Name: RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화를 식별하는 생물정보학 프로토콜을. 엑손 기반 및 이벤트 기반 방법을 사용하여 차등 스플라이싱 부위와 폴리(A) 부위 사용을 분석하고 시각화합니다.

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이 연구는 호주 연구위원회 (ARC) 미래 펠로우십 (FT16010043) 및 ANU 선물 계획의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li>
<li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li>
<li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li>
<li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li>
<li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PolyASite+2.0%3A+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3%27+end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li>
<li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364(2014).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13(2016).</li>
<li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2014).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rMATS%3A+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li>
<li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li>
<li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li>
<li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li>
<li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+read+archive%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, suppl_1 19-21 (2010).</li>
<li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTange%2C+O+%22GNU+parallel-the+command-line+power+tool%22">GNU parallel-the command-line power tool</a>. 36, 42-47 (2011).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/2010">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/2010</a> (2011).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet+journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), Oxford, England. 15-21 (2013).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25(2010).</li>
<li>Veiga, D. F. T. maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVeiga%2C+DFT+%22R+package+version+1.4.0%22">R package version 1.4.0</a>. , (2019).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25(2009).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Ramírez, F., Dündar, F., Diehl, S., Grüning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools%3A+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li>
<li>Merino, G. A., Conesa, A., Fernández, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li>
<li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13(2016).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li>
<li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSEM%3A+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).</li>
<li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li>
</ol>

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이 연구에서는 대량 RNA-Seq 및 3' 말단 시퀀싱 데이터에서 AS 및 APA를 검출하기 위한 엑손 기반 및 이벤트 기반 접근 방식을 평가했습니다. 엑손 기반 AS 접근법은 차등적으로 발현된 엑손의 목록과 전체 유전자 수준의 차등 스플라이싱 활성의 통계적 유의성에 따라 정렬된 유전자 수준 순위를 모두 생성합니다(표 1-2, 4-5). diffSplice 패키지의 경우, 차등 사용은 엑손 수준에서 가중 선형 모델을 피팅하여 동일한 유전자 내의 다른 엑손의 평균 로그 폴드 변화에 대한 엑손의 차등 로그 폴드 변화를 추정함으로써 결정됩니다 (엑손 FC 당이라고 함). 유전자 수준 통계적 유의성은 개별 엑손 수준 유의성 검사를 Simes 방법10에 의한 유전자 별 검사로 결합하여 계산됩니다. 유전자 수준의 차등 스플라이싱 활성에 의한 이러한 순위는 후속적으로 관련된 주요 경로(10)의 유전자 세트 농축 분석(GSEA)...

