Name: 진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: 배우세요 진핵 세포에서 포름알데히드 교차결합을 이용해 번역 단지를 신속하게 고정하고 격리하는 방법을. 이 기술은 효모와 포유류 세포에서 RNA:단백질 상호작용을 분석하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 호주 연구 위원회 디스커버리 프로젝트 보조금 (DP180100111에서 T.P. 및 N.E.S), 국립 보건 및 의학 연구 위원회 조사원 보조금 (GNT11175388에서 N.E.S.) 및 연구 펠로우십 (APP1135928에서 T.P.에)에 의해 지원되었습니다. 저자는 고급 현미경 검사법의 센터에서 현미경 호주의 시설을 인정, 호주 국립 대학, 대학과 연방 정부에 의해 투자되는 시설.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

포름알데히드 고정은 생체 분자10,36,45,46,47, 47,48의생체 내 빠른 생체 내 교차 연결을 달성하는 편리하고 인기있는 방법입니다. 다른 잠재적 인 생체 분자 목표에 비해, 번역 복합체의 성공적인 캡처는 세포 또는 다른 물질의 스냅 냉각 동안 즉각적인 고정을 필요로한다. 지연되지 않은 안정화없이, 다른 번역 관련 프로세스가 계속 될 가능성이있다, 멀리 vivo 상태에서 흔들리지 에서 복잡한 분포를 이동(49). 번역적 체포 및 리보소말 복합 안정화의 다른 방법에 비해, 세포막을 가로지르는 포름알데히드 작용의 신속성과 교차링크의 무차별적 특성은 그들의 네이티브 분산 상태에 가까운 번역 복합 중급자의 최대 다양성의 보존을약속한다 50.
여기에 제시된 접근법은 효모와 포유류 세포 모두에서 확립되고 최적화되었으며, 방법은 이제 전체 척추동물(예를 들어, 제브라피시 배아)과 같은 보다 다양한 생물학적 물질(예를 들어)10,38, 39,49,51,52와 같은 보다 다양한 생물학적 물질에 걸쳐 사용하기 위해 다른 집단에 의해파생되었습니다. . 이러한 작품은 전체적으로 접근의 다양성과 광범위한 적용성을 확신하지만, 번역 복합체의 빠른 포름알데히드는 최적화 및 조정의 필요성으로 인해 새로운 유형의 생물학적 물질로 전이하기가 다소 어렵다고 간주 할 수 있습니다.
방법의 성공에 가장 중요한 요구 사항은 포름알데히드의 농도와 세포 수집 및 중단 기술의 재최적화입니다. 덜 투과성, 작고 둥근 효모 세포는 고정 된 세포의 포름알데히드 농도와 물리적 중단을 훨씬 더 높은 (적어도, 10 배)를 필요로한다. 대조적으로, 배양에서 크고 평평해진 포유동물 세포는 쉽게 과고할 수 있고 고정시 부드러운 취급이 필요하며, 고정된 복합체의 추출은 세제를 사용하여 막 중단으로 화학적으로 수행될 수 있다. 교차 연결이 부족하면 덜 안정적이거나 더 단명한 중간자가 나중에 상태로 해리되거나 누출될 수 있습니다. 지나치게 교차하는 것은 리보소말 분획을 분리하고 연구하는 능력에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며 무거운 복합체의 더 깊은 고갈과 같은 선택적 편견을 만들 수 있습니다. 우리의 관측에서, 사용된 부착된 인간 세포의 모형과 같은 사소한 변경조차, 복구된 교차 연결 복합체의 수율에 영향을 미칠 수 있고 교차 연결 식이요법의 재최적화를 요구할 수 있습니다. 또한 식물 세포와 같이 실질적으로 다른 투과성 특성을 가진 세포가 고정조건(52)의추가적인 광범위한 최적화가 필요할 것으로 예상할 수 있다. 그러나 접근 방식과 완전히 호환되지 않는 생물학적 물질의 유형을 상상하기는 어렵습니다.
포유류 고정 프로토콜에 관련된 한 가지 고려 사항은 입력으로 사용되는 세포 물질의 밀도 와 양입니다. 세포 번역 역학에 대한 외부 영향을 피하기 위해 적어도 2 일 동안 다시 파종또는 기타 방해없이 세포가 지속적으로 성장하는 것이 좋습니다. 대부분의 세포 유형에 적용 가능하지만, 대부분의 부착 셀은 지속적으로 70% 이하의 합류 수준을 달성하여 번역률에 부정적이고 예측할 수 없는 주요 접촉 억제 효과가 없음을 보장합니다.
무차별 반응성에서 비롯된 포름알데히드 고정의 또 다른 흥미롭고 잠재적으로 편리할 수 있는 특징은 혼합 분류학 시스템의 번역 복합체에 대한 안정화 효과입니다. 세균성, 그리고 더욱 이렇게 미토콘드리아의 번역 복합체, 엽록소 및 다른 세포내 기생충, 악명 높게 특정 번역 억제제로 표적으로 하기 어려웠습니다. 대조적으로, TCP-seq 데이터에서, 미토레미터메에 매핑하는 발자국은 데이터38,39,50에서쉽게 관찰할 수 있다. 흥미로운 후속 개발은 토양, 물 또는 창자 샘플과 같은 전체 마이크로 커뮤니티에서 번역을 조사하는 접근 방식을 사용하는 것일 수 있으며, 신뢰할 수있는 빠른 번역 체포 및 다른 수단과의 복잡한 안정화가 문제가 될 수 있습니다.
또한 가장 복잡한 물질(예: 단단 및/또는 부피가 큰 조직)의 경우 세포 붕괴 및 물질 균질화 시 즉시 포름알데히드 안정화의 사용을 막을 수 있는 것은 없다는 점을 언급해야 합니다. 이러한 접근법은 이미 특정 소분자억제제(33,53,54,55)로번역 복합체를 안정화할 때 세포 입력 지연을 제거하기 위해 사용된다. 포름알데히드 고정이 전통적으로 전자 현미경 검사법45,56,57,58과같은 응용 분야에서 전 생체 내/시험관 내 샘플 안정화에 대한 우수한 결과로 사용되어 왔다는 점을 감안할 때, 특히 철저하게 고정된 세포로부터 의 번역 복합체의 가난한 추출과 관련된 경우, 특히 이러한 경우에 더 적은 부정적인 효과를 기대할 수 있다.
우리의 연구 결과는 eIF4A를 포함하는 것과 같은 높게 일시적인 복합체를 안정시키기 위하여 급속한 포름알데히드 고정의 유용성을 확인합니다. 포유류와 는 달리 효모 eIF4A는 캡 결합 복합 eIF4F와 훨씬 더 약하게 연관되어 있으며, 그 결과 일반적으로 번역 복합체가 일반적으로 발생한다는 점은 주목할 만하다. eIF4A는 일반적으로효모29, 59,60,61,62, 62,63에서리보소말 물질의 광범위한 정화 중에 손실된다. 그러나 생체 내 고정 효모 재료에서는그 존재가 예상되는 모든 번역 단지에서 eIF4A의 신뢰할 수있는 농축을 달성 할 수 있습니다. 이전에 발표된 Sel-TCP-seq 데이터는 리보솜과 더 강하게 연관되는 eIF2 및 eIF3의 농축을 입증하였다(뿐만 아니라 일시적인 공동 번역 단백질 복합 조립을 밝혀내고 있음)39. 따라서, 상기 방법은 번역 복합체의 두 가지, 강하고 약한 부착 성분의 검출에 적합하다.
요약하자면, 번역 개시 단계에서 발생하는 변화에 주로 통찰력을 얻고 mRNA를 통해 리보소말 분포를 최소화하는 데 유용한 접근 방식을 제시했습니다. 중요한 것은, 이 접근법은 eIF4A와 같은 번역 복합체의 비교적 비열하고 역동적인 구성 요소의 안정화에 적합하며, 필요한 최적화를 광범위하게 받을 수 있다. 우리는 또한 번역의 급속한 동적 변화의 시나리오에서 포름알데히드 고정의 유용성에 대한 증거를 제공하고, 환경 변화 또는 스트레스 조건에 빠르게 진행되는 세포 반응과 같은 조사 영역을 열어.

