Name: 미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하기 위한 패치 클램프 기술의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 배우세요 미토콘드리아 내막의 양성자 누출을 직접 측정하여 열원성 능력을 평가하는 패치 클램프 기술을. 이 방법은 생쥐 심장 및 갈색지방 조직에서 미토콘드리아 기능과 에너지 대사 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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나는 Yuriy Kirichok 박사에게 내가 그의 실험실에서 참여했던 위대한 과학과 도움이되는 토론을 위해 Kirichok 실험실의 구성원들에게 감사한다. 또한 AAC1 녹아웃 마우스를 제공해 주신 Douglas C. Wallace 박사님께도 감사드립니다. 기금: A.M.B는 American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062의 지원을 받았습니다.

수행 된 모든 동물 실험 절차는 국립 보건원 지침을 준수하며 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
참고: 미토콘드리아 분리 절차는 차동 원심분리를 기반으로 하며 조직마다 약간 다릅니다. 예를 들어, 갈색 지방 조직은 지질이 매우 풍부하기 때문에 미토콘드리아를 수확하기 전에 지질 단계에서 세포 파편과 소기관을 분리하는 추가 단계가 필요합니다. 혼란을 피하기 위해 두 가지 미토콘드리아 분리 절차 (하나는 갈색 지방에서, 다른 하나는 심장에서)가 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
1. 마우스 견갑골 갈색 지방으로부터의 미토콘드리아 분리 (Bertholet et al. 2020에서 수정)15
<ol><li>미국 수의학 협회 패널 및 IACUC 위원회의 권고에 따라CO2 질식 및 후속 자궁 경부 탈구를 사용하여 C57BL/6 수컷 마우스를 안락사시킨다.</li>
	<li>배를 탁자를 향하게 한 마우스를 위치시킨 후, 알코올을 분무하여 모발을 닦고 적셨다 (Mann et al., 2014에서 수정)16.</li>
	<li>핀셋으로 피부를 잡은 후 등 위쪽에 2cm의 절개를하십시오.</li>
	<li>나비 모양16을 갖는 두 개의 엽면 장기에 해당하는 마우스의 갈색 견갑골 간 지방을 추출한다.</li>
	<li>갈색 지방을 얼음 위에 미리 놓은 5 mL의 차가운 분리 완충액 (표 1)으로 채워진 35 mm 페트리 접시로 옮긴다.</li>
	<li>쌍안경 아래의 흰색 지방에서 갈색 지방을 청소하십시오.</li>
	<li>갈색 지방을 5 mL의 차가운 분리 완충액 (표 1)과 함께 10 mL 비이커에 옮겨 얇은 조각으로 자른다. 얼음 냉각된 10 mL 유리 호모게나이저 (플라스틱 물질 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 페슬)로 옮긴다.</li>
	<li>오버 헤드 교반기를 사용하여 275 회전 / 분의 제어 속도로 여섯 번의 부드러운 스트로크로 얼음 위에서 미리 절단 된 조직을 균질화하십시오.</li>
	<li>균질액을 15 mL 빙냉 원뿔형 튜브에서 4°C에서 10분 동안 8,500 x g 에서 원심분리한다. 지질상을 함유하는 상등액을 버리십시오.</li>
	<li>펠렛을 5mL의 빙냉 분리 완충액(표 1)에 재현탁시키고, 두 번째로 275회전/분의 속도로 여섯 번의 느린 스트로크로 얼음 위에 현탁액을 균질화한다.</li>
	<li>균질액을 15 mL 빙냉 원뿔형 튜브에 옮기고, 이를 700 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 모든 핵 및 깨지지 않은 세포를 펠릿화한다.</li>
	<li>신선한 15 mL 튜브에 상층액을 모아 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>상층액을 4°C에서 10분 동안 8,500 x g 에서 원심분리하여 미토콘드리아를 함유하는 펠렛을 얻었다.</li>
	<li>미토콘드리아를 함유하는 펠렛을 빙냉 고장성 만니톨 완충액 3.8 mL에 재현탁시키고(표 2) 미토콘드리아 현탁액을 얼음 상에서 10-15분 동안 인큐베이션한다.</li>