RNA-seq는 일반적으로 차등 유전자 발현 및유전자 발견을 추정하기 위해 수년에 걸쳐 널리 사용되어 왔습니다1. 또한 다양한 이소 형을 발현하는 유전자로 인해 다양한 엑손 수준 사용량을 추정하는 데 활용할 수 있으므로 전사 후 수준에서 유전자 조절을 더 잘 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 대부분의 진핵생물 유전자는 mRNA 발현의 다양성을 증가시키기 위해 대안적 스플라이싱(AS)에 의해 상이한 이소형을 생성한다. AS 이벤트는 다른 패턴으로 나눌 수 있습니다 : ( "카세트") 엑손이 측면 인트론과 함께 전사체에서 완전히 제거되는 완전한 엑손 (SE)의 건너 뛰기; 대안 (공여체) 5' 스플라이스 부위 선택 (A5SS) 및 대안 3' (수용체) 스플라이스 부위 선택 (A3SS) 2개 이상의 스플라이스 부위가 엑손의 양쪽 말단에 존재할 때; 인트론이 성숙한 mRNA 전사체 내에 유지되는 경우 인트론(RI)의 유지 및 한 번에 두 개의 사용 가능한 엑손 중 하나만 보유할 수 있는 엑손 사용(MXE)의 상호 배제 2,3. 대안적 폴리아데닐화 (APA)는 또한 단일 전사체로부터 다수의 mRNA 이소형을 생성하기 위해 대안적인 폴리 (A) 부위를 사용하여 유전자 발현을 조절하는데 중요한 역할을한다4. 대부분의 폴리아데닐화 부위 (pAs)는 3' 비번역 영역 (3' UTR) 내에 위치하여, 다양한 3' UTR 길이를 갖는 mRNA 이소형을 생성한다. 3' UTR이 조절 요소를 인식하기 위한 중앙 허브이기 때문에, 상이한 3' UTR 길이는 mRNA 국소화, 안정성 및 번역(5)에 영향을 미칠 수 있다. 프로토콜6의 세부 사항에서 다른 APA를 검출하도록 최적화 된 3 '최종 시퀀싱 분석의 클래스가 있습니다. 여기에 설명된 파이프라인은 PolyA-seq용으로 설계되었지만 설명된 대로 다른 프로토콜에 맞게 조정할 수 있습니다.
이 연구에서는 차등 엑손 분석 방법7,8(그림 1)의 파이프라인을 제시하며, 이는 엑손 기반(DEXSeq9, diffSplice 10)과 이벤트 기반(전사체 접합의 복제 다변량 분석(rMATS)11)의 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다. 엑손 기반 방법은 개별 엑손의 조건에 따른 폴드 변화를 차등적으로 발현된 엑손 사용량을 호출하기 위한 전체 유전자 폴드 변화의 척도와 비교하고, 그로부터 AS 활성의 유전자 수준 측정을 계산합니다. 이벤트 기반 방법은 엑손 인트론 스패닝 접합 읽기를 사용하여 엑손 건너뛰기 또는 인트론 유지와 같은 특정 스플라이싱 이벤트를 감지 및 분류하고 출력3에서 이러한 AS 유형을 구별합니다. 따라서 이러한 방법은 AS12,13의 완전한 분석을위한 보완적인 견해를 제공합니다. DEXSeq(DESeq214 DGE 패키지 기반)와 diffSplice(Limma10 DGE 패키지 기반)는 차동 접합 분석에 가장 널리 사용되는 패키지 중 하나이기 때문에 연구를 위해 선택했습니다. rMATS는 이벤트 기반 분석에 널리 사용되는 방법으로 선택되었습니다. 또 다른 인기 있는 이벤트 기반 방법은 MISO(Mix of Isoforms)1입니다. APA의 경우 엑손 기반 접근 방식을 적용합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> 그림 1. 분석 파이프라인. 분석에 사용된 단계의 순서도입니다. 단계에는 데이터 획득, 품질 검사 수행 및 읽기 정렬 수행 후 알려진 엑손, 인트론 및 pA 사이트에 대한 주석을 사용하여 읽기 계산, 낮은 카운트 제거 및 정규화를 위한 필터링이 포함됩니다. PolyA-seq 데이터는 diffSplice/DEXSeq 방법을 사용하여 대체 pA 부위에 대해 분석되었고, 벌크 RNA-Seq는 diffSplice/DEXseq 방법을 사용하여 엑손 수준에서 대체 스플라이싱에 대해 분석되었으며, AS 이벤트는 rMATS로 분석되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 조사에 사용된 RNA-seq 데이터는 유전자 발현 옴니버스(GEO)(GSE138691)15에서 획득한 것이다. 우리는 이 연구의 마우스 RNA-seq 데이터를 야생형(WT) 및 근맹 유사 유형 1 녹아웃(Mbnl1 KO)의 두 가지 조건 그룹과 함께 각각 3개의 반복으로 사용했습니다. 차등 폴리아데닐화 부위 사용 분석을 입증하기 위해, 마우스 배아 섬유아세포(MEF) PolyA-seq 데이터(GEO Accession GSE60487)16를 얻었다. 데이터에는 야생형(WT), 근맹형 유형 1/유형 2 이중 녹아웃(Mbnl1/2 DKO), Mbnl3 녹다운(KD)이 있는 Mbnl 1/2 DKO 및 Mbnl3 대조군이 있는 Mbnl1/2 DKO(Ctrl)의 네 가지 조건 그룹이 있습니다. 각 조건 그룹은 두 번의 반복실험으로 구성됩니다.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>지역 가입</td>
			<td>SRA 실행 번호</td>
			<td>샘플 이름</td>
			<td>조건</td>
			<td>복제</td>
			<td>조직</td>
			<td>시퀀싱</td>
			<td>읽기 길이</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-서열</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 녹아웃</td>
			<td>담당자 1</td>
			<td>흉선</td>
			<td>페어링 엔드</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 녹아웃</td>
			<td>담당자 2</td>
			<td>흉선</td>
			<td>페어링 엔드</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 녹아웃</td>
			<td>담당자 3</td>
			<td>흉선</td>
			<td>페어링 엔드</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>와일드 타입</td>
			<td>담당자 1</td>
			<td>흉선</td>
			<td>페어링 엔드</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>와일드 타입</td>
			<td>담당자 2</td>
			<td>흉선</td>
			<td>페어링 엔드</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>와일드 타입</td>
			<td>담당자 3</td>
			<td>흉선</td>
			<td>페어링 엔드</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-시퀀스</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>와일드 타입 (WT)</td>
			<td>담당자 1</td>
			<td>마우스 배아 섬유아세포(MEF)</td>
			<td>단일 종단</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>와일드 타입 (WT)</td>
			<td>담당자 2</td>
			<td>마우스 배아 섬유아세포(MEF)</td>
			<td>단일 종단</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 더블 녹아웃 (DKO)</td>
			<td>담당자 1</td>
			<td>마우스 배아 섬유아세포(MEF)</td>
			<td>단일 종단</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 더블 녹아웃 (DKO)</td>
			<td>담당자 2</td>
			<td>마우스 배아 섬유아세포(MEF)</td>
			<td>단일 종단</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 3 siRNA (KD)를 사용한 Mbnl 1/2 이중 녹아웃</td>
			<td>담당자 1</td>
			<td>마우스 배아 섬유아세포(MEF)</td>
			<td>단일 종단</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 3 siRNA (KD)를 사용한 Mbnl 1/2 이중 녹아웃</td>
			<td>담당자 2</td>
			<td>마우스 배아 섬유아세포(MEF)</td>
			<td>단일 종단</td>
			<td>36 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>비표적 siRNA를 사용한 Mbnl 1/2 이중 녹아웃(Ctrl)</td>
			<td>담당자 1</td>
			<td>마우스 배아 섬유아세포(MEF)</td>
			<td>단일 종단</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>비표적 siRNA를 사용한 Mbnl 1/2 이중 녹아웃(Ctrl)</td>
			<td>담당자 2</td>
			<td>마우스 배아 섬유아세포(MEF)</td>
			<td>단일 종단</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr></tbody></table>표 1. 분석에 사용된 RNA-Seq 및 PolyA-seq 데이터 세트의 요약.