살아있는 유기체는 항상성을 유지하고 생존을 보장하기 위해 신속한 반응을 필요로하는 수명 전반에 걸쳐 동적 내 세포 및 세포 외 변화의 대상이됩니다. 환경 적응을 허용하기 위하여는, 진핵 세포는 유전자 발현 통제를 통해 그들의 물질 대사를 조정합니다. 유전자 발현 조절은 전사 및/또는 번역 중에 가해질 수 있다; 일반적으로 더 빠르게 발생 하는 번역응답으로1,2,3,4. 예를 들어, 번역 변화는 일반적으로 응력 발병 의 1-30 분 이내에 발생하며, 전사 수준 변경은 스트레스 노출3,4,5후에 몇 시간을 따릅니다. 번역 출력에 대한 변경은 세포질에서 메신저 (m) RNA 분자의 지속적인 가용성으로 인해 더 빠르게 달성된다. 반대로, 전사 수준에서 새로운 mRNA 분자는 합성되어야 하며, 진핵에서 처리 및 핵으로부터 내보내져 응답 시간2,4,6,7,8에광범위한 지연을 발생시켜야 한다.
스트레스에 대한 급성 번역 반응은 일반적으로 세포 생존에 필요한 단백질의 선택적 업 규제와 함께 번역 출력의 전반적인 감소를 특징으로합니다.1,3,4,9. 단백질 생산량을 줄이는 것은 공정의 높은 에너지 비용으로 인해 매우 중요하다고 생각됩니다.3,7. 선택적 억제 및 업 규제를 용이하게 하기 위해 다양한 복잡한 규제 메커니즘에 의해 번역 응답이 제공됩니다. 규정은 번역의 모든 단계에 걸쳐 가해질 수 있습니다: 개시, 신장, 폴리펩티드 생합성 의 종결 및 리보소말 재활용10,11,12,13개시 단계에서 가장 강하게 전시되고 있으나5,7,9,10,13. 개시 시, 진핵 개시 인자(eIF)의 도움을 받는 작은 리보소말 하위 유닛(SSU)은 시작 코돈이 인식될 때까지 mRNA의 5'번역되지 않은 영역(UTR)에 결합하고 스캔합니다.2,5,6,8,11,12,13. 규제 메커니즘은 종종 부착, 스캔 및 코돈 인식에 영향을 미치는 eI를 대상으로 합니다. 예를 들어, 개시 인자 eIF2, 개시자 Met-tRNA의 모집에 도움이 되는 필수 번역 요소iMet SSU에, 종종 스트레스 조건하에서 진핵생물을 대상으로4,6,11. 효모에서, 이 요인의 인산화는 영양 박탈과 삼투압 스트레스하에서 유도될 수 있습니다1,4,11,14,15및 포유류 세포에서 아미노산 기아, 내피 망막 (ER) 스트레스, UV 스트레스, 바이러스 감염 및 변경 된 산소 수준에서이 반응을 유발할 수 있습니다.8,9,11. 특정 mRNA 번역의 급속한 강화 조절은 저산소증에 대한 포유류 세포 반응에서 분명하게 드러나며, 이는 저산소유도인자(HIFs) 생합성의 글로벌 신속한 번역 억제 및 선택적 업 조절을 나타낸다. HIF는 전사 요인이며, DNA 전사 수준에서 장기 세포 재프로그래밍을 유도합니다.8,9,16. 열 응력 하에서 효모에서 유사한 반응이 관찰되었으며, 열 충격 단백질(HSP)의 빠른 번역 발현과 지연된 전사 수준 반응이 뒤따릅니다.17,18. 영양 부족과 열 쇼크 외에도 효모의 번역 반응은 다양한 산소하에서 연구되었습니다.8,19, 명도5인산염, 황20,21 및 질소22,23 수준. 이 연구는 효모의 산업 사용에 대 한 광범위 한 의미를 가지고, 베이킹 및 발효 등24,25. 번역 반응은 또한 산화 스트레스 같이 세포내 응력이 특징인 신경 퇴행성 질환 및 심장 병과 같은 질병의 이해를 증진시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 전반적으로, 번역 반응은 유전자 발현 통제에 필수적이고 진핵 생물에 있는 긴장 조건의 넓은 범위에 급속한 적응을 촉진합니다.
번역 응답을 공부하려면 번역 환경의 최소 왜곡된 스냅숏을 제공하는 방법이 필요합니다. 다각성 프로파일링은 mRNA를 통한 번역 연구에 사용되는 고전적인 접근법으로, 자당 그라데이션(26,27)을통해 극심분리를 통해 mRNA의 폴리(ribo) 소량 분획을 분리하는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 개별 mRNA(역전사 및 폴리머라제 연쇄 반응, RT-PCR26)와같은 검출 방법 또는 전 세계적으로 고처리량 기술(마이크로어레이 또는 RNA-seq28,29)에대한 번역 수준을 탐구하는 데 사용될 수 있다. 보다 진화된 접근법은 리보솜 프로파일링으로, 게놈 전체 척도에서 mRNA 분자를 따라 리보솜을 길쭉하게 하는 위치뿐만 아니라, 주요 및 대체 시작 부위의 전사 및 활용을 통한 번역 효율의 추론을 가능하게 한다30,31. 리보솜 프로파일링은 리보솜 존재에 의해 보호되는 mRNA 단편의 격리 및 시퀀싱을 포함한다. 리보솜 프로파일링은 저산소 스트레스, 열 충격 및 산화응력 31, 32를포함한 여러 조건에 걸쳐 번역 역학에 대한 상당한 통찰력을제공했습니다. 이 기술은 효모 및 포유류 세포를 포함한 다중 소스 물질 유형에 적응되었습니다.
다각형 및 리보솜 프로파일링은 번역 연구의 기능을 확장하는 데 기본적이었지만, 번역 과정에는 이러한 방법으로 캡처하기 어려운 다양한 번역 중간체 및 복합체가포함됩니다(11,13). 번역 복합체가 특정 번역 억제제(항생제)를 첨가하여 생체내에서 안정화되기 때문에, 특정 리보솜 분포 유물로 이어지는, 또는 세포 용해시(항생제) 또는 특이하지 않은(높은 염또는 마그네슘 이온)의 박탈로 이어지는 빠른 반응 유형을 연구할 수 있는 능력의 부족에서 비롯된 추가적인 제한, 33중년의 부족또는 덜 안정된33중년의박탈로 이어지는 34,35.
포름알데히드는 크로마티신 면역 침전(ChIP) 및 교차 연결 면역 침전(CLIP) 연구와 같은 핵산 및 단백질을 교차 연결하는 데 널리 사용된다. 그것의 작은 크기와 우수한 세포 투과성을 허용 하는 빠른 생체 내 작용(36). 신속한 포름알데히드 교차연결을 기반으로, 리보솜 프로파일 시퀀싱(TCP-seq)10,36,37,38,39,40으로리보솜 프로파일링 접근법이 확장되었다. 효모에서 처음 개발된 TCP-seq는 스캐닝 또는 종료 후 SSU 단지 및 다중 리보소말구성(37,38,41,42)을포함한 모든 번역 중간체를 캡처할 수 있습니다. 이 방법은번역억제제와포름알데히드 크로스링크의 조합접근법을 사용하여 번역의 체포를 용이하게 하는 여러 연구에서 활용되고 있다. 기술의 추가 변형 버전인 선택적 TCP-seq39는최근 교차 형 복합체의 면역 정화를 포함하도록 채택되어 TCP-seq 응용 프로그램의 범위를 넓혀왔다. 포름알데히드 교차 링크의 신속하고 효율적이며 가역적 특성은 이러한 접근 방식을 일시적인 mRNA:번역 복잡한 상호 작용, 특히 매우 역동적인 번역 수준의 응답 경로의 맥락에서 연구하는 데 적합합니다.