</ol>2. 마우스 심장으로부터의 미토콘드리아 분리 (Garg et al. 2019에서 수정)17
<ol><li>미국 수의학 협회 패널 및 IACUC 위원회의 권고에 따라CO2 질식 및 후속 자궁 경부 탈구를 사용하여 C57BL/6 수컷 마우스를 안락사시킨다.</li>
	<li>마우스를 등에 대고 알코올을 뿌려 머리카락을 닦고 적시십시오. 그런 다음 핀셋으로 피부를 잡은 후 흉부를 2cm 절개하십시오.</li>
	<li>동물의 가슴에서 심장을 해부하고 헹구어 차가운 격리 용액 5 mL로 10 mL 비이커에서 모든 혈액을 제거한다 (표 1).</li>
	<li>심장이 혈액의 흔적을 제거한 후에는 5mL의 차가운 분리 버퍼가 들어있는 다른 10mL 비이커(표 1)로 옮겨 얇은 조각으로 자릅니다. 이어서, 얼음 냉각된 10 mL 유리 균질기(PTFE pestle)로 옮긴다.</li>
	<li>오버 헤드 교반기를 사용하여 275 회전 / 분의 제어 속도로 여섯 번의 부드러운 스트로크로 얼음 위에서 미리 절단 된 조직을 균질화하십시오.</li>
	<li>균질액을 15 mL 빙냉 원뿔형 튜브로 옮기고, 이를 4°C에서 10분 동안 700 x g 에서 원심분리하여 핵과 깨지지 않은 세포를 펠릿화한다.</li>
	<li>신선한 15 mL 튜브에 상층액을 모아 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>상층액을 4°C에서 10분 동안 8,500 x g 에서 원심분리하여 미토콘드리아를 함유하는 펠렛을 얻었다.</li>
	<li>미토콘드리아 펠렛을 빙냉 고장성 만니톨 완충액 3.8 mL에 재현탁시키고(표 2) 미토콘드리아 현탁액을 얼음 상에서 10-15분 동안 인큐베이션한다.</li>
</ol>3. OMM의 기계적 파열을위한 프랑스 프레스로 미토플라스트 준비.
참고: 프랑스어 프레스 절차에서는 IMM을 매트릭스와 크리스타를 포함하여 무결성이 유지된 상태로 OMM에서 해제할 수 있습니다(그림 2)18. 미토콘드리아는 사전-고장성-만니톨 완충액(표 2)에서 인큐베이션되고, OMM이 파열될 때 IMM의 어떠한 급격한 연신도 피하기 위해 프렌치 프레스 절차 동안 더 낮은 압력을 받는다.
<ol><li>미토콘드리아-고장성-만니톨 현탁액을 프렌치 프레스의 냉장 미니압력 셀(피스톤 직경 3/8")에 채웁니다(그림 3A).</li>
	<li>프렌치 프레스의 중간 모드를 선택하고 갈색 지방 미토콘드리아의 경우 프렌치 프레스의 다이얼에있는 110에서 미니 압력 셀을 통해 서스펜션을 압축하고 심장 미토콘드리아의 경우 140에서 (~ 2,000 psi).  현탁액이 약 1 방울 / s의 속도로 미니 압력 셀에서 나오는지 확인하십시오.</li>
	<li>방울을 얼음으로 식힌 15mL 코니컬 튜브에 모으십시오.</li>
	<li>현탁액을 4°C에서 10분 동안 10,500 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>미토플라스트 펠릿을 빙저온 하이퍼토닉-KCl 완충액 0.5-2 mL에 재현탁시키고(표 3) 현탁액을 얼음 위에 저장한다. 참고 : 갈색 지방과 심장 미토플라스트는 패치 클램프 녹음을 위해 준비가되어 있으며 약 3-6 시간 동안 사용할 수 있어야합니다.</li>
</ol>4. UCP1 및 AAC5,7,15를 통한 H+ 누출의 전기생리학적 기록
참고: 다음 전기생리학적 설정을 사용하십시오(그림 3B): 차동 간섭 콘트라스트(DIC), 60x 침수 목표가 있는 반전 현미경, 진동 격리 테이블 및 패러데이 케이지, 저잡음 기록을 지원하는 표준 증폭기, 전기생리학적 설정에 사용되는 표준 디지타이저, pClamp 10, 마이크로 조작기, 욕조 기준 전극(3M KCl-agar 소금 브리지가 성형된 은/염화은 펠릿이 포함된 마이크로 전극 홀더 내에 삽입됨) 홀더 몸체 (Liu et al. 2021에 기재됨)19, 0.13 mm 유리 커버슬립 바닥을 갖는 관류 챔버 내로, 중력-공급 관류 시스템에 연결된다.
<ol><li>마이크로 피펫 풀러를 사용하여 녹화 당일에 붕규산 유리 필라멘트를 당깁니다. 재현성이 높은 피펫을 생성하기 위해 사용되는 풀러 상에 프로그램을 설정한다(20). 참고: 이 프로그램 설계에서는 IMM 패치 클램프에 최적화된 피펫을 얻기 위해 여러 번 시도해야 합니다. 표준 피펫에는 프로그레시브 원뿔 모양의 미세한 팁이 있습니다.</li>
