 관심 채널(이 경우 GFP)을 선택합니다.</li>
	<li>초점 설정에서 자동 초점을 끄고 모든 슬라이스에 적합한 초점으로 수동으로 조정합니다. 마지막으로 Brightfield 강도와 형광 채널 여기 및 노출 시간을 적절한 수준으로 조정하십시오.</li>
	<li>48시간 동안 15분마다 이미지를 수집하도록 프로토콜을 설정합니다.</li>
	<li>프로토콜을 저장하고 실행합니다. 실험이 끝나면 저장된 파일에는 모든 ROI에 대해 캡처 된 밝은 필드와 GFP 이미지가 모두 포함됩니다.</li>
	<li>비디오에서 이미지를 결합하려면 관심 있는 모든 이미지의 이름을 동일한 이름 다음에 이진수로 바꿔 캡처된 순서대로 구성합니다(예: ROI1(1), RO1(2) ...)</li>
	<li>ImageJ를 열고 파일 > 이미지 시퀀스 가져 오기를 클릭하여 이미지> 가져옵니다. 목록에 나타나는 파일 이름을 선택하고 비디오에 대해 선택한 파일을 식별하는 파일 이름 포함 상자에 파일 이름의 내용을 씁니다.</li>
	<li>결합된 이미지를 파일 > AVI에 다른 이름으로 저장> 아래에 저장합니다.</li>
</ol>5. 생체외 뇌조직의 MTS 분석 및 면역조직화학
<ol><li>MTS ASSAY<ol>
<li>조직의 가장자리를 따라 각 슬라이스 아래의 조직 배양 막을 절단하여 슬라이스를 절제하고 멤브레인에 여전히 부착 된 조직을 96-웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
		<li>MTS 시약을 배양 배지 및 0.01% 트리톤(1x)과 1:5 비율로 혼합하여 조직 내의 용액의 침투를 허용하도록, 각 웰에 120 μL의 총 부피로 첨가한다.</li>
		<li>4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 에이전트로 사용하여 뇌 조각을 실행 불가능하게 만들고이 실험에 대한 긍정적 인 대조군으로 만듭니다. MTS 분석을 진행하기 전에 관심 있는 뇌 조각을 RT(실온)에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 4% PFA에 담그십시오.</li>
		<li>MTS 시약이 슬라이스에서 4시간 동안 반응하도록 허용하고, 웰에서 슬라이스를 제거하고, 슬라이스가 없는 빈 웰을 포함한 모든 조건에 대해 490nm에서 흡광도를 측정하였다.</li>
		<li>판독값을 디지털 캘리퍼 눈금자로 측정된 조직 슬라이스 영역의 함수로 보고합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>면역조직화학 제제<ol>
<li>멤브레인 인서트 표면에 부착된 뇌 조각을 4°C에서 하룻밤 동안 10% 포르말린에 담그십시오.</li>
		<li>임베딩, 처리, 차단을 수행하고 조직의 얼룩지지 않은 슬라이드를 생성합니다. 표준 면역조직화학 염색 프로토콜을 사용하여 H&E, Ki-67, 감마-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI 염색</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 생체외 뇌 조각에 종양의 조사
<ol><li>종양을 6 Gy (310 kVp x-rays)로 조사하십시오. 참고: 6Gy의 총 용량을 얻기 위해 입력된 단위는 R 단위(Victoreen 전기계를 사용하여 측정됨)와 앞서 설명한18과 같이 골무, 공기 밀도 및 cGy/R에 대한 보정을 고려한 후 3522 단위입니다. 노출 시간은 130.9 초입니다.</li>
	<li>0.25mm Cu +1mm Al 추가 여과, 50cm SSD, 분당 125cGy를 사용합니다.</li>
	<li>기본 표준에 대해 보정된 빔 내 이온화 챔버에 의해 선량측정을 수행합니다.</li>
	<li>습도, 온도 및 기압에 대해 매일 보정하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언 할 재정적 인 갈등이 없습니다.