여기서 우리는 포괄적 인 번역 복잡한 안정화 및 격리를 목적으로 생체 내 포름알데히드 교차 링크의 과정을 자세히 설명합니다. 효모 및 포유류 세포에 대해 미묘한 별도의 프로토콜을제공합니다(도 1). 면역블로팅(western-blotting), 면역 보조 정제(또는 '면역침전')를 이용한 공동 정제 단백질 인자 검출과 같은 크로스링크 안정화물질(도 1)의후속 사용에 대한 사례를 추가로 간략하게 설명합니다. IP) 및 관심의 특정 요인을 포함하는 번역 복합체의 농축, 전자 현미경 검사및 RNA 시퀀싱.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg"> 그림 1: 일반적인 실험 설정에 대한 개요를 설명하는 회로도. 번역 복합체의 생체 내 포름알데히드 안정화의 주요 단계는 필요한 주요 계측에 대한 정보로 보완되는 순서도로 묘사됩니다. 교차 링크 된 물질의 잠재적다운 스트림 응용 프로그램은 성공적으로 사용되었지만 RNA의 SPRI 비드 정제, RNA 염기서열 분석 및 질량 분석과 같은이 프로토콜에서 직접 다루지 않은 예를 포함하여 설명됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>효모 추출물</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>70178</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose (Dextrose)</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>49139</td><td></td></tr><tr><td>아데닌 황산염</td><td>Amresco</td><td>0607-50G</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>F11635-500ML</td><td>ACS 시약, 37&nbsp;wt. H2O의 %는 안정제로 10-15% 메탄올 함유(중합 방지를 위해)</td></tr><tr><td>RNaseOUT&trade; 재조합 리보뉴클레아제 억제제</td><td>Invitrogen&trade; byThermo Fischer Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&trade;, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 용액</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 용액</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>야망&trade; RNase I, 복제, 100 U/&마이크로; L</td><td>Ambion</td><td>AM2294</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&bull; 인&트레이드; RNase 억제제(20 U/&mu; Thermo</td> Fisher Scientific <td>AM2694</td><td></td>에 의한 L)<td>Invitrogen&trade;</td></tr><tr><td>산성 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올 125:24:1 (pH 4.0-5.0)</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>P1944-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&trade; 염소 안티-마우스 IgG</td><td>Invitrogen&trade; by Thermo Fisher Scientific)</td><td>11033</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate (3 M), pH 5.5</td><td>Invitrogen&trade; by Thermo Fisher Scientific)</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen (5 mg/ml)</td><td>Invitrogen&trade; by Thermo Fisher Scientific)</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올, Pure</td><td>Merck; 시그마 알드리치</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>아머샴&trade; &nbsp; 하이본드&reg; P 웨스턴 블로팅 막, PVDF</td><td>Merck</td><td>GE10600023</td><td>PVDF 멤브레인 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>Bolt&trade; 4에서 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel</td><td>Invitrogen&trade; by ThermoFischer Sientific</td><td>NW04120BOX</td><td>Protein gel</td></tr><tr><td>4X Bolt&trade; LDS 샘플 버퍼</td><td>Invitrogen&trade; by ThermoFischer Sientific</td><td>B0007</td><td>&nbsp; LDS 샘플 로딩 버퍼</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein&trade; 만화경&트레이드; Prestained Protein Standards</td><td>BioRad</td><td>1610375</td><td>단백질 사다리</td></tr><tr><td>20X Bolt&trade; MES SDS Running Buffer</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>B0002</td><td>PAGE runninjg 버퍼</td></tr><tr><td>Intercept&reg; (PBS) 차단 버퍼</td><td>LI-COR</td><td>927-70001</td><td>Odyssey Blcoking 버퍼 (PBS)</td></tr><tr><td>IRDye&reg; 800CW 염소 안티-마우스 IgG 보조 항체</td><td>LI-COR</td><td>92632210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye&reg; 