	<li>풀러 내에 하나의 유리 필라멘트를 넣고 당겨서 하나의 붕규산염 필라멘트에서 거의 두 개의 동일한 패치 피펫을 얻습니다.</li>
	<li>피펫이 풀러의 가열 상자 필라멘트의 노화로 인해 당기는 사이클 사이에 일치하지 않을 때 프로그램을 조정하십시오.</li>
	<li>피펫 폴리셔 내부에 피펫을 놓고 팁을 필라멘트 근처에 100x 배율로 배치하여 불을 닦습니다.</li>
	<li>발 페달을 여러 번 눌러 팁 곡선을 막히거나 손상시키지 않고 필라멘트를 가열하십시오.</li>
	<li>TMA계 피펫 용액으로 충전될 때 25 내지 35 MΩ 사이의 저항을 갖는 피펫이 얻어질 때까지 광택화한다(테트라메틸암모늄 하이드록사이드에 대한 TMA, 표 4).</li>
	<li>미토플라스트 부착을 감소시키기 위해 0.1% 젤라틴으로 커버슬립(직경 5 mm, 두께 0.1 mm)을 사전 인큐베이션하고, 미토플라스트 현탁액을 증착하기 전에 KCl 배쓰 용액(표 5)으로 헹구었다.</li>
	<li>농축된 미토플라스트 현탁액을 500 μL의 KCl 배쓰 용액과 혼합하여 ∼35 μL의 미희석액을 준비하고(표 5), 이를 4-웰 플레이트의 웰에 미리 놓은 커버슬립 상에 놓는다.</li>
	<li>미토플라스트가 커버슬립에 침전될 수 있도록 15-20분 동안 얼음 위에서 배양한다.</li>
	<li>욕조 챔버를 ~50 μL의 KCl 욕조 용액으로 완전히 채운다(표 5).</li>
	<li>구부러진 팁이있는 얇은 미세 해부 핀셋을 사용하여 챔버 내에서 미토플라스트가있는 커버 슬립을 옮깁니다.</li>
	<li>커버 슬립을 챔버 바닥에 배치하십시오. 커버 슬립에서 미토플라스트를 안정적으로 유지하기 위해 챔버를 관류하지 마십시오.</li>
	<li>커버슬립을 현미경으로 60x 목표로 스캔하여 8 모양의 개별 비접착성 미토플라스트를 선택하십시오.</li>
	<li>피펫 용액 (~ 50 μL)으로 피펫을 적재하고 피펫 홀더에 넣으십시오.</li>
	<li>미세 조작기를 사용하여 피펫을 욕조 용액으로 가져 와서 선택한 미토플라스트 바로 위에 접근하여 IMM에 가까이 가십시오. 증폭기 프로그램은 피펫이 욕조 용액에 있으면 피펫의 저항을 제공합니다. 멤브레인 전위를 0mV로 유지하고 증폭기 프로그램에서 멤브레인 테스트 명령을 사용하여 10mV 펄스를 적용합니다.</li>
	<li>약간의 음압을 가하여 IMM으로 기가살을 빠르게 생성합니다(그림 2B).</li>
	<li>미토플라스트가 부착된 피펫을 올려 커버슬립으로부터 멀리 떨어뜨려 실험 중 피펫 드리프트로 인한 씰 파손을 방지합니다.</li>
	<li>전체 미토플라스트 구성을 테스트하기 전에 증폭기 프로그램에서 "멤브레인 테스트" 명령으로 이탈 정전용량 과도 상태를 보상하여 침입 후 미토플라스트 멤브레인에 대한 정확한 커패시턴스(Cm) 측정을 얻습니다.</li>
	<li>증폭기 프로그램을 사용하여 짧은 지속 시간(5-15ms) 전압 펄스(250-600mV)를 적용하여 유리 피펫 아래의 멤브레인 패치를 파열시키고 전체 미토플라스트 구성을 달성하십시오(그림 2C). 성공적인 침입은 정전 용량 과도 상태의 재출현에 의해 반영됩니다.</li>
	<li>브레이크인 후, 정전용량 과도 상태를 증폭기 프로그램의 멤브레인 테스트 옵션과 함께 맞추어 멤브레인 커패시턴스(미토플라스트의 크기 반영)와 액세스 저항 Ra(전체 미토플라스트 구성의 품질 반영)를 평가합니다. 침입 후 Ra는 40 ~ 80MΩ이어야 합니다. 패치 클램프 실험에 사용되는 미토플라스트(2-6 μm 크기)는 전형적으로 0.5-1.1 pF의 막 커패시턴스를 갖는다.</li>
	<li>침입 직후에, 관류를 시작하여 KCl 배쓰 용액 (표 5)을 HEPES 배스 용액 (표 6)으로 교체하십시오.</li>
	<li>증폭기 프로그램으로 설계된 850ms 램프 프로토콜을 -160mV ~ +100mV(5초 간격으로 적용)하면서 미토플라스트를 0mV로 유지합니다. 이 프로토콜은 UCP1 6,7,15 및 AAC 5 연구에 적용됩니다(그림 4 및 그림 5). 참고: UCP1 및 AAC 종속 H+ 전류 측정은 10kHz에서 모든 전기생리학적 데이터를 수집하고 증폭기 및 디지타이저를 구동하는 적절한 소프트웨어를 사용하여 1kHz에서 필터링하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