이 연구는 외래식 이종이식편 뇌종양에 대한 새로운 생체외 뇌 배양 방법을 확립한다. 우리는 BCBM 세포 MDA-MB-231BR 세포가 마우스의 뇌에 두개내 주사되어 생체외 뇌 절편에서 생존하고 성장할 수 있음을 보여줍니다. 이 연구는 또한 두개내 주사 된 U87MG 교모세포종 (GBM) 세포를 테스트했으며 이러한 암세포가 뇌 조각에서 생존하고 성장한다는 것을 발견했습니다 (데이터는 표시되지 않음). 우리는이 모델이 BCBM과 GBM을 넘어 폐암과 흑색종을 포함하여 뇌로 쉽게 전이되는 다른 암으로 확장 될 수 있다고 믿습니다. 유방암 뇌영양 세포의 두개내 주사는 뇌종양을 생성하는 간단하고 빠른 방법이며 뇌 거대전이(25)에 적합한 모델로 간주되기 때문에 선택되었다. 그러나, 유사한 종양 슬라이스 모델은 심장 내 접종 또는 원발성 지방 패드로의 동위원소 주사로부터 개발될 수 있다. 무혈청 배지에서 성인 뇌 절편을 성장시키고 48시간마다 신선한 배지를 공급함...

유방암 뇌 전이 (BCBM)는 세포가 원발성 유방 종양에서 뇌로 퍼질 때 발생합니다. 유방암은 폐암 후 뇌 전이의 두 번째로 빈번한 원인이며, 전이는 환자의 10-16 %에서 발생합니다1. 불행히도, 뇌 전이 환자의 >80 %가 뇌 전이 진단 후 일년 이내에 사망하고 신경 기능 장애로 인해 삶의 질이 저하되기 때문에 뇌 전이는 여전히 치료할 수 없습니다2. 보다 효과적인 치료 옵션을 확인하는 것이 시급합니다. 단층 이차원 또는 입체 배양 모델은 실험실에서 치료제를 테스트하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나, 그들은 종양 표현형과 성장의 주요 동인인 복잡한 BCBM 미세환경을 모방하지 않는다. 이들 모델이 유용하지만, 이들은 복잡한 종양-기질 상호작용, 독특한 대사 요건, 및 종양의 이질성을 포착하지 못한다3. 종양-기질 상호작용 및 미세환경 이질성을 보다 충실하게 재조정하기 위해, 우리 그룹과 다른 사람들은 환자 유래 종양 세포(원발성 또는 전이성) 또는 암 세포주 4,5,6을 이용한 유기형 뇌 전이 "슬라이스" 배양물을 생성하기 시작했다. 고전적인 시험관내 시스템과 비교하여, 이러한 단기 생체외 모델은 대규모 동물 코호트에서 전임상 평가 전에 새로운 치료제를 스크리닝하기 위한 보다 관련성이 높은 조건을 제공할 수 있다.
Ex vivo 모델은 주로 다양한 암의 성공적인 치료법을 확인하기 위해 구축되고 성공적으로 사용되었습니다. 그들은 며칠의 평가가 필요하며 추가로 환자 별 약물 검사에 맞출 수 있습니다. 예를 들어, 인간 방광 및 전립선암 생체외 조직은 도세탁셀 및 겜시타빈7의 용량 의존적 항종양 반응을 나타내었다. 유사한 결장직장 암종 생체외 조직이 화학요법 약물인 옥살리플라틴, 세툭시맙 및 펨브롤리주맙8을 스크리닝하기 위해 개발되었다. 본 출원은 기질 환경과 췌장덕트 선암종 9,10의 유전형 및 표현형 특성 사이의 필수적인 상호작용을 고려하여 췌장암에서 널리 사용되어 왔다. 더욱이, 이러한 유기형 모델은 머리, 목, 위 및 유방 종양(11,12)에서 유사한 스크리닝을 위해 개발되었다.
여기서, 이종이식편된 유방암 뇌전이성 종양 세포의 생체외 뇌 슬라이스 모델이 그들의 미세환경에서 생성되고 있다. 마우스는 TNBC 전이 14,15의 공통 부위인 대뇌 피질 정수리 엽에 유방암 뇌 전이성 뇌 영양 MDA-MB-231BR 세포13을 두개내 주사하고 종양을 발생시키도록 허용하였다. 뇌 절편은 이들 이종이식편된 동물로부터 생성되었고,16,17에 기재된 바와 같이 유기형 배양물로서 생체외를 유지하였다. 이 신규한 생체외 모델은 뇌 실질종 내에서 BCBM 세포의 성장 분석을 허용하고 뇌 미세환경 내의 종양 세포에 대한 치료제 및 방사선 효과를 시험하는데 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>1mL 주사기, 슬립 팁</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2 바늘</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Genessee</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>자동 현미경 및 LUMAVIEW 소프트웨어</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>B27 (GEM21)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-160</td><td></td></tr><tr><td>비커 50mL</td><td>Fisher</td><td>10-210-685</td><td></td></tr><tr><td>무딘 검은 담비 붓, 크기 #5/0</td><td>전자 현미경 과학</td><td>66100-50</td><td></td></tr><tr><td>뼈 왁스</td><td>ModoMed</td><td>DYNJBW25</td><td></td></tr><tr><td>뇌 주입 주사기</td><td>Hamilton Company</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-250</td><td></td></tr><tr><td>절단 카스파제 3 항체</td><td>세포 신호</td><td>14220S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin 칼륨 소금</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>양날 면도날</td><td>VWR</td><td>55411-060(95-0043)</td><td></td></tr><tr><td>여과지, 