800CW 염소 안티-래빗 IgG 보조 항체</td><td>LI-COR</td><td>92632211</td><td></td></tr><tr><td>TAP 태그 다클론 항체</td><td>Invitrogen&trade; by ThermoFischer Sientific</td><td>CAB1001</td><td></td></tr><tr><td>항베타 액틴 항체</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>84097</td><td>BioUltra, 분자생물학, &ge; 99.5 % (HPLC)</td></tr> <tr><td>DL- 디티 오 트레이톨 용액</td> <td>(Merck / Sigma-Aldrich)</td> <td>43816</td><td>BioUltra, 분자 생물학 용, H 2 O</td></tr><tr><td>테루모 주사기 1CC / mL</td><td>테루 모 주사기</td><td>878499</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>(Merck / Sigma-Aldrich)</td> <td>60128</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td> <td>(Merck / Sigma-Aldrich)</td> <td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>트리스 하이드로 클로라이드</td><td>Merck / Sigma-Aldrich</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>도데 실황산</td><td>나트륨 Merck / Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Merck / Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 분쇄 용기</td><td>Retsch</td><td>02.462.0059</td><td></td></tr><tr><td>MM400 믹서 밀</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td></td></tr><tr><td>그래디언트 분획기</td><td>Brandel</td><td>BRN-BR-188</td><td></td></tr><tr><td>써모믹서 R</td><td>Eppendorf</td><td>Z605271</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브(잠금 장치 포함</td>) <td>Eppendorf Safe-Lock</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>미니 겔 탱크</td><td>(Thermo Fisher Scientific)</td><td>A25977</td><td>PAGE 러닝 탱크</td></tr><tr><td>5 mL, 개방형 Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>13.2 mL, 인증된 무료 개방형 Thinwall 폴리프로필렌, 14 x 89mm - 50Pk</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 한외여과 장치</td><td>Merck</td><td>UFC5030</td><td>Ultracel-30 재생 셀룰로오스 멤브레인, 0.5mL 시료 부피</td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge</td><td>Cambridge Scientific</td><td>15566</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-90K</td><td>GMI</td><td>8043-30-1191</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 175cm2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 혈청학 피펫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL1250</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학 피펫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL1100</td><td></td></tr><tr><td>DNA 로빈드 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>저온 원심분리기 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>for 50 mL tubes</td></tr><tr><td>Orbital Shaking Incubator</td><td>Ratek</td><td>OM11</td><td></td></tr><tr><td>Frezco 17 마이크로 원심분리기</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf DNA 로-바인드 튜브</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&reg; 단백질 LoBind 튜브</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108116</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti 스윙 버킷 로터</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 150i CO2 인큐베이터, 150L</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>0,3 mL 초미세 II 짧은 인슐린 주사기</td><td>BD Medical</td><td>328822</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lok 팁이 있는 3 mL 주사기</td><td>BD Medical</td><td></td><td></td>302113</tr><tr><td>25G×16mm 피하 주사 바늘</td><td>테루모</td><td>TUAN2516R1</td><td></td></tr></tbody></table>