이 방법 논문은 미토콘드리아에 최근에 적용된 패치 클램프 기술을 제시하는 것을 목표로하며, 미토콘드리아 열발생 5,6,7,15를 담당하는 IMM을 통해 H + 누출을 직접 연구하는 새로운 접근 방식입니다. 이 기술은 조직에 한정되지 않으며, HAP1, COS7, C2C12 및 MEF 세포와 같은 상이한 표준 인간 및 세포 모델에서 IMM의 H+ 누출 및 다른 전도도를 분석하는데 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 미토콘드리아 단리에는 각 세포 또는 조직 유형에 특정한 약간의 재조정이 필요하다.
갈색 지방 5,6 및 심장</...

미토콘드리아는 세포의 강국으로 유명합니다. 실제로, 그들은 화학 에너지의 주요 원천 인 ATP입니다. 덜 알려진 것은 미토콘드리아도 열을 발생시킨다는 것입니다. 사실, 모든 미토콘드리온은 두 가지 유형의 에너지 (ATP와 열)를 지속적으로 생성하며 두 에너지 형태 사이의 미세한 균형은 대사 세포 항상성을 정의합니다 (그림 1). 미토콘드리아가 ATP와 열 사이에 에너지를 분배하는 방법은 아직 크게 알려지지 않았지만 생물 에너지 분야에서 가장 근본적인 질문입니다. 우리는 미토콘드리아 열 생산 (미토콘드리아 열 발생이라고 함)을 증가시키고 결과적으로 ATP 생산을 줄이면 에너지 소비가 증가한다는 것을 알고 있으며 이는 대사 증후군1과 싸우는 가장 좋은 방법 중 하나입니다.
미토콘드리아 열발생은 미토콘드리아 내부 막(IMM)을 가로지르는 H+ 누출로 인해 기질 산화와 ATP 합성의 결합이 해제되어 결과적으로 열이 생성되므로 "미토콘드리아 비결합"1이라는 이름이 붙여집니다(그림 1). 이 H+ 누출은 언커플링 단백질(UCPs)이라고 불리는 미토콘드리아 수송체에 의존한다. UCP1은 최초로 확인된 UCP였다. 그것은 열원성 조직, 갈색 지방 및 미토콘드리아가 열 생산을 전문으로하는 베이지 색 지방에서만 발현됩니다 2,3,4. 골격근, 심장 및 간과 같은 비 지방 조직에서 UCP의 정체성은 논란의 여지가있다. 이들 조직 내의 미토콘드리아는 열로 변환된 총 미토콘드리아 에너지의 약 25%를 가질 수 있으며, 이는 전신의 생리학에 상당한 영향을 미칠 수 있다1. 핵심 체온을 유지하는 것 외에도 미토콘드리아 열 발생은 칼로리를 줄임으로써식이 요법으로 인한 비만을 예방합니다. 또한, 미토콘드리아에 의한 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 감소시켜 산화 손상으로부터 세포를 보호한다1. 따라서, 미토콘드리아 열발생은 정상적인 노화, 연령-관련 퇴행성 장애, 및 허혈-재관류와 같은 산화 스트레스를 수반하는 다른 병태에 관여한다. 따라서 미토콘드리아 열발생은 세포 대사의 강력한 조절자이며,이 근본적인 과정에 대한 기계론적 이해는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 많은 병리학을 퇴치하기위한 치료 전략의 개발을 촉진 할 것입니다.
미토콘드리아 호흡은 세포 대사에서 미토콘드리아 열발생의 중요한 역할을 밝혀내는 최초의 기술이었으며 여전히 지역 사회에서 가장 인기가 있습니다1. 이 기술은 미토콘드리아 H+ 누출이 활성화될 때 증가하는 미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC)에 의한 산소 소비량 측정을 기반으로 합니다. 이 기술은 도구적이지만 IMM1에서 미토콘드리아 H+ 누출을 직접 연구할 수는 없으므로 특히 ATP 생산과 비교하여 열 생산이 이차적인 비지방 조직에서는 이를 담당하는 단백질의 정확한 식별 및 특성화가 어렵습니다. 최근에, 미토콘드리아에 적용된 패치-클램프 기술의 개발은, 다양한 조직들(5,6,7)에서 전체 IMM에 걸친 H+ 누출에 대한 최초의 직접적인 연구를 제공하였다.
전체 IMM의 미토콘드리아 패치 클램프는 Kirichok et al.8에 의해 재현 가능한 방식으로 처음 확립되었습니다. 그들은 COS-7 세포주8의 미토플라스트를 사용하여 2004 년 미토콘드리아 칼슘 유니포터 (MCU) 전류의 첫 번째 직접 측정을 설명했습니다. 나중에, Kirichok 실험실은 마우스 9 및 초파리 조직9의 IMM에서 칼슘 전류를보여주었습니다. 다른 실험실에서는 MCU10,11,12,13,14의 생물 물리학 적 특성을 연구하기 위해이 기술을 일상적으로 사용합니다. 칼륨 및 염화물 전도도의 전체 IMM 패치-클램프 분석도 가능하며, 몇몇 논문에서 언급되었지만, 아직 간행물 6,7,9의 주요 주제가 되지 않았다. IMM을 통한 H+ 전류의 첫 번째 측정은 2012년 마우스 갈색 지방 미토콘드리아(6)로부터, 그리고 2017년 마우스 베이지색 지방 미토콘드리아(2017년7)로부터 보고되었다. 이러한 전류는 열원성 조직인 UCP1 6,7의 특이적 비결합 단백질에 기인한다. 2019 년에 발표 된 최근 연구는 AAC를 심장 및 골격근과 같은 비 지방 조직에서 미토콘드리아 H + 누출을 담당하는 주요 단백질로 특성화했습니다5.
이 독특한 접근 방식은 이제 미토콘드리아 이온 채널 및 미토콘드리아 열 발생을 담당하는 수송체의 직접적인 고해상도 기능 분석을 허용합니다. 이 방법의 확장을 촉진하고 미토콘드리아 호흡과 같은 다른 연구를 보완하기 위해 UCP1 및 AAC에 의해 운반되는 H + 전류를 측정하기위한 상세한 프로토콜이 아래에 설명되어 있습니다. 세 가지 중요한 단계가 설명된다: 1) AAC 의존성 H+ 전류를 분석하기 위해 UCP1 의존성 H+ 전류 및 심장으로부터의 미토콘드리아 분리를 분석하기 위한 마우스 갈색 지방으로부터의 미토콘드리아 분리, 2) 외부 미토콘드리아 막(OMM)의 기계적 파열을 위한 프렌치 프레스를 이용한 미토플라스트 준비, 3) 전체 IMM에 걸친 UCP1 및 AAC 의존적 H+ 전류의 패치 클램프 기록.

