Name: 사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 배우세요 인간 착상 전 배아의 비침습적 염색체 스크리닝 방법을 사용된 배양 배지를 통해. NGS 기술로 염색체 배합을 정확히 분석하여 생식 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자들은 NGS 데이터 분석에 도움을 준 Shiping Bo와 Shujie Ma에게 감사의 뜻을 전합니다. 자금 지원: 이 연구는 국가 핵심 연구 개발 프로그램(보조금 번호 2018YFC1003100)의 지원을 받았습니다.

북경대학 제3병원 윤리위원회로부터 윤리 허가를 받았다.
1. 준비
알림: 필요한 재료 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
<ol><li>시약<ol><li>사용하기 전에 Tri-gas 인큐베이터에서 37°C, 5% CO 2 및 5% O2에서 20-30μL의 배우자 배지/수정 배지 및 분열/배반포 단계 배양 배지(미네랄 오일로 덮임) 및 히알루로니다아제(단단히 뚜껑이 있는 튜브에 있음)를 예열 및 평형(균형)합니다.</li>
		<li>흄 후드의 작업 표면에서 히알루로니다아제를 37°C로 예열합니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 유리화 완충액과 시료 채취 시약을 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>도구<ol><li>유리 파스퇴르 피펫을 당겨 화염 광택 개방형 미세 팁을 생성하여 샘플 수집 및 이송 피펫(내경 ~200-250μm), 탈각/스트리퍼 피펫(내경 ≥150μm, ~130-140μm 및 ~120μm) 및 세척용 피펫(내경 ~150μm)을 준비합니다. 참고: 샘플 채취/이송, 탈취 및 세척에 사용되는 피펫은 직접 구입할 수 있습니다. 고정 바늘과 주사 바늘도 직접 구입할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 프로토콜 1: 검체 채취
<ol><li>히알루로니다아제로 소화하기 전에 난모세포-코로나-적운 복합체(OCCC)의 전처리<ol><li>난포 자극 호르몬(FSH)과 인간 갱년기 성선 자극 호르몬(hMG) 제제로 난소 자극을 달성합니다. 납 난포가 >18mm일 때 최종 난모세포 성숙을 위해 10,000IU의 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)을 사용합니다.</li>
		<li>방아쇠 주사 후 36시간 후에 난모세포 채취를 수행합니다. 난모세포를 채취하여 미네랄 오일로 덮인 2.5mL의 예열된 m-HTF가 있는 조직 배양 접시에 옮깁니다.</li>
		<li>이송 피펫을 사용하여 OCCC를 1mL의 수정 배지가 들어 있는 장기 배양 접시의 중앙 웰로 빠르게 옮긴 다음 37°C에서 5% CO2 및 5%O2 인큐베이터에서 2-4시간 동안 난모세포와 함께 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>OCCC가 포함된 장기 배양 접시의 중앙 웰에 37°C 예열된 히알루로니다아제(80IU/mL) 1mL를 추가하여 히알루로니다아제로 OCCC를 분해합니다(단계 2.1.3). 히알루로니다아제의 최종 농도를 40IU/mL로 유지하고 잘 섞습니다.<ol><li>OCCC를 37°C 열 플랫폼에서 2분 동안 배양합니다. 과립 세포의 1-2 층 만 남을 때까지 30 초마다 현미경으로 변화를 관찰하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>과립 세포의 탈질<ol><li>난모세포 처리를 위해 배양 접시에서 소화된 OCCC를 빠르게 옮기고 각 웰에 미네랄 오일을 덮습니다.</li>
		<li>분리된 과립 세포를 현미경으로 관찰합니다. 부드럽게 흡인하여 난모세포를 5회 방출하여 난모세포 주변에 남아 있는 과립세포를 제거합니다.</li>
		<li>나머지 3개의 웰에서 이전 단계를 반복하여 과립 세포를 완전히 제거합니다. 알림: 위의 단계(2.1-2.3)는 각 실험실의 일상적인 작업에 따라 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>난모세포의 평가<ol><li>현미경을 사용하여 과립 세포 제거의 완전성을 평가합니다. 세포를 완전히 제거할 수 없는 경우, 이때 5개 이하의 과립 세포의 머무름이 허용됩니다. 참고: 적운 세포가 여전히 난모세포에 부착되어 있는 경우, 배아를 분열 단계 배양 배지에서 배반포 단계 배양 배지로 옮기기 전에 3일째 되는 날에 잔여물을 제거할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포질 내 정자 주입(ICSI)26을 수행한 후 이송 피펫을 사용하여 난모세포를 20-30μL 분열 배아 배지 미세방울(하나의 난모세포는 하나의 미세방울에 해당)로 옮기고 37°C, 5% CO2 및 5%O2 인큐베이터에서 배양합니다.<ol><li>ICSI의 날을 0일로 기록합니다. 수정 1일차(약 18시간), 2일차(약 45시간) 및 배아 분열 3일차(약 68시간)의 배아 평가에 대한 이스탄불 합의 워크숍에 따라 배아를 확인하고 점수를 매깁니다.27.</li>
	</ol></li>
	<li>배아 세척<ol><li>37 °C, 5 % CO 2 및 5 % O 2 인큐베이터에서2 일째에 조직 배양 접시에서 미네랄 오일로 덮인 각 배아에 대해 20-30 μL의 배반포 배양 배지 미세 방울을 준비합니다.</li>
		<li>미네랄 오일로 덮인 또 다른 3개의 미세 방울을 준비하고 1-3번 세척을 위해 새 조직 배양 접시에 라벨을 붙입니다.</li>
		<li>3일째 배아를 세척 미세 방울로 옮깁니다. denudation 피펫을 사용하여 각 방울에서 배아를 3회 부드럽게 흡인하고 방출합니다. 참고: 이 절차는 또한 배아에 부착된 잔류 과립 세포를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
		<li>형태학적 채점을 위해 배지를 절단 단계 배양 배지에서 배반포 배양 배지로 변경하기 전 3일째에 현미경으로 배아를 관찰하고 평가합니다. 적운 세포가 여전히 배아에 부착되어 있는 경우, 적운 세포가 완전히 제거될 때까지 스트리퍼 피펫으로 미네랄 오일로 덮인 다른 예열되고 평형화된 배반포 배양 배지 방울에서 위아래로 적절하게 피펫팅합니다. 참고: 배아를 분열 단계 배양 배지 플레이트에서 배반포 단계 배양 배지 플레이트로 옮기기 전에 부착된 모든 적운 세포를 3일째에 완전히 제거해야 했습니다. 남아 있는 적운 세포는 최종 분석을 방해하고 위음성 결과를 제공합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>배양 배지 수집을 위한 두 가지 옵션 참고: IVF 센터는 센터의 자원, 요구 사항 및 선호도에 따라 두 가지 배양 배지 수집 방법 중 하나를 선택할 수 있습니다.<ol><li>옵션 1: 배아 세척 및 배양 참고: 이 옵션은 5일차 아침에 유리화를 수행하는 IVF 실험실을 위한 것입니다.<ol><li>배아를 예열된(37°C) 배양 배지의 미세 방울에 옮기고 4일째 오후에 피펫팅하여 각 배아를 3개의 미세 방울로 연속적으로 부드럽게 세척합니다.</li>
			<li>샘플 수집을 위해 각 배아를 고유한 예열된(37°C) 단일 microdroplet 배양 배지에 옮깁니다. 배양 배지 단일 방울의 부피는 25μL를 초과할 수 없습니다.</li>
			<li>5일차/6일차에 37°C, 5% CO2 및 5%O2에서 배반포 배아 배양을 수행합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>옵션 2: 배아 세척 및 배양 참고: 이 옵션은 5일차 오후 또는 6일차에 유리화(vitrification)를 수행하는 IVF 실험실을 위한 것입니다.<ol><li>배아를 10-15 μL 배양 배지의 예열된(37°C) 미세방울에 옮기고 5일째에 피펫팅하여 각 배아를 3개의 미세방울로 순차적으로 부드럽게 세척합니다.</li>
			<li>샘플 수집을 위해 각 배아를 고유한 예열된(37°C) 단일 microdroplet 배양 배지에 옮깁니다. 배양 배지 단일 방울의 부피는 15μL를 초과할 수 없습니다.</li>
			<li>5일차/6일차에 37°C 및 5%CO2에서 배반포 배아 배양을 수행합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>시료 채취<ol><li>영양배엽의 세포 접합부에 초점을 맞춘 레이저 빔의 목표 지점에서 상당한 거리에서 ICM을 부드럽게 조정하여 영양배엽에 작은 구멍을 생성하여 배반강에서 유체를 방출합니다. 그런 다음 배아는 기존 공정에 따라 냉동 보존을 위해 냉동 용액으로 이동합니다.</li>
		<li>배양된 각 배아에서 5μL의 세포 용해 완충액이 포함된 RNase/DNase-free PCR 튜브로 배양 배지를 옮깁니다.</li>
		<li>배아 배양에 사용하지 않고 음성 대조군과 동일한 양의 배양 배지를 수집합니다. 수집된 모든 샘플을 액체 질소에 즉시 동결한 다음 수집 후 NICS 분석이 수행될 때까지 -80°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜에 설명된 대로 유리화를 수행합니다.</li>
</ol>3. 프로토콜 2: 도서관 구축