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

메신저 (m)RNA의 빠른 재배포 및 mRNA 번역의 변경을 포함하는 급속한 반응은 세포의 지속적인 동종 성 조정에 관련됩니다. 이러한 조정은 변동하는 영양소 및 염도 수준, 온도 및 다양한 화학 및 방사선 응력 중에 진핵 세포 생존가능성과 '손상 제어'에 매우 중요합니다. RNA 수준의 반응의 매우 역동적인 특성과 많은 RNA:RNA 및 RNA:단백질 중간체의 불안정성으로 인해 세포질 RNA 상태의 의미 있는 스냅샷을 얻는 것은 제한된 수의 방법으로만 가능하다. 전사 전체, RNA-seq 기반 리보솜 프로파일링 형 실험은 번역 제어를 위한 가장 유익한 데이터 소스 중 하나입니다. 그러나, 균일한 RNA및 RNA:단백질 중간 안정화의 부재는 특히 빠르게 진행되는 세포 반응 통로에서 다른 편견으로 이끌어 낼 수 있습니다. 이 문서에서는 RNA 및 RNA:단백질 중간 안정화를 돕기 위해 서로 다른 투과성의 진핵 세포에 적용되는 신속한 고정의 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 리보소말 및 폴리 (ribo) somal 분획을 가진 그들의 공동 침전에 기초한 안정된 RNA:단백질 복합체의 격리의 예를 제공합니다. 분리된 안정화 된 물질은 번역 복합 프로파일 시퀀싱 (TCP-seq) 접근 방식 및 그 유도체와 같은 리보솜 프로파일링 유형 실험의 일부로 나중에 사용할 수 있습니다. TCP-seq 스타일의 방법의 다목적성은 이제 다양한 유기체 및 세포 유형의 응용 프로그램에 의해 입증되었다. 안정화된 복합체는 또한 다른 폴리(ribo) somal 분획으로 분리되고 크로스링크 반전의 용이성 으로 인해 RNA 시퀀싱을 실시하는 전자 현미경 을 사용하여 추가적으로 친화및 이미지화될 수 있다. 따라서, 스냅 냉각 및 포름알데히드 고정에 기초한 방법은, 퇴적계 기반 또는 다른 유형의 RNA:단백질 복합 농축에 선행되고, 살아있는 세포에서 급속한 RNA:단백질 복합역학의 미세한 세부사항을 조사하는 데 특히 관심이 있을 수 있다.