<table><tbody><tr><td>0.1% 젤라틴</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>60X 침수 대물렌즈, 개구수 1.20</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B 증폭기</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B 디지타이저</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>수제</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프렌치 프레스</td><td>글렌 밀스</td><td>5500-000011</td><td></td></tr><tr><td>IKA Eurostar PWR CV S1 실험실 오버 헤드 교반기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>반전 현미경</td><td>올림푸스</td><td>IX71 또는 IX73</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 포지</td> <td>(Narishige)</td> <td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanupulator MPC-385</td><td>셔터 악기</td><td>FG-MPC325</td><td></td></tr><tr><td>한천 다리 용 미세 전극 홀더</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3F4515</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td> <td>(Sutter Instruments)</td> 프렌치 프레스 용 <td>P97</td><td></td></tr><tr><td>미니 셀</td><td>Glen Mills</td><td>5500-FA-004</td><td></td></tr><tr><td>MIXER IKA 6-2000RPM</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-50705-50</td><td></td></tr><tr><td>객관적 인 100X 배율</td><td>Nikon&nbsp; 렌즈</td><td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td><td></td></tr><tr><td>pClamp 10</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>관류 챔버</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>RC-24E</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem 균질화 장치 10 ml</td><td>Wheaton</td><td>358039</td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기 SORVALL X4R PRO-MD</td><td>Thermo Scientific</td><td>75 009 521</td><td></td></tr><tr><td>작은 원형 유리 커버슬립: 지름 5mm, 두께 0.1mm</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>640700</td><td></td></tr><tr><td>진동 차단 테이블</td><td>Newport</td><td>VIS3036-SG2-325A</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-gluconic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>&nbsp; 시그마 알드리치</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>&nbsp; 시그마 알드리치</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&</td><td>nbsp; 시그마 알드리치</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>&nbsp; 시그마 알드리치</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>&nbsp; 시그마 알드리치</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>&nbsp; 시그마 알드리치</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TMA</td><td>&nbsp; 시그마 알드리치</td><td>331635</td><td></td></tr><tr><td>TrisBase</td><td>&nbsp; 시그마 알드리치</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>TrisCl</td><td>&nbsp; 시그마 알드리치</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하기 위한 패치 클램프 기술의 사용