양적 원, 4.25 cm</td><td>Fisher</td><td>09-805a (1001-042)</td><td></td></tr><tr><td>Fine sable paintbrush #2/0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>66100-20</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Gamma-H2AX 항체</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-0300</td><td></td></tr><tr><td>GFP 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9996</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마 Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>글루타민 (200 mM)</td> <td>Corning cellgrow</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>H& E 및 KI-67</td><td>Jefferson Core Facility 병리학</td><td></td><td></td>염색</tr><tr><td>핸드 드릴 세트, 마이크로 미니 트위스트 드릴 비트</td><td>Amazon</td><td>YCQ2851920086082DJ</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 유리 산,</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-1</td><td></td></tr><tr><td>Just for mouse 입체 프레임</td><td>하버드 장치 (Holliston, MA, USA).</td><td>72-6049, 72-6044</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>대형 수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231BR 세포</td><td>친절하게 제공: Dr. Patricia Steeg</td><td>Ref 14</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>마우스 이미징 장치</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS 200 시스템</td><td></td></tr><tr><td>마우스 이미징 소프트웨어</td><td>Caliper Life Sciences(미국 매사추세츠주 월섬).</td><td>리빙 이미지 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Tecan 스파크</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마운팅 솔루션</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>MTS 시약</td><td>Promega CellTiter 96 수용액</td><td>(Cat:G3582)</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nu / Nu 흉선 마우스</td><td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>펜 / 연쇄상 구균</td><td>Life Technologies</td><td>145140-122</td><td></td></tr><tr><td>폴리 프로필렌 봉합</td>사 <td>Medex 공급</td><td>ETH-8556H</td><td></td></tr><tr><td>포비돈 요오드 면봉 스틱</td><td>DME 공급 미국</td><td>Cat : 689286X</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드 #11 (pk of 100)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들 #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>스패튤라/프로브</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-13</td><td></td></tr><tr><td>SS 양면 면도날 (American safety razor co (95-0043))VWR</td><td></td> <td>55411-060</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Amresco</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>외과 메스</td><td>Exelint International</td><td>D29702</td><td></td></tr><tr><td>조직 헬기</td><td>Brinkman</td><td>(McIlwain 유형)</td><td></td></tr> <tr><td>조직 배양 인서트</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50 또는 PICM03050</td><td></td></tr>선 <tr><td>기계</td><td>정밀도 250 kVp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 ex vivo 뇌 슬라이스 모델