<ol><li>배양 배지 용해<ol><li>1μL의 양성 대조군(10ng 인간 gDNA)을 199μL의 신선한 배양 배지로 희석합니다. 완전히 혼합하고 튜브를 짧게 원심분리합니다(200초 동안 5 x g ).</li>
		<li>10μL의 5일차 6일 배반포 배양 배지, 희석된 양성 대조군 및 신선한 배양 배지를 새로운 0.2mL PCR 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>각 PCR 튜브에 1μL의 MT Enzyme Mix를 추가하고 200 x g에서 2-3초 동안 피펫팅 및 원심분리기로 완전히 혼합합니다.</li>
		<li>3.1.3 단계의 PCR 튜브를 예열된 NICS 샘플 준비 스테이션에 넣고 다음과 같이 용해 프로그램을 실행합니다. 75°C에서 10분; 95°C에서 4분; 22 °C에서 유지합니다. 참고: 시료 전처리 스테이션은 표준 PCR 기계와 비슷합니다.<ol><li>Lysis 아이콘을 클릭하여 설정 화면으로 들어갑니다.</li>
			<li>제어 모드로 튜브를 선택하십시오. 시료 부피의 경우 입력 10μL; Hotlid 제어에 대해 On 을 선택하고 온도에 105°C를 입력합니다. 첫 번째 세그먼트에서 일시 중지에 대해 아니요 를 선택합니다. 딸깍 하는 소리 OK 계속합니다.</li>
			<li>남아 있는 시간에 프로그램 종료를 나타내는 --:--:--가 표시될 때까지 기다린 다음 중지를 클릭하여 프로그램을 종료합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>프로세스가 완료된 후 프로그램을 중지하십시오. 즉시 다음 단계로 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>도서관 사전 준비<ol><li>Pre-Lib 버퍼를 RT로 해동합니다. 피펫팅과 원심분리기로 200 x g에서 즉시 2-3초 동안 완전히 혼합합니다.</li>
		<li>Pre-Library 반응을 위한 마스터 믹스를 준비하려면 Pre-Lib Enzyme Mix 2μL를 Pre-Lib Buffer 60μL에 넣고 반응을 완전히 혼합한 후 간단히 원심분리합니다.</li>
		<li>60μL의 사전 라이브러리 반응 혼합물을 이전 단계의 각 전처리된 배지 샘플에 추가합니다. 피펫팅과 원심분리기로 즉시 200 x g에서 2-3초 동안 완전히 혼합합니다.</li>
		<li>3.2.3 단계의 PCR 튜브를 Sample Prep Station에 놓고 다음과 같이 prelibrary 프로그램을 실행합니다. 95°C에서 2분; 40초 동안 15°C, 40초 동안 22°C, 30초 동안 33°C, 30초 동안 65°C, 40초 동안 72°C, 10초 동안 95°C, 10초 동안 63°C의 12회 주기; 4 °C에서 유지합니다.<ol><li>Pre_Lib 아이콘을 클릭하여 설정 화면으로 들어갑니다.</li>
			<li>제어 모드로 튜브를 선택하십시오. 샘플 부피의 경우 입력 70 μL; Hot lid control(핫 뚜껑 제어)에서 On(켜기 )을 선택하고 온도로 105°C를 입력합니다. 첫 번째 세그먼트에서 일시 중지에 대해 아니요 를 선택합니다. 딸깍 하는 소리 OK 계속합니다.</li>
			<li>남은 시간에 프로그램 종료를 나타내는 --:--:--가 표시될 때까지 기다렸다가 중지를 클릭하여 프로그램을 종료합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>프로세스가 완료되면 프로그램을 중지하십시오. 즉시 다음 단계로 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>도서관 준비<ol><li>라이브러리 버퍼를 RT로 해동합니다. 피펫팅과 원심분리기로 완전히 혼합하고 즉시 200 x g에서 2-3초 동안 혼합합니다.</li>
		<li>라이브러리 반응을 위한 마스터 믹스를 준비하려면 1.6 μL의 Library Enzyme Mix를 60 μL의 Library Buffer에 넣고 반응을 완전히 혼합한 후 간단히 원심분리합니다.</li>
		<li>60 μL의 라이브러리 반응 혼합물과 2 μL의 바코드 프라이머를 3.2.3단계부터 각 prelibrary 제품에 추가합니다. 반응을 완전히 혼합하고 짧게 원심분리합니다.</li>
		<li>3.2.3 단계의 PCR 튜브를 열 순환기에 놓고 다음과 같이 라이브러리 준비 프로그램을 실행합니다: 94 °C 동안 30초; 17초 동안 94°C, 62초 동안 30°C, 72초 동안 45°C의 45회 주기); 그런 다음 4°C에서 유지합니다.<ol><li>Lib_Prep 아이콘을 클릭하여 설정 화면으로 들어갑니다.</li>
			<li>제어 모드로 튜브를 선택하십시오. 시료 부피의 경우 입력 130 μL; Hotlid 제어에 대해 On 을 선택하고 해당 온도에 대해 105°C를 입력합니다. 첫 번째 세그먼트에서 일시 중지에 대해 아니요 를 선택합니다. 딸깍 하는 소리 OK 계속합니다.</li>
			<li>남은 시간에 프로그램 종료를 나타내는 --:--:--가 표시될 때까지 기다렸다가 중지를 클릭하여 프로그램을 종료합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>도서관 정화<ol><li>정제 단계 전에 최소 20분 동안 2-8°C에서 보관하는 Magbeads를 꺼냅니다. Magbeads를 20초 동안 소용돌이치고 섞습니다. 정제 단계에 필요한 충분한 비드를 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 분주하고 비드를 RT로 데웁니다.</li>
		<li>각 라이브러리에 1x Magbeads를 추가합니다. 위아래로 ≥10회 피펫팅하여 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 참고: 예를 들어, 100μL의 Magbeads를 100μL의 라이브러리 샘플에 추가합니다.</li>
		<li>배양 후 튜브를 잠시 원심분리하고 자석 스탠드에 놓습니다.</li>
		<li>용액이 맑아질 때까지 약 5분 동안 기다립니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 올려 놓은 상태에서 용액을 조심스럽게 흡입하고 버리십시오.</li>
		<li>갓 준비한 80% 에탄올 200μL를 튜브에 추가합니다. 상온에서 30초 동안 배양하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 한 번 더 반복합니다.</li>
		<li>가능한 한 완전히 에탄올을 제거하십시오. 마그네틱 스탠드의 비드를 RT에서 약 5-10분 동안 자연 건조합니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 17.5μL의 용출 버퍼를 추가한 다음 튜브를 소용돌이쳐 비드를 재현탁시킵니다. 튜브를 잠시 원심분리하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다. 15μL 상층액을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>라이브러리 정량화<ol><li>qubit dsDNA HS 어세이 키트28의 사용자 가이드에 따라 형광측정기를 사용하여 정제된 라이브러리를 정량화합니다. 라이브러리의 수율은 ~ 15에서 300 ng 사이입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>라이브러리 풀링<ol><li>풀링을 위해 각 라이브러리 샘플의 10나노그램을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시퀀싱<ol><li>시퀀싱 사용 설명서(15027617 v01)29를 참조하십시오.</li>
		<li>플랫폼의 단일 말단에서 50bp의 정제된 라이브러리 염기서열은 각 샘플에 대해 약 200만 개의 판독을 생성했으며 0.03 × 염기서열분석 깊이가 권장되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 분석<ol><li>로그인 페이지에 사용자의 이름과 암호를 입력합니다.</li>
		<li>시스템에 로그인한 후 분석을 클릭하면 새 페이지가 나타납니다. NICS-A 탭에서 Create Submission(제출 생성 )을 클릭합니다. 그런 다음 플랫폼으로 NGS 를 선택하고, 기업을 선택하고, 시약으로 NICSInst를 선택하고, 프로젝트 ID 아래의 상자에 프로젝트 정보를 입력하고, 분석 기본 설정을 지정하고, 파일을 업로드합니다. 모든 염기서열분석 파일이 성공적으로 업로드되면 Submit(제출 )을 클릭하여 분석을 시작합니다(그림 3A).</li>
		<li>제출물 보기를 클릭하여 제출된 프로젝트 목록을 표시합니다. 분석이 완료되면 프로젝트 상태가 완료됨이 되고 보고서 필드에 표시 버튼이 나타납니다. Show(표시) 버튼을 클릭하여 NICS 분석의 요약 테이블을 봅니다(그림 3B).</li>
		<li>Export report(보고서 내보내기) 단추를 클릭하여 보고서를 저장합니다(그림 3C). 참고: 각 분석에 대해 세 가지 유형의 파일이 내보내집니다. 각 염색체 및 전체 게놈에 대한 모든 복제 수 변이(CNV) 플롯을 포함하는 그래픽 파일로, "그래프" 폴더에 저장됩니다. 이 분석 실행의 샘플 QC 세부 정보가 포함된 스프레드시트; 사용자가 사용자 지정한 NICS 보고서가 포함된 문서 파일입니다. 및 이 분석 실행의 샘플 요약 정보가 포함된 스프레드시트입니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Gianaroli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocentesis%3A+a+source+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing.+Results+from+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).</li>