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

미토콘드리아 열발생(미토콘드리아 비결합이라고도 함)은 대사 증후군과 싸우기 위해 에너지 소비를 증가시키는 가장 유망한 목표 중 하나입니다. 갈색 및 베이지 색 지방과 같은 열 생성 조직은 열 생산을 위해 고도로 전문화 된 미토콘드리아를 개발합니다. 주로 ATP를 생산하는 다른 조직의 미토콘드리아도 전체 미토콘드리아 에너지 생산의 최대 25 %를 열로 변환하므로 전신의 생리학에 상당한 영향을 줄 수 있습니다. 미토콘드리아 열발생은 체온 유지에 필수적일 뿐만 아니라 식이요법으로 인한 비만을 예방하고 반응성 산소종(ROS)의 생성을 감소시켜 산화 손상으로부터 세포를 보호합니다. 미토콘드리아 열발생은 세포 대사의 핵심 조절자이기 때문에, 이 근본적인 과정에 대한 기계론적 이해는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 많은 병리와 싸우기 위한 치료 전략의 개발에 도움이 될 것이다. 중요하게도, 미토콘드리아에서 열발생의 급성 활성화를 조절하는 정확한 분자 메커니즘은 제대로 정의되지 않았다. 이러한 정보의 부족은 주로 언커플링 단백질의 직접적인 측정을 위한 방법의 부족 때문이다. 미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론의 최근 개발은 처음으로 미토콘드리아 열발생의 기원에서의 현상에 대한 직접적인 연구, IMM을 통한 H+ 누출, 그리고 이를 담당하는 미토콘드리아 운반체의 첫 번째 생물물리학적 특성화, 갈색 및 베이지 색 지방의 특이적인 단백질 1(UCP1), 그리고 다른 모든 조직에 대한 ADP/ATP 수송체(AAC)를 가능하게 했다. 이 독특한 접근법은 H + 누출 및 미토콘드리아 열 발생을 제어하는 메커니즘과 대사 증후군 퇴치를 목표로하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다. 이 논문은 IMM을 통해 H+ 전류를 직접 측정하여 열원성 능력을 연구하기 위해 미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론을 설명합니다.

미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론의 개발은 IMM과 이를 담당하는 미토콘드리아 수송체인 UCP1 및 AAC를 통한 H+ 누출에 대한 최초의 직접적인 연구를 제공했다. UCP1- 및 AAC 의존성 H+ 누출의 전기생리학적 분석은 미토콘드리아의 열원성 용량에 대한 첫눈에 제공할 수 있다. 결과 섹션에서는 UCP1 및 AAC를 통해 H+ 누출을 측정하는 표준 절차에 대해 설명합니다.
UCP1 종속 H+ 전류 측정(그림 4)6,7,15 전압 램프 프로토콜의 적용은 UCP의 필수 활성화제인 외인성 지방산(FA)의 첨가 없...

이 방법 기사는 미토콘드리아의 열 생성 능력을 연구하기위한 새로운 접근 방식 인 패치 클램프 기술로 내부 미토콘드리아 막을 가로 지르는 H + 누출을 측정하는 주요 단계를 자세히 설명합니다.