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

뇌 전이는 이러한 종양이 치료하기 어렵고 열악한 임상 결과와 관련이 있기 때문에 여성에게 유방암의 심각한 결과입니다. 유방암 뇌 전이성 (BCBM) 성장의 전임상 마우스 모델은 유용하지만 고가이며, 뇌 실질 내에서 살아있는 세포 및 종양 세포 침윤을 추적하기가 어렵다. 여기에 제시된 것은 두개골 내 주사된 유방암 뇌-추구 클론 서브라인을 함유하는 이종이식편된 마우스로부터의 생체외 뇌 슬라이스 배양을 위한 프로토콜이다. MDA-MB-231BR 루시퍼라아제 태깅된 세포를 Nu/Nu 암컷 마우스의 뇌에 두개내 주사하고, 종양 형성 후, 뇌를 분리하고, 슬라이스하고, 생체외 배양하였다. 종양 절편을 영상화하여 루시퍼라아제를 발현하는 종양 세포를 확인하고 최대 10일 동안 뇌 실질에서 증식 및 침윤을 모니터링하였다. 또한, 프로토콜은 이온화 방사선 또는 화학요법으로 치료한 후 종양 세포의 성장 및 침습적 거동을 이미지화하기 위한 타임랩스 현미경의 사용을 기술한다. 치료에 대한 종양 세포의 반응은 라이브 이미징 현미경, 생체 발광 강도 측정, BCBM 세포를 포함하는 뇌 조각에 대한 조직학 수행으로 시각화 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 생체외 슬라이스 모델은 뇌 미세환경 내에서 개별 환자의 유방암 뇌 전이성 성장을 표적으로 하는 개인화된 약물을 식별하기 위해 신규한 치료제를 단독으로 또는 방사선과 조합하여 신속하게 시험하는데 유용한 플랫폼이 될 수 있다.

MDA-MB-231BR-GFP-루시퍼라제 세포를 상기 설명된 바와 같이 4-6주령의 Nu/Nu 마우스의 우반구에 두개내 주사하고(도 1A) 12-14일 동안 성장시키고, 이 기간 동안 종양 성장을 생체발광 영상에 의해 모니터링하였다(도 1B). 우리는 다른 그룹19에 의해보고 된 것처럼 100,000 개의 암세포를 두개골 내로 주사했지만 20,000 세포만큼 낮은20을 주입 할 수 있습니다. 뇌 슬라이스 생성 후(도 1C), 전술한 바와 같이, 슬라이스를 IVIS 상에서 영상화하여 24시간 인큐베이션 후 생체발광 영상화를 통해 종양 존재를 확인하였다. 이는 0일로 간주됩니다. 종양 성장은 매 48 h마다 생체발광 신호전달을 정량화함으로써 모니터링되었고, 이는 6일에 걸친 점진적 성장을 ...

우리는 유기형 뇌 슬라이스 모델에서 유방암 뇌 전이성 세포의 실시간 약물 및 방사선 반응을 측정하기위한 프로토콜을 소개합니다. 상기 방법은 뇌 미세환경 계면 내에서 생체외 방식으로 유방암으로부터의 뇌 전이에 대한 다양한 치료법의 치료 효과를 조사하기 위한 정량적 검정을 제공한다.