<li>Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+content+in+embryo+culture+medium+is+significantly+associated+with+human+embryo+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation.</a> Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).</li>
<li>Stigliani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+in+Day+3+embryo+culture+medium+is+a+novel%2C+non-invasive+biomarker+of+blastocyst+potential+and+implantation+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).</li>
<li>Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-Based+Noninvasive+Preimplantation+Genetic+Diagnosis+for+Human+%CE%B1-Thalassemias-SEA%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine%22%5BJournal%5D)">Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA.</a> Medicine. 94 (12), e669(2015).</li>
<li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+chromosome+screening+of+human+embryos+by+genome+sequencing+of+embryo+culture+medium+for+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).</li>
<li>Capalbo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li>
<li>Tobler, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocoel+fluid+from+differentiated+blastocysts+harbors+embryonic+genomic+material+capable+of+a+whole-genome+deoxyribonucleic+acid+amplification+and+comprehensive+chromosome+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).</li>
<li>Magli, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+genetic+testing%3A+polar+bodies%2C+blastomeres%2C+trophectoderm+cells%2C+or+blastocoelic+fluid%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid?</a> Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).</li>
<li>Kuznyetsov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+novel+non-invasive+preimplantation+genetic+screening+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach.</a> PLoS One. 13 (5), e0197262(2018).</li>
<li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+Genetic+Screening+with+Spent+Culture+Medium%2FBlastocoel+Fluid+for+in+Vitro+Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9275(2018).</li>
<li>Jiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+invasive+preimplantation+genetic+testing+using+blastocyst+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium.</a> Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).</li>
<li>Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Births+after+intracytoplasmic+injection+of+sperm+obtained+by+testicular+extraction+from+men+with+nonmosaic+Klinefelter%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter's syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).</li>
<li>Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Istanbul+consensus+workshop+on+embryo+assessment%3A+proceedings+of+an+expert+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting.</a> Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product</a> (2015).</li>
<li>Miseq system use guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/downloads/miseq_system user _ guide 15027617.html">https://support.illumina.com/downloads/miseq_system user _ guide 15027617.html</a> (2016).</li>
<li>Lane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+to+detect+aneuploidy+from+cell+free+DNA+collected+from+media+is+dependent+on+the+stage+of+development+of+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo.</a> Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).</li>
<li>Rubio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+study+of+concordance+between+embryonic+cell-free+DNA+and+trophectoderm+biopsies+from+1301+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).</li>
<li>Rubio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cell-free+DNA+versus+trophectoderm+biopsy+for+aneuploidy+testing%3A+concordance+rate+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications.</a> Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).</li>
<li>Lledo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+results+of+non-invasive+PGT-A+of+human+embryos+using+two+different+techniques+for+chromosomal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis.</a> Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).</li>
<li>Kuznyetsov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+Invasive+Cell-Free+Human+Embryo+Aneuploidy+Testing+%28miPGT-A%29+Utilizing+Combined+Spent+Embryo+Culture+Medium+and+Blastocoel+Fluid+-Towards+Development+of+a+Clinical+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7244(2020).</li>
</ol>

Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang 및 Sijia Lu는 Yikon Genomics Co., Ltd.의 직원입니다.

수정 및 문제 해결
NICS 결과가 부모의 유전 물질로 오염된 경우 모든 적운-코로나 방사능 세포를 제거하고 수정을 위해 ICSI를 수행해야 합니다. DNA를 저하시킬 수 있는 부적절한 배지 보관 또는 템플릿 준비 프로세스를 피할 수 있습니다. 작업 공간은 DNase 및 RNase 오염 제거 시약으로 철저히 정제되었습니다. 다른 배아로부터의 오염을 피하기 위해, 4일째부터 시작되는 교차 오염을 피하기 위해 하나의 배아를 항상 배지의 단일 방울에서 배양했습니다. 오염 현상은 최종 배양 드롭에서 배아의 배치를 지연시킬 때 최소화됩니다30,31,32,33. 모계 오염을 최소화하기 위해 Kuznyetsov<sup class="xr...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62619">Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis</a>. The Protocol and Representaive Results sections were updated.
In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
to:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
In the Representative Results, Figure 3 was updated from:
<img alt="Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62619/62619fig03.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62619/62619fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62619/62619fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62619/62619fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62619">Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis</a>. The Protocol and Representaive Results sections were&#160;updated.

Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

보조 생식 기술(ART)은 불임 치료에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 IVF와 같은 ART의 성공률은 제한적이며, 임신 손실률은 정상 인구에 비해 현저히 높다1. 이러한 문제의 주요 원인은 착상 전 인간 배아에 일반적으로 존재하는 염색체 이상이다2. PGT-A는 착상 전에 배아의 염색체 균형을 스크리닝하는 효과적인 방법입니다 3,4. 일부 연구에서는 PGT-A가 낙태율을 낮추고 임신율을 향상시킬 수 있음을 입증했습니다 5,6,7,8. 그러나 PGT-A에는 특정 교육과 경험이 필요한 복잡한 기술 전문 지식이 필요합니다. 침습적 배아 생검 절차는 또한 잠재적으로 배아에 손상을 줄 수 있다9. 연구에 따르면 할구 생검은 후속 발달을 방해할 수 있으며, 생검된 TE의 수가 착상율에 영향을 미칠 수 있다10. 배아 생검의 장기적인 생물안전성 문제는 아직 인간을 대상으로 철저하게 평가되지 않았지만, 동물 연구에서는 배아 발달에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다11,12,13.
이전 보고에 의하면 배아 발달 과정에서 미량의 DNA 물질이 배양 배지로 분비되었으며, 사용된 배아 배양 배지 14,15,16,17,18을 사용하여 포괄적인 염색체 스크리닝(CCS)을 수행하려는 노력이 이루어졌다. 그러나 검사의 검출률과 정확도는 광범위한 임상 사용에 대한 요구 사항을 충족하지 못했습니다. 본 연구는 NICS 테스트의 정확도뿐만 아니라 검출률을 높이기 위한 NICS 분석의 개선을 보고하였다19. 최근 몇 년 동안 배반체액(BF)은 최소 침습 PGT-A의 분석 샘플로 연구되었습니다. 그러나 배반포액 샘플에서 성공적인 게놈 전체 증폭 및 검출 가능한 DNA의 비율은 34.8%에서 82%에 이릅니다20,21,22. 다양한 연구에서 보고된 BF의 부피는 0.3nL에서 1μL 사이입니다. BF에서 DNA의 양이 적다는 점을 고려하여, 배반포액과 배양 배지를 혼합하여 cell-free DNA의 양을 증가시켜 검출의 성공률과 일관성을 향상시킬 수 있습니다. Kuznyetsov 외.23 및 Li et al.24는 zona pellucida를 레이저로 처리하고 배반포액을 배양 배지에 방출하여 배아 DNA의 총량을 개선시켰으며, WGA 후 결합된 배지/BF 샘플의 증폭률은 각각 100% 및 97.5%였습니다. Jiao et al.25도 동일한 방법을 사용하여 100% 증폭 성공률을 얻었습니다.
본 연구는 사용한 배지 샘플 준비, NGS 준비 및 데이터 분석을 포함하는 자세한 프로토콜을 보고합니다. 본 연구는 난모세포에서 적운 세포를 조심스럽게 제거하여 세포질 내 단일 정자 주입(ICSI) 및 배반포 배양을 수행했습니다. 4일-5일/6일 소요 배지를 WGA 및 NGS 라이브러리 준비를 위해 수집했습니다. 본 연구는 NICS 기술을 사용하여 약 3시간 만에 WGA 및 NGS 라이브러리 준비 단계를 간소화하고 약 9시간 만에 비침습적으로 CCS 결과를 얻었습니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL EP 튜브, 0.2 mL PCR 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C, PCR-02-C</td><td>DNase/RNase free, Low Binding PCR 튜브 및 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브를 권장합니다.</td></tr><tr><td>10 & 마이크로; L, 200 &마이크로; L, 1000 &마이크로; L DNase /RNase Free Tips</td><td>Axygen</td><td>T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/샘플 이송용</td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Sinopharm 화학적</td><td>10009218</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/DNA 라이브러리 정제용</td></tr><tr><td>바코드 Primer1-48</td><td>Yikon Genomics</td><td>Reagent in NICSinst library preparation kit</td><td>라이브러리 증폭용</td></tr><tr><td>BD Falcon Organ Culture Dish, 멸균</td><td>BD Bioscience</td><td>363037</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/배아 배양</td></tr><tr><td>BD 팔콘 조직 배양 접시 (쉬운 그립) , 멸균</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/배아 배양</td></tr><tr><td>BD 팔콘 조직 배양 접시, 멸균</td><td>BD Bioscience</td><td>353002</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/배아 배양</td></tr><tr><td>Cell Lysis Buffer</td><td>Yikon NICS의 유전체학</td> 시약배<td>양 배지 전처리 용</td>첫 <td>번째 라이브러리 준비 키트</td></tr><tr><td>세포 용해 효소</td><td>Yikon 유전체학</td><td>시약 NICS의 Inst 라이브러리 준비 키트</td><td>배양 배지 전처리</td></tr><tr><td>ChromGo 소프트웨어</td><td>Yikon Genomics</td><td></td><td>데이터 분석</td></tr><tr><td>CMPure Magbeads</td><td>Yikon