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

워크플로우는 엄격하게 통제된 환경 조건에서 세포를 성장시키고, 용해/얼음을 사용하여 빠르게 냉각하고, 포름알데히드와 잠복시간의 미리 최적화된 농도로 고정하는 것으로 구성됩니다. 고정 반응은 글리신 또는 트립스와 같은 1 차적인 아미노산 군 함유 화합물의 과잉을 사용하여 담금질됩니다. 세포는 수집, 세척 및 냉동 저장 될 수있다.고정 된 세포는 기계적 또는 화학적으로 용해 될 수 있으며, 용액은 분자 크기, 퇴적 물 특성 또는 친화성 마커에 따라 리보소말 분획의 분리에 사용됩니다. 이 접근법은 면역 보조 정제 및 검출, 전자 현미경 검사법의 특정 인자를 포함하는 복합체의 농축을 위해 사용할 수 있는 다목적 물질을 초래합니다. 교차 연결 된 깊은 차단, RNA 증폭 또는 혼성화 기반 분석, RNA 염기서열 분석 및 질량 분석 가능 해집니다.600 나노미터에서 0.05 광밀도를 사용하지 않는 시궤도 셰이커에 1리터 효모 배양을 설정하고 30°C에서 펩톤및 덱스트로스 미디어를 사용합니다. 섭씨 4도에서 효모 세포의 액체 현탁액을 5000 G에서 펠렛을 위한 호환 가능한 로터 및 원심분리기 병과 미리 접전된 원심분리기를 설치합니다. 성장하는 셀의 광학 밀도기록을 보관하십시오.기하급수적 성장 단계가 관심 있는 경우 수집 시 0.6~0.8나노미터와 600나노미터 사이여야 한다. 세포가 준비되면 250 그램의 깨끗한 분쇄 된 물 얼음이 들어있는 베이커가있는 화학 연기 후드 내부에 아이스 박스를 설치하고 25 밀리리터 트립신과 갓 구입한 메탄올이 후드 내부에 37 % 포름알데히드 솔루션을 안정화시켰습니다. 얼음이 들어 있는 제빵사에 최신 세포 배양을 붓습니다.그런 다음 얼음이 녹을 때까지 혼합물을 강렬하게 저어 볼륨보다 2.2 %의 무게의 최종 농도에 37 %의 포름알데히드의 75 밀리리터를 추가합니다. 얼음이 녹으면 10분 동안 타이머를 설정하고, 미리 냉각된 원심분리기 병으로 배양을 옮기고 세포를 원심분리로 5분 동안 원심분리하여 전달합니다. 스핀이 있는 동안, 50 밀리리터 튜브를 미리 식히고 얼음에 남아있는 포름알데히드를 중화하기 위해 글리신을 함유하는 갓 준비된 버퍼 A를 유지합니다.원심분리 후 원심분리관을 얼음 위에 놓고 펠릿 쪽을 얼음과 접촉합니다. 튜브를 연기 후드에 넣고 상체를 포름알데히드 폐기물 용기에 넣습니다. 25 밀리리터 스트리펫을 사용하여 버퍼 A의 20 밀리리터에서 오래된 튜브에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 50 밀리리터 튜브로 이송합니다.버퍼 A로 40 밀리리터로 부피를 구성하고 섭씨 4도, 5000 G의 원심분리로 세척 세포를 5분 동안 수집합니다. 상체를 버리고 40 밀리리터 버퍼 A에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하며, 이는 글리신 오염을 제거하기 위해 글리신을 함유하지 않는 버퍼 A입니다. 펠릿은 섭씨 4도, 5000 G 5분에서 원심분리로 세포를 다시 합니다.버퍼 A로 한 번 더 세서히를 반복합니다. 상체를 버리고 세포 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 펠릿으로 튜브의 무게를 측정하고, 젖은 세포 질량은 세포 배양의 1 리터 당 약 1 그램이어야한다.액체 질소가 있는 알루미늄 호일로 늘어선 상자에서 약 3cm 깊이까지 폴리스티렌을 채웁니다. 상자에 50 밀리리터 튜브를 똑바로 세워 놓습니다. 10초 동안 피펫팅 및 소용돌이를 통해 버퍼 A 2의 550 마이크로리터에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.마이크로리터 RNase 억제제당 40단위의 마이크로리터 10대를 10초 동안 다시 첨가합니다. 1 밀리리터 파이펫을 사용하여, 액체 질소를 포함하는 50 밀리리터 2에 세포 현탁액을 드립. 다음 단계를 준비하기 위해 드라이 아이스에 1.5 밀리리터 핵 프리 튜브와 10 밀리리터 스테인레스 스틸 연삭 항아리를 미리 식힙니다.냉동 셀 서스펜션 액적을 깨끗한 멸균 주걱을 사용하여 항아리에 옮기습니다. 연삭 항아리를 액체 질소에 1분 동안 담그고 액체 상이 접합부 위에 유지되도록 합니다. 27 Hertz에 Cryo 믹싱 밀을 설치하여 1분 동안 교반합니다.믹서 밀에서 1 분 동안 27 Hertz에서 밀봉 된 연삭 항아리를 교반하십시오. 항아리를 액체 질소로 다시 냉각시키고 1 분 더 흔들어 주세요. 항아리를 1.5 밀리리터 핵 프리 튜브와 함께 드라이 아이스가 들어 있는 얼음 상자로 옮길 수 있습니다.작은 강철 주걱을 사용하여 패딩 된 갈기 날짜를 튜브로 옮기. 그런 다음 튜브를 영하 80도에 보관하십시오. 두 개의 T175 플라스크에서 HEK 293 세포를 60~70%의 결합으로, 달베코의 수정된 이글 배지와 10%의 태아 소 세럼이 37도, 이산화탄소 5%로 증가한다.원하는 고정 시간 최소 3시간 전에 T175 플라스크의 미디어를 30밀리리터의 사전 따뜻하게 된 전체 미디어로 교체하십시오. 분쇄 된 물 얼음으로 가장자리에 아이스 박스를 준비하고 필요한 버퍼, 또한 얼음과 함께 연기 후드에 보관하십시오. 세포를 식히려면 인큐베이터에서 T175 플라스크를 제거하고 얼음에 대해 공식적으로 눌러 최대 표면 접촉을 보장합니다.화학 연기 후드 안에는 플라스크를 옆으로 기울여 미디어가 세포 반대쪽쪽에서 수집되도록 합니다. 피펫 168 마이크로리터37%의 마이크로리터는 볼륨 포름알데히드에 의해 풀이 된 매체로 직접 계량됩니다. 