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

이 프로토콜은 뇌 전이성 종양 세포의 형성과 미리 형성된 종양에 대한 약물 효능 및 방사선의 신속한 테스트를 허용하는 생체외 뇌 절편의 생성을 허용합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 뇌 - 종양 - 숙주 상호 작용을 유지하는 생리 학적 관련 환경에서 여러 약물 또는 치료법을 신속하게 테스트 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 뇌 전이성 세포가 어떻게 성장하고, 생존하고, 뇌 실질마를 침범하는지 이해하고 암 성장 및 확산에서 뇌 종양 미세 환경의 역할을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 Lorela Ciraku와 Emily Esquea, 내 실험실의 박사 학위 후보자가 될 것입니다. 우선, 마취 된 마우스를 입체 택시 프레임에 넣고 표준 이어 바를 사용하여 머리를 고정시킵니다. 절개 전에 요오드 면봉과 70 % 에탄올을 번갈아 가며 반복하여 머리 표면을 세 번 살균하십시오.외과 적 메스를 사용하여 상상의 축에 대각선 각도로 한 센티미터 중간 선 절개를 만들어 마우스의 뇌를 두 개의 대칭 반쪽으로 나누어 두개골을 노출시킵니다. 면봉으로 혈액을 닦은 후 피부를 옆으로 편향시켜 주사 부위를 노출시킵니다. 0.73 밀리미터 버 비트를 사용하여 두개골에 침투하고 약간의 압력과 비틀림 동작으로 구멍을 뚫습니다.GFP 루시페라아제를 안정적으로 발현하는 5마이크로리터의 세포를 주입하려면 뇌에서 3.5mm 깊이까지 고정밀 주사기를 삽입합니다. 두 분 동안 정착 한 다음 주사기를 약 한 밀리미터 위로 당깁니다. 두 분 후, 천천히 첫 번째 절반 볼륨을 주입하고 나머지 볼륨을 주입하기 전에 또 다른 두 분 동안 기다립니다.세 분 후에 천천히 주사기를 당깁니다. 두개골의 주사 부위에 뼈 왁스를 바르고 폴리 프로필렌 봉합사로 조직을 봉합하십시오. 수술 직후 마우스의 행동을 주기적으로 모니터링하여 빠른 회복을 돕기 위해 식염수 주사와 부드러운 음식을 포함한 특별한 치료가 필요한지 확인하십시오.생체 발광 이미징을 통해 종양 성장을 모니터링하려면 먼저 이미징 시스템에서 산소와 이소플루란을 켜고 이미징 박스 외부의 별도의 챔버에 둘 다 분배되도록 합니다. 그런 다음 소프트웨어를 켜고 계측기를 초기화 한 후 마우스 몸체 전체를 시각화하고 캡처하는 데 적합한 옵션을 선택하십시오. 다음으로, 마우스를 산소 및 이소플루란이 공급된 이미징 박스 외부의 챔버로 옮긴다.마우스가 마취 효과를 받으면 마우스를 복강 내 루시페린 밀리리터 당 30 밀리그램의 200 마이크로 리터로 주사하십시오. 마우스를 이미징 챔버 코 입술에 아래를 향하게하는 위장을 이미징 챔버에 놓습니다. 챔버를 잠그고 두 분 시간 노출을 선택하여 이미징을 시작한 다음 이미징을 완료합니다.멸균 된 층류 후드에 조직 슬라이서를 놓은 후 모든 도구와 도구를 70 % 에탄올로 청소하십시오. 마우스를 안락사시킨 후, 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 수크로스-ACSF 용액에 빠르게 넣는다. 주걱을 사용하여 60mm 접시 뚜껑에 ACSF로 젖은 여과지에 뇌를 옮깁니다.날카롭고 멸균 된 면도날을 사용하여 뇌의 바닥 부분을 포함하여 종양이 포함되지 않은 뇌의 과도한 부분을 잘라 뇌의 모양을 완벽하지 않은 큐브로 만듭니다. ACSF로 젖은 여과지 몇 장을 절단 플랫폼 위에 놓은 후 차단된 조직을 여과지 위에 놓습니다. 조직을 200~250마이크로미터 두께의 섹션으로 분할하려면 공급자 눈금자에서 절단 크기를 2 또는 2.5단위로 설정하고 절단을 시작합니다.