Genomics</td><td>시약 NICS의 Yikon 유전체학 시약라이브러리</td><td>정제 용</td></tr><tr><td>Cryotop 개방형 시스템</td><td>&nbsp; KITAZATO BioPharma</td><td>81110</td><td>이것은 다른 브랜드로 대체될 수 있습니다/배아 유리화용</td></tr><tr><td>증류수</td><td>Yikon Genomics</td><td>시약 in NICSInst 라이브러리 준비 키트</td><td>DNA</td></tr><tr><td>ES 용해 (유리화 키트)</td><td>&nbsp; KITAZATO BioPharma</td><td>시약 inVitrification kit</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/배아 유리화의 경우</td></tr><tr><td>HOLDNIG</td><td>ORIGIO</td><td>MPH-MED-35</td><td>다른 브랜드로 대체 가능 브랜드/ICSI</td></tr><tr><td>Hyaluronidase solution, 80 U/mL</td><td>SAGE</td><td>ART4007-A</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/Digest 난모세포-코로나-적운 복합체</td></tr><tr><td>ICSI</td><td>ORIGIO</td><td>MPH-35-35</td><td>이것은 다른 브랜드/ICSI</td></tr><tr><td>Illumina MiSeq&reg로 대체될 수 있습니다; 시스템</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>라이브러리 염기서열 분석</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Labotectect</td><td>Inkubator C16</td><td>다른 브랜드로 대체 가능 / 배아 배양</td></tr><tr><td>라이브러리 버퍼</td><td>Yikon Genomics</td><td>시약 NICS의 Inst 라이브러리 준비 키트</td><td>라이브러리 증폭</td></tr><tr><td>라이브러리 효소 믹스</td><td>Yikon Genomics</td><td>시약 NICS의 Yikon 유전체학 시약NicS의 첫 번째 라이브러리 준비 키트</td><td>라이브러리 amplificaton</td></tr><tr><td>마그네틱 스탠드</td><td>DynaMagTM-2</td><td>12321D</td><td>라이브러리 정제</td></tr><tr><td>현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>1X71</td><td>이것은 다른 브랜드로 대체 할 수 있습니다 / 배아 관찰 용</td></tr><tr><td>미니 원심 분리기</td><td>ESSENSCIEN</td><td>ELF6</td><td>분리</td></tr><tr><td>용 MT 효소 믹스</td><td>Yikon Genomics</td><td>시약 NICSInst 라이브러리 준비 키트</td><td>배양 배지 전처리 용</td></tr><tr><td>NICSInst 라이브러리 준비 키트</td><td>Yikon Genomics</td><td>KT1000800324</td><td>전체 게놈 증폭 및 라이브러리 구축</td></tr><tr><td>NICSInst Sample Prep Station</td><td>Yikon Genomics</td><td>&nbsp; ME1001003</td><td>Amplificate DNA</td></tr><tr><td>Nunc IVF 4-Well</td><td>Dish Thermo Scientific</td><td>144444</td><td>이것은 다른 브랜드로 대체될 수 있습니다/배아 세척 및 배양</td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Oirgio</td><td>&nbsp; MXL3-IND-135</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/배아 tansfer</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫의</td> 경우 <td>ORIGIO</td><td>PP-9-1000</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/IVF 실험실의</td></tr><tr><td>경우 Pre-Lib Buffer</td><td>Yikon Genomics</td><td>Reagent in NICSInst library preparation kit</td><td>Pre-library preparation</td></tr><tr><td>pre-Lib enzyme</td><td>Yikon Genomics</td><td>Reagent in NICSInst library preparation kit</td><td>사전 라이브러리 준비</td></tr><tr><td>Qubit&reg; 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33216</td><td>라이브러리 정량화용</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage Blastocyst Medium</td><td>SAGE</td><td>ART-1029</td><td>배아 배반포 단계 배양용</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage Cleavage Medium</td><td>SAGE</td><td>ART-1026</td><td>다른 브랜드/배아 분열 단계 배양용</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage Fertilization으로 대체 가능 Medium</td><td>SAGE</td><td>ART-1020</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/난모세포 및 정자 수정을 위해</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES</td><td>SAGE</td><td>ART-1023</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/배아 클러트루어의 경우</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit</td><td>SAGE</td><td>ART-3010</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/난모세포</td></tr><tr><td>를 탈락시키기 위해Quinn's Advantage 조직 배양 미네랄 오일</td><td>SAGE</td><td>ART-4008P</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/배양 배지를 커버하기 위해</td></tr><tr><td>STRIPPER TIPS</td><td>ORIGIO</td><td>MXL3-IND-135</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/과립층 세포 탈환용</td></tr><tr><td>유리화 Cryotop Open systerm</td><td>KIZTAZATO</td><td>81111</td><td>다른 브랜드로 대체 가능/배아 유리화</td></tr><tr><td>유리화 키트</td><td>용&nbsp; KITAZATO BioPharma</td><td>VT101</td><td>이것은 다른 브랜드로 대체될 수 있습니다/배아 유리화의 경우</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Qilinbeier</td><td>DNYS8</td><td>샘플 믹스</td></tr><tr><td>VS (유리화 키트)</td><td>&nbsp; KITAZATO BioPharma</td><td>시약 inVitrification kit</td><td>다른 브랜드로 교체 가능/배아 유리화의 경우</td></tr><tr><td>ZILOS-tk 레이저 시스템</td><td>Hamilton Thorne</td><td>CLASS 1 레이저</td><td>로 대체 가능/인공 배반구 붕괴의 경우</td></tr></tbody></table>