rna-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

실험/생물학적 조건에서 차등 유전자 발현(DGE)을 측정하기 위한 RNA-Seq의 일반적인 분석뿐만 아니라 RNA-seq 데이터를 활용하여 엑손 수준에서 다른 복잡한 조절 메커니즘을 탐색할 수도 있습니다. 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화는 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하기 위해 다양한 이소형을 생성하여 유전자의 기능적 다양성에 중요한 역할을 하며, 분석을 전체 유전자 수준으로 제한하면 이 중요한 조절 층을 놓칠 수 있습니다. 여기에서는 바이오컨덕터와 DEXSeq, Limma 패키지의 diffSplice 및 rMATS를 포함한 기타 패키지 및 기능을 사용하여 조건에 따른 차등 엑손 및 폴리아데닐화 부위 사용의 식별 및 시각화를 위한 자세한 단계별 분석을 시연합니다.

위의 단계별 워크플로우를 실행한 후 AS 및 APA 분석 출력과 대표 결과는 다음과 같이 생성된 테이블 및 데이터 플롯 형태입니다.
만큼: AS 분석의 주요 출력(diffSplice에 대한 보충 표 1; DEXSeq)에 대한 표 2는 조건에 따른 차등 용법을 나타내는 엑손의 목록이고, 통계적 유의성에 의해 순위가 매겨진 하나 이상의 구성 엑손의 유의한 전체 스플라이싱 활성을 나타내는 유전자 목록이다. 보충 표 1, 탭 2는 유의한 엑손을 보여주며, 열은 엑손 대 휴식의 차등 FC, 엑손당 조정되지 않은 p-값 및 조정된 p-값(Benjamini-Hockberg 보정)을 보여줍니다. 조정 된 p- 값에 대한 임계 값은 정의 된 FDR을 갖는 엑손 세트를 제공 할 것이다. 보충 표 1, 탭 3은 전체 스플라이싱 활성의 유의성을 ...

대체 스플라이싱(AS) 및 대체 폴리아데닐화(APA)는 전사체 이소형과 그 생성물의 다양성을 확장합니다. 여기에서는 실험 조건에 따라 다양한 AS 및 APA를 검출하고 시각화하기 위해 벌크 RNA-seq 및 3' 말단 시퀀싱 분석을 분석하는 생물정보학 프로토콜을 설명합니다.

RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

이 프로토콜은 차등 스플라이싱 부위, 차등적으로 발현된 엑손 및 폴리(A)부위를 식별하기 위한 단계별 워크플로우를 제공하여 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화에 의해 생성된 유전자 이소형에 대한 포괄적인 이해를 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 대체 접합을 연구하기 위한 엑손 기반 및 이벤트 기반 방법을 모두 평가한다는 것입니다. 또한 대체 폴리아데닐화를 연구하기 위해 엑손 기반 방법을 적용합니다.AS 및 AP 분석을 위한 코드와 메모가 포함된 R Markdown 파일이 제공되었습니다. R Markdown 파일의 단계를 따르고 각 단계에 대한 메모에 주의 깊게 도달하는 것이 좋습니다. limma에서 diffSplice를 사용하여 차등 접합을 식별하려면 R 노트북 파일을 따릅니다.텍스트 원고에 설명된 대로 입력 파일을 준비합니다. 계속 진행하기 전에 입력 파일을 준비하기 위해 원고의 1단계부터 3단계까지 순차적으로 수행했는지 확인합니다. 먼저 필요한 라이브러리를 로드합니다.비특이적 필터링을 수행하려면 먼저 이전에 얻은 읽기 횟수의 행렬을 추출하고 edgeR 패키지에서 DGEList 함수를 사용하여 특징 목록을 만듭니다. 여기서 행은 유전자를 나타내고 열은 샘플을 나타냅니다. 그런 다음 edgeR 패키지의 CPM 함수를 사용하여 원시 스케일에서 백만당 카운트로 데이터를 변환하고 설정 가능한 임계값보다 큰 카운트로 엑손을 유지합니다. 이 데이터 세트에는 6개의 샘플이 포함되어 있습니다.따라서 CPM은 1보다 크고 6개 중 3개 이상의 샘플로 설정됩니다. M 값의 절사 평균을 사용하여 edgeR 패키지의 calcNormFactors 함수를 사용하여 샘플 전체의 개수를 정규화합니다. 이 함수는 라이브러리 크기를 조정하기 위해 배율 인수를 계산합니다.이전에 생성된 표본 표를 사용하여 각 표본에 대한 실험 조건을 정의하는 설계 행렬을 생성합니다. limma 패키지의 voom 함수를 실행하여 RNA 시퀀싱 데이터를 처리하여 분산을 추정합니다. 이 함수는 포아송 카운트 잡음을 보정하기 위해 정밀 가중치를 생성하고 엑손 레벨 카운트를 변환하여 백만당 2카운트 또는 logCPM을 기록합니다.lmfit 함수를 실행하여 선형 모델을 각 엑손의 표현식 데이터에 피팅합니다. 그런 다음 eBayes 함수를 실행하여 피팅된 모델에 대한 경험적 기반 통계량을 계산하여 미분 엑손 식을 탐지합니다. 관심 있는 실험적 비교를 위한 대비 행렬을 정의합니다.대비를 사용하십시오. 각 비교 쌍에 대한 계수와 표준 오차를 구하기 위한 fit 함수입니다. 적합된 모델에서 diffSplice를 실행하여 야생형과 녹아웃 간 유전자의 엑손 사용 차이를 검정합니다.t와 같은 검정은 AS 엑손의 순위를 제공하고 simes와 같은 검정은 유전자의 순위를 제공하는 topSplice 함수를 사용하여 최상위 결과를 탐색합니다. plotSplice 함수를 실행하여 결과를 플로팅합니다. 유전자 ID 인수에 관심 유전자를 넣을 때 빨간색 점은 차등적으로 발현된 엑손을 나타냅니다.EnhancedVolcano 바이오컨덕터 패키지를 사용하여 화산 플롯을 생성하여 차등적으로 발현된 엑손을 나타냅니다. rMATS를 사용하려면 작업 디렉터리에 conda 또는 GitHub를 사용하여 최신 버전의 rMATS 버전 4.1.1이 설치되어 있는지 확인합니다. 매핑 후 얻은 bam 파일이 포함된 폴더로 이동합니다.bam 파일의 이름과 해당 경로를 쉼표로 구분하여 복사하는 두 가지 조건에 대해 rMATS에서 요구하는 대로 텍스트 파일을 준비합니다. rmas를 실행합니다. py는 BAM 파일의 경로와 주석을 설명하는 두 개의 생성 된 입력 텍스트 파일을 사용합니다.이전에 얻은 GTF 파일입니다. 이렇게 하면 각 접합 이벤트에 대한 P-값 및 포함 수준을 포함한 통계를 개별적으로 설명하는 텍스트 파일이 포함된 출력 폴더 rmats_out 생성됩니다. 