페인트 브러시를 사용하여 뇌 조각을 수크로오스-ACSF가 들어있는 접시에 옮기고 27 게이지 바늘을 사용하여 광학 현미경으로 조각을 분리하십시오. GFP 양성 슬라이스를 형광 현미경으로 확인한다. 그런 다음 넓은 개구부가있는 멸균 된 한 밀리리터의 깨진 피펫을 사용하여 식별 된 조각을 두 세 밀리리터의 성인 슬라이스 배지가 들어있는 새로운 60 밀리미터 접시로 옮깁니다.그런 다음, 세 개에서 다섯 개의 슬라이스를 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 있는 각 조직 배양 삽입물 상으로 안전한 거리로 옮긴다. 인서트의 표면으로부터 과량의 배지를 제거한 후, 각 인서트 아래에 평형화된 성인 마우스 슬라이스 배지 한 밀리리터를 첨가한다. 이미징 전에 조직을 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 및 습도 95%에서 24시간 동안 배양합니다.밀리리터 루시페린 용액 당 30 밀리그램의 다섯 마이크로 리터를 멸균 후드 내부의 삽입물 아래의 매체에 피펫합니다. 뚜껑이 있는 여섯 웰 플레이트를 고정식 카메라 아래의 기기의 이미징 챔버 안에 놓고 챔버 도어를 잠급니다. 소프트웨어를 열고 계측기를 초기화합니다.시각화가 가능한 카메라 설정을 선택하고 이미지당 하나의 웰만 캡처한 후 이미징할 웰을 카메라 바로 아래에 놓습니다. ROI 도구를 사용하여 종양 모양과 크기 주위에 맞추고, ROI를 측정하고, 슬라이스에서 각 종양의 생체 발광 신호를 정량화하기 위해 총 판독값을보고하십시오. 플레이트를 멸균 층류 후드로 다시 가져온 후 포셉을 사용하여 인서트를 웰에서 약간 들어 올립니다.배지를 흡인 후 배지를 한 밀리리터의 신선한 배지로 교체하고 인셋을 다시 우물에 넣으십시오. 슬라이스가 억제제 및 대사 산물과 같은 다양한 화합물로 처리되는 실험의 경우, 1.5 밀리리터 튜브에서 1.2 밀리리터의 뇌 슬라이스 매체에 적절한 시약 농도를 준비한 다음 1 밀리리터의 시약을 슬라이스가 들어있는 웰로 옮깁니다. MDA-MB-231 BR-GFP 루시퍼라제 세포를 누드 마우스에 주사하고, 종양이 성장하도록 허용하고, 종양이 있는 뇌를 해부하고, 슬라이스하고, 생체외 성장시키고, 종양 성장을 생체발광 영상화에 의해 모니터링하였다.H&E 염색과 GFP 양성 형광은 뇌 절편에 종양이 존재함을 확인하였다. 증가된 Ki-67 염색은 고도로 증식성 암세포의 존재를 확인하였다. 조사에 노출되지 않은 뇌 조각의 종양은 생체 외 성장이 계속되었고, 방사선 조사에 노출 된 종양은 지속적인 성장을 보였다.종양을 함유하는 뇌 절편은 또한 조사 처리 후 종양 성장을 가시화하기 위해 라이브 이미징을 통해 모니터링되었다. 생체 발광 영상화와 일관되게 GFP 강도가 증가하고 세포가 뇌 실질에 침입하기 시작하면서 대조군 암세포가 빠르게 성장했습니다. 대조적으로, 방사선 조사로 처리된 뇌 절편에서 암세포는 세포증식 억제되었고 GFP 강도는 유지되었다.큰 다핵화된 암세포 및 IR-처리된 암 세포에서 DNA 손상 마커의 염색의 증가가 검출되었다. 또한, 반응성 성상세포의 증가가 검출되었다. IR 처리-유도된 아폽토시스는 종양이 없는 마우스 뇌 절편에서 검출되지 않았다.종양을 함유하는 뇌 절편을 화학요법 약물인 파클리탁셀의 상이한 농도로 처리하였다. 치료는 치료 10 일 이후에 종양의 크기를 크게 줄였습니다. 아폽토시스의 증가는 파클리탁셀-처리된 종양 세포에서 검출되었다.억제제 처리는 뇌 조직 생존력을 변화시키지 않았다. 아폽토시스의 증가는 파클리탁셀 처리된 종양이 없는 마우스 뇌 절편에서 절단된 카스파제-3 염색에 의해 측정되었다. 관심있는 약물에 의한 치료가 종료되면, 슬라이스는 면역세포화학, 오믹 연구를 통해 단백질 발현에 대해 분석되거나 유세포 측정에 적합한 단일 세포 현탁액을 달성할 수 있다.