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

이 프로토콜은 패치 클램프 기술이 미토콘드리아 내부 막을 가로 지르는 미토콘드리아 양성자 누출을 직접 측정하여 미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다. 내부 미토콘드리아 막을 통한 양성자 전류의 직접 측정은 미토콘드리아 열발생을 담당하는 분자 메커니즘을 식별하고 정확하게 특성화하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 미토콘드리아 내부 막을 가로 지르는 양성자 전류를 측정 할뿐만 아니라 칼슘 또는 아데닌 뉴클레오티드와 같은 대사 산물과 같은 미토콘드리아 기능에 중요한 다른 전도도를 연구 할 수있게합니다.안락사 된 마우스를 등에 놓고 알코올을 뿌려 머리카락을 닦고 적시십시오. 그런 다음 흉부를 두 센티미터 절개하십시오. 핀셋으로 피부를 움켜 잡은 후 동물의 가슴에서 심장을 해부하고 헹구어 모든 혈액을 5 밀리리터의 차가운 격리 용액이있는 10 밀리리터 비커에 넣으십시오.심장이 혈액의 흔적을 제거하면 다섯 밀리리터의 차가운 격리 버퍼가 들어있는 다른 10 밀리리터 비커로 옮겨 얇은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 얼음으로 식힌 10 밀리리터 유리 균질 기로 옮깁니다. 오버헤드 교반기를 사용하여 분당 275회 회전의 제어된 속도로 여섯 번의 부드러운 스트로크로 얼음 위에 미리 절단된 조직을 균질화합니다.균질액을 15밀리리터 얼음처럼 차가운 원뿔형 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 700배 G에서 원심분리하여 핵과 깨지지 않은 세포를 펠릿화한다. 상층액을 신선한 15 밀리리터 튜브에 모아 얼음 위에 놓습니다. 상층액을 섭씨 4도에서 10분 동안 8, 500배 G에서 원심분리하여 미토콘드리아를 함유하는 펠렛을 얻었다.미토콘드리아 펠렛을 3.8 밀리리터의 얼음처럼 차가운 고장성 만니톨 완충액에 재현탁시키고 미토콘드리아 현탁액을 얼음 상에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션한다. 미토콘드리아 고장성 만니톨 현탁액을 프랑스 프레스의 냉장 미니압력 셀에 채운다. 그런 다음 셀을 프랑스 프레스에 놓습니다.그런 다음, 프렌치 프레스의 로우 모드를 선택하고 갈색 지방 미토콘드리아에 대한 다이얼의 110에서 미니 압력 셀을 통해 서스펜션을 압축하고, 심장 미토콘드리아에 대해 140에서 서스펜션이 초당 약 1 방울의 속도로 미니 압력 셀에서 나오도록 보장하십시오. 방울을 15 밀리리터의 얼음으로 식힌 원뿔형 튜브에 모으십시오. 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 10, 500배 G에서 원심분리한다.미토플라스트 펠렛을 0.5 ~ 2 밀리리터의 얼음처럼 차가운 고장성 염화칼륨 완충액에 재현탁시키고 현탁액을 얼음 위에 저장한다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 녹화 당일 붕규산 유리 필라멘트를 당겨 재현성이 높은 피펫을 생성하는 데 사용되는 풀러에 프로그램을 설정하십시오. 풀러 내에 하나의 유리 필라멘트를 넣고 당겨서 하나의 붕규산염 필라멘트에서 거의 두 개의 동일한 패치 피펫을 얻습니다.피펫이 풀러의 가열 상자 필라멘트의 노화로 인해 당기는 사이클 사이에 일치하지 않을 때 프로그램을 조정하십시오. 피펫 폴리셔 내부에 피펫을 놓고 팁을 필라멘트 근처에 100X 배율로 배치하여 불을 닦으십시오. 발 페달을 여러 번 눌러 팁 곡선을 막히거나 손상시키지 않고 필라멘트를 가열하십시오.피펫이 25 내지 35 메가옴 사이의 저항을 가질 때까지 광택은 TMA 기반 피펫 용액으로 충전될 때 얻어진다. 미토플라스트 부착을 줄이기 위해 0.1% 젤라틴으로 커버 슬립을 사전 인큐베이션하고 미토플라스트 현탁액을 증착하기 전에 염화칼륨 욕조 용액으로 헹구십시오. 약 35 마이크로리터의 농축된 미토플라스트 현탁액을 500 마이크로리터의 염화칼륨 욕조 용액과 혼합하여 원료 희석물을 준비하고, 이를 네 웰 플레이트의 웰에 이전에 놓인 커버 슬립 상에 놓는다.미토플라스트가 커버 슬립 아래로 침전될 수 있도록 얼음 위에서 15-20분 동안 배양한다. 약 50 마이크로 리터의 염화칼륨 욕조 용액으로 욕조 챔버를 완전히 채우고 구부러진 팁이있는 얇은 미세 해부 핀셋을 사용하여 챔버 내의 미토플라스트로 커버 슬립을 옮깁니다. 커버 슬립을 챔버에 관류시키지 않고 챔버 바닥에 배치하여 커버 슬립에서 미토플라스트를 안정적으로 유지하십시오.현미경 아래에서 커버 슬립을 60X 목표로 스캔하여 개별 비접착성 미토플라스트를 선택하십시오. 피펫 용액으로 피펫을로드하고 피펫 홀더에 넣으십시오. 미세 조작기를 사용하여 피펫을 욕조 용액으로 가져 와서 선택한 미토플라스트 바로 위로 이동하여 IMM에 가까이 가십시오.멤브레인 전위를 0밀리볼트로 유지하고 증폭기 프로그램의 멤브레인 테스트 명령을 사용하여 10밀리볼트 펄스를 인가합니다. 약간의 음압을 가하여 IMM으로 기가살을 빠르게 만듭니다. 미토플라스트가 부착된 피펫을 들어 올려 커버 슬립으로부터 멀리 떨어뜨려 실험 중 피펫 드리프트로 인한 씰 파손을 방지합니다.전체 미토플라스트 구성을 테스트하기 전에 증폭기 프로그램에서 멤브레인 테스트 명령으로 이탈 정전 용량 과도 상태를 보상하여 침입 후 미토플라스트 멤브레인에 대한 정확한 정전용량 측정을 얻습니다. 증폭기 프로그램에 짧은 지속 시간 전압 펄스를 적용하여 유리 피펫 아래에서 멤브레인 패치를 파열시키고 전체 미토플라스트 구성을 달성하십시오. 침입 후 정전 용량 과도 상태를 증폭기 프로그램의 멤브레인 테스트 옵션에 맞게 조정하여 멤브레인 정전 용량과 액세스 저항을 평가합니다.침입 직후, 관류를 통해 염화칼륨 목욕 용액을 HEPES 목욕 용액으로 교체하십시오. 증폭기 프로그램에 850밀리초 램프 프로토콜을 적용합니다. 전압 램프 프로토콜의 적용은 UCPs의 필수 활성화제인 외인성 지방산의 첨가 없이 갈색 지방의 IMM을 가로질러 큰 진폭 양성자 전류를 유도한다.내인성 막 지방산 추출을 위해 UCP1 억제제 구아노신 디포스페이트 또는 10-밀리몰 메틸베타 시클로덱스트린에 의한 관류 후, 잔류 전류는 UCP1 결핍 마우스의 IMM에서 완전히 사라지는 UCP1 전류의 진폭을 결정하기 위해 사용된다. 갈색 지방과는 달리, 골격근 및 심장과 같은 비 지방 조직의 IMM은 침입 직후에 측정 가능한 양성자 전류를 발생시키지 않습니다. AAC를 통해 측정 가능한 양성자 전류를 유도하기 위해서는 외인성 지방산의 일에서 두 마이크로 몰을 포함하는 HEPES 배쓰 용액을 적용하는 것이 필수적입니다.측정된 양성자 전류가 AAC에 의해 운반된다는 것을 확인하기 위해, AAC1 결핍 마우스의 IMM에 나타난 양성자 전류를 거의 완전히 억제하는 특정 억제제인 카르복시아트랙틸로시드를 적용하는 것이 중요하다. 양성자 누출의 일정하지만 결코 완전한 억제는 ADP가 AAC를 통한 활성 뉴클레오티드 교환을 생성하기 위해 막의 양쪽에 존재할 때만 달성된다. 미토플라스트 준비의 품질은 전체 미토플라스트 구성을 달성하는 데 성공률에 영향을 미칩니다.최적화하는 것이 필수적입니다. 일단 미토콘드리아 열발생의 분자 메커니즘이 패치 클램프 기술로 해부되면, 미토콘드리아 산소 소비의 측정은 무손상 미토콘드리아에서 양성자 전류 및 열발생의 중요성을 입증할 것이다. 이 기술은 연구자가 미토콘드리아의 기능에 중요한 모든 종류의 전도성, 이온 및 대사 산물을 탐구 할 수있는 길을 열어줍니다.