바이오컨덕터 패키지 메이저를 사용하여 rMATS 결과를 탐색합니다.접합 및 exon은 확장자 JCEC가 있는 텍스트 파일을 메이저 객체에 로드하고 스플라이싱 이벤트당 평균 읽기 횟수를 5회 이상 포함하여 적용 범위를 기준으로 결과를 필터링합니다. rMATS 결과를 시각화하려면 먼저 maser 패키지에서 topEvents 함수를 실행하여 잘못된 검색 비율 10%와 접합된 백분율 또는 PSI의 최소 10% 변화로 중요한 접합 이벤트를 선택합니다. 관심 있는 개별 유전자에 대한 유전자 이벤트를 확인하고 해당 유전자의 각 스플라이싱 이벤트에 대한 PSI 값을 플로팅합니다.사건 유형을 지정하여 화산 플롯을 생성합니다. rMATS로 얻은 접합 이벤트 결과를 텍스트 파일 형식으로 사용하여 rmats2sashimiplot 패키지를 사용하여 사시미 플롯을 생성합니다. 사시미 플롯은 Wnk1 유전자에서 건너뛴 엑손 이벤트를 보여줍니다.각 행은 RNA-seq 샘플, 야생형의 3 회 반복 및 Mbnl1 녹아웃을 나타냅니다. 높이는 RPKM 단위의 읽기 범위를 나타내고 연결 호는 엑손 전체의 접합 읽기를 나타냅니다. 하단 부분은 주석이 달린 유전자 모델 대체 이소폼을 보여줍니다.diffSplice 및 DEXSeq를 사용하여 얻은 화산 플롯의 왼쪽 상단 또는 오른쪽 사분면에 위치한 유전자에서 실질적인 접힘 변화와 진정한 차이에 대한 강력한 통계적 증거가 관찰 될 수 있습니다. 카세트 엑손은 Wnk1 유전자에 대해 상이한 조건 사이에서 변하는 것으로 밝혀졌다. 차등 엑손 사용 플롯은 Wnk1.6.45 근처의 5개 엑손 부위에서 차등 접합의 증거를 보여주었으며, 분홍색으로 강조 표시된 엑손은 야생형에 비해 Mbnl1 녹아웃 샘플에서 접합될 가능성이 높습니다.대안적으로 접합된 유전자의 화산 플롯은 야생형에서 제외된 유전자와 야생형에 포함된 유전자를 구별하는 데 도움이 되었습니다. 접합 이벤트 SE, A5SS, A3SS, MXE 및 RI의 유형은 해당 이벤트의 가장 중요한 유전자의 사시미 플롯을 사용하여 시각화되었습니다. 유전자의 3 개의 주요 비 번역 영역에서의 차등 APA 활성은 화산 플롯을 사용하여 관찰되었다.서로 다른 파이프라인에서 얻은 상당히 다른 PA 사이트 사용 결과는 이벤트 플롯을 사용하여 시각화되었습니다. 이중 녹아웃에서 PA 부위 사용의 상당한 원위부 대 근위 이동은 유전자 FOSL1 및 Papola 모두에서 관찰 될 수 있습니다. 게놈 전체 수준에서 알려진 PA 절단 부위에 고정된 측면 영역의 평균 적용 범위는 진단 플롯을 사용하여 결정되었습니다.개수 메트릭을 생성할 때 트랜스특이적 정보 및 다중 중첩 허용과 같은 매개 변수가 올바르게 사용되는지 확인합니다. 선형 모델을 피팅하고 대비쌍을 생성하는 것은 적절한 비교를 위해 중요합니다. rMATS의 경우 명령을 실행하기 전에 데이터에 따라 모든 매개 변수가 올바르게 설정되었는지 확인하십시오.차등 스플라이싱 활성으로부터 수득된 유전자는 유전자 세트 농축 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있었다. MISO라는 또 다른 도구는 추가 이벤트 기반 분석에 사용할 수 있습니다.

identification-alternative-splicing-polyadenylation-rna-seq

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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배우세요 RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화를 식별하는 생물정보학 프로토콜을. 엑손 기반 및 이벤트 기반 방법을 사용하여 차등 스플라이싱 부위와 폴리(A) 부위 사용을 분석하고 시각화합니다.

RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

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