an-ex-vivo-brain-slice-model-to-study-target-breast-cancer-brain

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

출처: Ciraku, L., et. al입니다. 유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼기 위한 생체 외 뇌 절편 모델. J. Vis. 특급. (2021). 이 비디오는 유기형 마우스 뇌 절편에서 루시페라아제 발현 종양 세포의 이미징을 보여줍니다. Luciferin을 배지에 첨가하고 플레이트를 in vivo 이미징 시스템의 챔버 내부에 배치합니다. 이미지 캡처를 위한 매개변수가 조정되고 종양의 모양과 크기가 정의됩니다. 그런 다음 종양 세포에서 방출되는 생물 발광 신호가 기록됩니다.

유기형 마우스 뇌 절편에서 종양 성장을 평가하기 위한 생물 발광 이미징

유방암 뇌 전이의 마우스 모델은 MDA-MB231/Br-GFP 세포의 초음파 영상 유도 심장 내 주입으로 설정됩니다. 다 초점 두개 내 전이의 개발은 고해상도 9.4 T MRI를 사용하여 세로 방향으로 모니터링하고있다.

종 MRI에 이어 유방암 뇌 전이 마우스 모델을 개발하기 위해 초음파 영상 유도 심장 내 주입

많은 유형의 인간 뇌종양은 뇌 내의 특정 영역에 국한되어 있으며 배양에서 성장하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 종양 미세환경의 역할을 다루고 유기형 마우스 뇌 절편에서 자라는 형광 원발성 뇌종양 세포를 분석하여 신약 치료를 조사합니다.

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

치료 옵션을 완화 남아있는 동안 그 빈도는 증가로 뇌 전이는 긴급 충족되지 않은 의료 요구되고있다. 암 세포의 intracarotid 동맥 주입을 통해 뇌 전이의 실험 동물 모델을 만들기 소설 개입 요법의 질병 생물학 및 평가의 기계론의 연구를 용이하게한다.

Intracarotid 암 세포 주입 뇌 전이의 마우스 모델을 제작하기

두개 내 뇌 전이 모델링은 정확하고 시기 좋은 방법으로 치료에 종양 크기와 반응을 모니터링할 수 없다는 것에 의해 복잡합니다. 제시된 방법론은 자기 공명 화상 진찰 분석과 두개 내 종양 주입을 결합할 때, 정확하고 일관된 주사, 향상된 동물 감시 및 정확한 종양 부피 측정을 육성합니다.

두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링

여기에서는 혈액 뇌 장벽 전이성 종양 미세 환경을 준비하고 배양한 다음 공초점 이미징 및 인공 지능 (기계 학습)을 사용하여 상태를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다.

장기 온-A 칩 3D 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화

우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

뇌 전이는 암 환자의 심각한 이환율과 사망률의 원인입니다. 대부분의 뇌 전이 마우스 모델은 사망률 및 치료 개입 결과의 혼란 분석을 혼란시키는 전신 전이에 의해 복잡합니다. 여기에 제시된 것은 최소한의 전신 종양으로 일관된 두개 내 종양을 생성하는 암세포의 내 경동맥 주사를위한 프로토콜입니다.

암세포의 내경동맥 주입에 의한 뇌전이 모델링

병아리 배아는 ovo에서 인간 교모세포종(GBM) 뇌종양을 연구하는 데 사용되며 생체 외 뇌 절편 공동 배양. GBM 세포 거동은 생체 외 공동 배양에서 타임랩스 현미경으로 기록할 수 있으며, 두 제제 모두 상세한 3D 공초점 분석을 통해 실험 종점에서 분석할 수 있습니다.

병아리 배아 뇌를 인간 교모세포종 세포 행동의 생체 내 및 생체 외 분석을 위한 모델로 사용

입체정위 두개내 주입 기법은 종양 세포를 마우스 피질에 정밀하고 국소적으로 이식할 수 있게 하여 뇌의 전이 정착 연구에 강력한 모델이 됩니다.

뇌 전이 모델링: 입체정위 피질 내 주사를 통한 전이 정식 집락화 및 조직학적 성장 패턴 분석

배우세요 유방암 뇌 전이 종양의 실시간 약물 및 방사선 반응을 측정하는 ex vivo 뇌 슬라이스 모델을 사용하는 방법입니다. 이 기법은 생리학적으로 관련된 환경에서 뇌-종양-숙주 상호작용을 유지하며 다중 치료제를 신속하게 테스트할 수 있습니다.

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델

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