최종 농도0.2%의 포름알데히드.즉시 섞습니다. 플라스크를 얼음에 10분 더 배양합니다. 세포 반대의 플라스크 측면을 통해 적절한 폐기물 용기에 미디어를 부어 넣습니다.칼슘과 마그네슘 이온없이 달베코의 인산염 완충식식염 30 밀리리터에 파이펫을 사용하고 또한 세포 반대쪽에 부드럽게 50 밀리몰러 글리신을 함유하고 있습니다. 플라스크를 흔들어 섞고 플래시를 수평 위치로 되돌리고 얼음에 10 분 더 배양하십시오. 셀 맞은편 플라스크 측을 통해 용액을 붓고 표준 0.25%의 트립신 EDTA 용액 7밀리리터를 부드럽게 추가하여 세포를 분리하고 다시 중단합니다.실온에서 플라스크를 최대 10분 동안 5분간 배양합니다. 플라스크를 수직으로 찾고 스트리프를 사용하여 플라스크 벽에서 남은 것을 부드럽게 세척하여 분리 된 세포를 수집하고 서스펜션을 얼음에 세팅 된 50 밀리리터 튜브로 옮습니다. 수집된 서스펜션 용액을 20밀리리터의 완전한 미디어로 즉시 보완하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞습니다.5 분 4 섭씨 동안 100 G에서 튜브를 원심 분리하여 세포를 펠렛. 셀 펠릿은 명확하게 표시되어야 합니다. 미디어를 부어 부드럽게 글리신없이 달베코의 인산염 완충 식염수의 10 밀리리터에 펠릿을 다시 중단합니다.원심분리기는 5분간 100G로 튜브를 다시 100G로 붓고 4도에서 세척 버퍼를 부어 글리신없이 감산염을 완충한 800 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하지만 마그네슘과 칼슘 이온을 함유하고 있습니다. 다시 중단된 세포를 새로운 저단백질 결합 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 전달합니다. 100G에서 튜브를 섭씨 4도에서 3분간 원심분리합니다.1 밀리리터 파이퍼를 사용하여 상체를 조심스럽게 폐기하십시오. 이 단계에서, 세포 펠릿은 영하 80도에서 동결되거나 세포 리시스 단계로 진행할 수 있다. 생물 안전 캐비닛에서 비 이온, 비 데니징 세제 및 아르지나제 억제제 7마이크로리터를 기반으로 300 마이크로리터의 용해 완충제와 1 밀리리터 팁을 사용하여 파이펫팅하여 잘 섞는다.조심스럽게 1 ~ 3 밀리리터 주사기에 25 게이지 바늘을 부착하고 격렬하게 적어도 일곱 느린 위쪽 섭취량과 빠른 하향 배기 스트로크를 사용하여 혼합물을 파이펫. 주사기와 바늘을 날카로운 쓰레기통에 버리고 31 게이지 바늘과 0.3 밀리리터 주사기로 절차를 반복하십시오. 주사기와 바늘을 날카로운 쓰레기통에 버리십시오.12, 000 G에서 튜브를 4도에서 5분간 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 새로운 저단백질 결합 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 상피체를 전달합니다. 셀 파편을 모두 저장하고 섭씨 영하 80도에 lysate.번역 복합체는 버퍼의 이온 조성에 민감합니다. 염화 마그네슘의 생략과 EDTA 첨가물은 높은 침전 특성을 제거했으며, 염화칼슘이 더 나은 결과 피크를 초래하는 동안 개선은 미미했습니다. 따라서 버퍼 하나를 선택했습니다.2.2%중량의 포름알데히드는 폴리좀을 잘 보존하고, 포름알데히드의 4%중량에 비해 전체 수율을 감소시키지 않았다. 포유류 세포에서, 부피에 의해 0.2%의 무게의 포름알데히드의 훨씬 낮은 농도가 사용되었다. 높은 농도로 상당한 다각형 물질 손실 귀착되었다.15 밀리머 EDTA는 용액에 첨가되고 모든 후속 버퍼는 고정 된 세포에서 파생 된 다각체 분획에 특유하게 적은 불안정 효과를 나타냈다. 그리고 이 효과는 부분적으로 4%의 고정 된 세포에서 재료로 50 밀리마일러 EDTA로 복제되었으며, 저항하고 더 잘 전개되었습니다. 포도당 고갈은 효모에 가장 극적이고 빠른 번역 억제 효과 중 하나를 유도합니다.신경 추가 및 국소 원인 조건 유도 다각형 분해 약간 했다, 하지만 분명히 더 많은 폴리좀 낮은 추가 포도 당에서 유지. 중요한 것은, 고정 된 세포에서 다각체 물질은 동적 번역 과정의 차이를 보존하기 위해 포름알데히드 고정의 적합성을 나타내는 굶주린 세포와 비 굶주린 세포 사이의 높은 구별을 보여줍니다. tacy paysake와 같은 접근법에서, 우리가 2 단계 초원심을 고용한 완전한 뿌리 줄기와 잘 정착하지 않는 작은 리보솜 서브 유닛을 제거하는 데 추가적으로 통찰력이 있을 수 있으며, SSU, LSU, RS, RNase 내성 다이아송, DS 및 고차형 다묘의 격리를 허용하여 고정 된 마이크로카피법에 의해 확인됩니다.고정되지 않은 세포에 비해, 고정 된 세포에서 물질은 가장 빠른 침전 리보소말 분획에서 음순 eIF4A의 높은 존재를 입증했다. eIF4A 타피 스트레인의 고정 물질을 사용하여 자기 IDG 구슬이 함유된 eIF4A의 복합체를 포획하고 농축한 경우, SSU 및 RS의 베타 액틴에 비해 eIF4A의 선택적 농축을 관찰할 수 있었지만, RNase 1번의 분해시 두 번째 그라데이션에서 LSU 분획은 관찰할 수 없었습니다. 다른 번역 휴식 방법에 비해 세포막 전반에 걸친 포름알데히드 작용의 신속성과 교차 링크의 무차별적 특성은 번역 복합 중간체의 최대 다양성보존을 약속합니다.우리의 연구 결과는 환경 변화 또는 응력 조건에 급속한 세포 반응의 시나리오에서 매우 일시적인 복합체 및 증거의 유용성을 안정화하기 위하여 급속한 포름알데히드 고정의 유용성을 일치합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