사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

임상 체외 수정(IVF)에서 PGT-A의 일반적인 방법은 영양배엽(TE)에서 몇 개의 세포를 생검해야 합니다. 이것이 태반을 형성하는 계통입니다. 그러나 이 방법은 전문 기술이 필요하고 침습적이며 TE의 염색체 수와 태아로 발달하는 내부 세포 질량(ICM)이 항상 동일하지 않기 때문에 위양성 및 음성이 발생합니다. TE 및 ICM에서 배양 배지로 방출된 DNA의 염기서열 분석이 필요한 기술인 NICS는 이러한 문제를 해결할 수 있는 방법을 제공할 수 있지만 이전에는 효능이 제한적인 것으로 나타났습니다. 본 연구는 배양 배지 샘플링 방법, 전체 게놈 증폭(WGA) 및 라이브러리 준비, 분석 소프트웨어에 의한 NGS 데이터 분석을 포함하는 NICS의 전체 프로토콜을 보고합니다. 배아 실험실마다 동결 보존 시간이 다르다는 점을 고려하여 발생학자는 IVF 실험실의 실제 조건에 따라 선택할 수 있는 배아 배양 배지를 수집하는 두 가지 방법을 가지고 있습니다.

본 연구는 제안된 방법을 환자에게 적용하였다. NICS 분석을 적용하기 전에 IRB 승인 및 사전 동의를 받았습니다. 본 연구는 환자로부터 6개의 배반포를 채취하고 4일차에서 5일차에 걸쳐 6개의 배아 모두에 대해 NICS를 수행했습니다. 부모의 균형 전위로 인한 염색체 이상은 NICS 분석으로 5개의 염색체에서 발견되었습니다. 따라서 전송에 사용할 수 없습니다(그림 4A-E). 두 배아의 NICS 결과는 동일한 핵형 45를 보여주었고, XN 및 -18(×1)은 모두 18번 염색체 결실이었습니다(그림 4A, B). 핵형 46, XN, -1p(pter→p21.1, ×1)는 염색체 1 pter→p21.1 영역 결실의 짧은 팔일 뿐입니다(그림 4D).
NICS 결과는...