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<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subSubmitochondrial 소포 막 패치 클램프 녹음을 공연&gt; ATPase의 소포의 준비와 기술

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

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여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca2 + 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca2 + 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

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이 방법은 야생형 대조군에 비해 증가된 심근세포 미토콘드리아 코엔자임 Q 함량을 갖는 신생아 깨지기 쉬운 X 증후군 마우스에서 기공 개방에 대한 전압 역치를 결정하기 위해 낮은 전도도 양성자 누출에 대한 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 기여를 이용한다.

코엔자임 Q 과량의 설정에서 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 개방 확률의 평가

마우스와 쥐는 원격 온도 트랜스폰더를 외과적으로 이식한 다음 테스트 환경과 절차에 익숙해집니다. 근육 온도의 변화는 홈 케이지의 약리학 적 또는 문맥 적 자극에 반응하여 또는 규정 된 신체 활동 (즉, 일정한 속도로 러닝 머신 걷기) 중에 측정됩니다.

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여기에서 우리는 갈색 지방 조직(BAT) 활동이 인간 대사에 미치는 영향의 생리학적 중요성을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이것은 탄수화물 부하와 간접 열량계를 쇄골 상 온도 변화의 측정과 결합하여 달성됩니다. 이 새로운 접근법은 인간의 BAT 열 발생에 대한 약리학적 표적을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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이 프로토콜은 수동 endolysomal patch-clamp system을 사용하여 세포 내 소포의 이온 채널 활성을 직접 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 엔도리소좀(endolysosome)을 확대하고 이러한 소포를 수동으로 분리하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 통해 연구원은 절차를 정확하게 복제하고 적용할 수 있습니다.

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임의의 점 kinematograms과 컴퓨터 - 생성 무척추 동물의 비디오 재생을 고용 op​​erant 조절 패러다임을 사용하는 도마뱀의 시각적 감도를 테스트.

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미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하기 위한 패치 클램프 기술의 사용

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