mRNA의 translational 일시 사이트를 식별하는 기술은 설명되어 있습니다. 이 절차는 denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 초기 체인의 크기를 분석하여 다음 타겟 mRNA의 체외 번역의 도중에 변이를 축적 초기 polypeptides의 분리에 근거한다.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

이 프로토콜은 생체 CNS 샘플의 translatome을 연구하기 위해 polyribosome 분별의 필수 수정 사항을 보여줍니다. 그것은 분리와 결합 RNA의 분수를 리보솜에 총 RNA의 비교를 통해 번역 및 전사 조절의 종합 평가를 할 수 있습니다.

Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

다 성분 단백질 복합체가 세포 기능 및 개발 과정에서 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 생체 가교 후의 구조 기능 분석을위한 가교 착물 정제하여 이후 초파리 배아로부터 네이티브 단백질 복합체를 분리하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

생체</em에서 단백질 복합체를 분리> 가교 접근 초파리 태아

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

우리는 RNA 정화와 결합된 리보솜에 있는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 EC 특정 유전 꼬리표를 통해 마우스 두뇌, 폐 및 심혼 조직에서 직접 혈관 내피 세포 (Ec)에서 리보솜 결합mRNA를 정화하는 접근을 제시합니다 .

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 장기와 조직의 최소한의 처리로 개발 프로그램을 해부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표적화된 세포로부터 고품질의 RNA를 산출합니다. qRT-PCR 또는 RNA-seq와 같은 다운스트림 분석 도구는 조직 및 세포 유형별 발현 프로파일을 밝힙습니다.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

배우세요 진핵 세포에서 포름알데히드 교차결합을 이용해 번역 단지를 신속하게 고정하고 격리하는 방법을. 이 기술은 효모와 포유류 세포에서 RNA:단백질 상호작용을 분석하는 데 활용됩니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

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