본 연구는 배아 생검을 피하고 NGS를 사용하여 염색체 ploidy 식별을 가능하게 하는 폐배양 배지를 사용하는 인간 배아의 염색체 스크리닝 프로토콜을 보고합니다. 본 논문에서는 배양액 제조, 전장 유전체 증폭(WGA), 차세대 염기서열분석(NGS) 라이브러리 준비, 데이터 분석 등 자세한 절차를 제시한다.

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

프로토콜은 인간 착상 전 배아의 비침습적 염색체 스크리닝 NICS를 기반으로 배양된 배지 수집 및 염색체 다공체 분석을 정상화하는 것입니다. NICS의 주요 장점은 TiDieR 미세 조작보다 작동이 쉽고 시간이 절약되며 침습적 생검 샘플 손실을 효과적으로 줄인다는 것입니다. 샘플링 방법은 매우 유연합니다.여기서는 두 가지 옵션을 제공하는데, 하나는 일상적인 순차 배아 배양을 위한 것이고 다른 하나는 한 단계를 위한 것입니다. 이들은 우리 팀의 주요 동료이며, Yaxin Yao 박사와 Xiaohui Zhu 박사는 주로 라이브러리 준비 및 NICS 재생 시퀀싱을 담당합니다. Dr.Jialin Jia와 저는 발생학 연구와 샘플 수집을 완료했습니다.Liu 교수는 우리 그룹의 리더입니다. 그녀는 이 기사의 교신 저자이기도 합니다. 시작하려면 시약과 도구를 준비하십시오.사용하기 전에 20-30 마이크로리터의 배양 배지와 히알루로니다아제를 예열하고 평형을 이룹니다. 그런 다음 배양 배지와 히알루로니다아제를 흄 후드의 작업 표면에 놓습니다. 난모세포 처리를 위해 배양 접시에서 소화된 OCCC를 빠르게 옮기고 각 웰에 미네랄 오일을 덮습니다.부드럽게 흡인했다가 난모세포를 5-10회 방출하여 난모세포 주변에 남아 있는 과립세포를 제거합니다. 나머지 3개의 웰에서 이 단계를 반복하여 과립 세포를 완전히 제거합니다. 현미경을 사용하여 과립 세포 제거의 완전성을 평가합니다.그런 다음 ICSI라고도 하는 세포질 내 정자 주입을 수행하고 배아를 배양 배지로 옮깁니다. 각 배아에 대해 20-30 마이크로리터의 배반포 배양 배지 미세 방울을 준비합니다. 둘째 날에 조직 배양 접시에 배아를 미네랄 오일로 덮고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 산소 5%에서 배양합니다.3일째 되는 배아를 세척 미세 방울에 옮긴 후, 피펫을 사용하여 3개의 물방울에 있는 미세 방울에서 배아를 부드럽게 흡인하고 방출합니다. 그런 다음 배아를 배반포 배양 배지로 옮깁니다. 세척 미세 방울과 배양 미세 방울을 준비합니다.넷째 날 오후에 배아를 예열된 배양 배지의 미세방울에 옮기고 피펫으로 각 배아를 3개의 미세방울로 연속적으로 부드럽게 세척합니다. 샘플 수집을 위해 각 배아를 미리 따뜻해진 고유한 단일 미세방울의 배양 배지에 옮깁니다. 냉동 보존 전에 배반포 배아를 배양합니다.배아 동결 보존 전에 유리화를 수행하기 위해, 배양 미세 방울을 준비하고 배아를 10 내지 15 마이크로 리터 배양 배지의 예열된 미세 방울로 옮깁니다. 그리고 5일째 되는 날 아침에 피펫팅을 통해 각 배아를 3개의 미세 방울로 연속적으로 부드럽게 세척합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 샘플 수집을 위해 각 배아를 미리 따뜻해진 고유한 단일 미세방울의 배양 배지로 옮깁니다.그리고 냉동 보존 전에 섭씨 37도에서 배반포 배아를 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 다음으로, 영양배엽의 세포 접합부에 초점을 맞추는 레이저 빔의 표적 지점에서 상당한 거리에서 ICM을 부드럽게 조정하여 영양배엽에 작은 구멍을 생성하여 배반강에서 유체를 방출합니다. 샘플을 수집하려면 키트의 버퍼를 실온에서 해동하고 잠시 원심분리합니다.그런 다음 배양된 각 배아의 배양 배지를 5마이크로리터의 세포 용해 완충액이 들어 있는 RNase-DNase-free PCR 튜브로 옮깁니다. 시약과 도구를 준비합니다. 게놈 DNA를 정량화한 후 배양 배지로 마이크로리터당 50피코그램의 농도로 희석하였다.완전히 혼합한 후 튜브를 200G에서 5초 동안 잠시 원심분리합니다. 배양 배지를 마이크로 원심분리기에서 30 내지 60초 동안 원심분리한 후, 튜브 바닥에서 10 마이크로리터의 배양 배지를 피펫팅하여 양성 대조군 및 신선한 배양 배지를 새로운 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 희석하였다. MT 효소 혼합물 1마이크로리터를 넣고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다.그런 다음 즉시 2-3초 동안 원심분리합니다. PCR 튜브를 예열된 혼합 시료 전처리 스테이션에 넣고 용해 프로그램을 실행합니다. pre-lib 완충액이 해동되고 혼합되면, 200 G에서 2-3초 동안 즉시 원심분리합니다.60 microliter의 pre-library 완충액에 2 microliter의 pre-library 효소 혼합물을 첨가하여 pre-library 반응을 위한 마스터 믹스를 준비합니다.반응을 완전히 혼합하고 짧게 원심 분리하십시오. 60 마이크로리터의 사전 라이브러리 반응 혼합물을 전처리된 배지 샘플에 추가합니다. 피펫팅으로 완전히 혼합한 후 즉시 200G에서 2-3초 동안 원심분리합니다.PCR 튜브를 예열된 시료 전처리 스테이션에 놓습니다.사전 라이브러리 프로그램을 실행하고 섭씨 4도를 유지합니다. 1.6 마이크로리터의 라이브러리 효소 혼합물을 60 마이크로리터의 라이브러리 완충액에 첨가하여 라이브러리 반응을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 반응을 완전히 혼합하고 이전에 설명한 대로 원심분리합니다.라이브러리 반응 혼합물 60마이크로리터와 바코드 프라이머 2마이크로리터를 각 사전 라이브러리 제품에 추가합니다. 그런 다음 반응을 완전히 혼합하고 설명된대로 원심 분리하십시오. 원심분리 후 PCR 튜브를 열 순환기에 넣습니다.라이브러리 준비 프로그램을 실행한 다음 섭씨 4도를 유지합니다. 시약과 도구를 준비합니다. 준비된 1X 준비된 메가 비드를 라이브러리 샘플에 추가합니다.텍스트 원고에 설명된 대로 정제된 라이브러리를 정량화하고 풀링을 위해 각 라이브러리 샘플의 10나노그램을 사용합니다. sequencing 사용 가이드를 참고하여 sequencing이 완료된 후 데이터 분석을 수행합니다. ChromGo에서 데이터 분석을 위해 로그인 페이지에 사용자의 이름과 비밀번호를 입력합니다.로그인한 후 NICS 탭에서 Create Submission(제출 생성)을 클릭합니다. 그런 다음 플랫폼(Platform)에 NGS, 기업(Corporation)에 대해 Illumina, 시약(Reagent)에 대해 NICSInst를 선택합니다. 프로젝트 ID(Project ID) 아래의 상자에 프로젝트 정보를 입력합니다.분석 기본 설정을 지정하고 파일을 업로드합니다.모든 염기서열분석 파일이 성공적으로 업로드되면 제출을 클릭하여 분석을 시작합니다. 제출된 프로젝트는 제출물 보기 탭 아래에 나열됩니다. Report(보고서) 필드에서 Show(표시) 버튼을 클릭하여 NICS 분석의 요약 테이블을 봅니다.Export Report(보고서 내보내기) 버튼을 클릭하여 보고서를 저장합니다. 환자로부터 6개의 배반포를 채취하고 4일째부터 5일째까지 6개의 배아 모두에 대해 NICS를 수행했습니다. 부모의 균형 전좌로 인한 염색체 이상은 NICS 분석을 사용하여 5개의 염색체에서 발견되었으므로 이식에 사용되지 않았습니다.두 배아의 NICS 결과는 동일한 핵형 45 XN과 18번 염색체 결실이 모두 18번 염색체 결실임을 보여주었습니다. 염색체 1 영역 결실의 핵형 46 XN 짧은 팔은 염색체 영역 결실의 짧은 팔일 뿐이었다. NICS 결과는 염색체 18 영역 결실의 긴 팔과 염색체 1 영역 복제의 짧은 팔을 가진 핵형 46 XN을 보여주었습니다.핵형은 5개의 염색체 복제였고 8개의 모자이크 차이를 보였지만 NICS 분석은 24개의 염색체 모두를 이수성으로 스크리닝할 수 있었습니다. 이 과정은 단일 정상 핵형 배반포를 옮기는 새로운 방법을 제공합니다. 이 절차를 시도하는 동안 모계 기원 오염을 피하기 위해 적층 세포를 완전히 제거하고 DNA 함량이 증폭에 충분할 때 배양 배지와 설명된 배반포 단계를 수집하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.본 연구는 NICS 기술을 사용하여 WGA 및 WGS 라이브러리 준비 단계를 약 3시간 만에 간소화하고 약 9시간 만에 비침습적 CCS 결과를 옵트인했습니다. 개발 후 이 기술은 ART의 임상의에게 형태학적 평가와 NICS를 결합하여 형태가 양호한 배아를 자궁으로 이식하는 새로운 방법을 제공하여 진행 중인 임신율과 출생률을 향상시킬 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Karyotyping 널리 유전 변경을 검출에 사용되는 간단하고 유용한 기술입니다. 우리가 문화의 유지 이러한 세포의 염색체 상태를 감시하기위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 보급 준비 단계 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다.

Karyotyping를위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 확산 준비

이 문서는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브 리다이 제이션과 임상 설정에서 미리 주입 유전자 진단 (PGD)에 적용되는 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

사전 이식 유전자 진단 생선

염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다.

배양 세포에서 염색체 준비

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

포유류에서 oogenesis 오류가, 특히 염색체 missegregation 인 것으로 알려져 있다. 이 원고 chromatin 확산 마우스 의향에 대 한 준비 방법에 설명 합니다 분열 I 및 II 준비 oocytes. 이러한 기본 기술을 chromatin-바인딩 단백질 및 포유류 oogenesis 전체 염색체 형태학 연구에 대 한 수 있습니다.

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

여기서는 짧은 처리 시간, 낮은 비용 및 높은 처리량의 장점을 가진 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 염기서열 분석 방법을 소개합니다.

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

배반포 생검 및 유리화는 착상 전 유전자 검사를 효율적으로 수행하기 위해 필요합니다. 조나 펠루시다의 순차적 개방및 5-7일째에 7-8개의 트로페토더세포를 회수하는 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 이하의 환경 조건으로 제한한다.

인간 배반포 생검 및 유리화

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인간 계란 성숙도 평가 및 임상 적용

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

배우세요 인간 착상 전 배아의 비침습적 염색체 스크리닝 방법을 사용된 배양 배지를 통해. NGS 기술로 염색체 배합을 정확히 분석하여 생식 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석

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