시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

호스트 관련되는 세균은 실제로 이해될 화상 진찰을 요구하는 이 아주 복잡한 생태계를 구성합니다. 그리고이 입자를 통해 염색 과정을 통해 호스트 미생물군유전체 인터페이스의 시각화를 달성하는 방법을 보여 드리겠습니다. 호스트 관련 박테리아의 생물학을 이해하려면 마이크로 환경 내에서 현지화에 대한 이해가 필요합니다.

그리고이 기술은 우리가 호스트 환경 내에서 뿐만 아니라 다른 박테리아의 맥락 내에서 개별 taxa를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술을 통해 숙주 조직을 통해 침투했을 수 있는 박테리아를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 숙주 점액과 같은 주요 특징이 고갈될 수 있는지 여부를 결정할 수 있을 것입니다. 60%의 절대 메탄올, 30% 클로로폼, 10%의 빙하 아세트산이 있는 양립용기에 신선한 메타칸을 준비합니다.

날카롭고 깨끗한 도구를 사용하여 마우스에서 장 세그먼트를 잘라 화상 진찰을 합니다. 가능한 한 샘플을 방해최소화하고 이미징 영역에 영향을 주지 않도록 능선으로 섹션을 처리합니다. 분해를 방지하기 위해 해부 후 가능한 한 빨리 샘플을 수정합니다.

핀셋으로 조직의 가장자리를 섬세하게 잡고 조직학 카세트에 장 섹션을 배치합니다. 카세트를 닫고 완전히 신선한 메타칸 솔루션에 담그어 카세트가 침수시 면 몇 시간 이상 되지 않도록 하십시오. 연기 후드에 접근하지 않고 임상 스위트에서 수집될 임상 샘플의 경우, 연골 카세트의 통과를 허용하는 뚜껑으로 플랩이 자른 폴리에틸렌 저장 용기를 사용하십시오.

독성 연기의 이스케이프를 방지하기 위해 샘플을 통과하지 않을 때이 플랩이 닫혀 테이프. 파라핀을 내열 용기에 넣고 하룻밤 사이에 오븐에서 녹입니다. 적절한 폐기물 리셉터클에 액체를 붓고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 절대 메탄올, 절대 에탄올 및 자일렌으로 순차적으로 배양하여 조직을 세척한다.

이중 장갑이나 핀셋을 사용하여 조직 세그먼트를 잃지 않고 파라핀이 입력 할 수 있도록 카세트를 약간 엽니 다. 녹은 파라핀 용기에 카세트를 잠수하고 닫습니다. 용기를 섭씨 60도 오븐에 다시 넣고 카세트가 파라핀으로 채워지고 큰 기포가 남아 있지 않도록 합니다.

2 시간 동안 인큐베이션 후 오븐에서 용기를 제거합니다. 집게를 사용하여 카세트를 조심스럽게 제거하십시오. 오븐을 섭씨 60도로 가열하고 코플린 항아리를 예열합니다.

유리 병에 충분한 양의 자일렌을 추가하여 항아리에 유리 슬라이드를 두 번 덮고 바삭이렌의 증발을 방지하기 위해 뚜껑 주위에 파라필름을 배치합니다. xylenes의 온도가 섭씨 60도에 도달하도록 허용합니다. 텍스트 원고에 언급된 대로 FISH 혼성화 솔루션을 준비합니다.

코플린 항아리에 슬라이드를 배치하여 섹션이 다른 슬라이드 나 항아리와 접촉하지 않았는지 확인하여 슬라이드를 섭씨 60도에서 10 분 동안 굽습니다. 연기 후드에서 코플린 항아리를 오븐에서 예열된 자일렌으로 채우고, 샘플 위에 직접 붓지 않고 조직을 빠져나가지 않도록 주의하십시오. 코플린 항아리를 60도 오븐에 다시 놓습니다.

사용 된 자일렌을 적절한 폐기물 용기에 붓고 유리 슬라이드의 조직 섹션을 방해하지 않도록주의하고 슬라이드가 코플린 항아리에서 떨어지는 것을 막기 위해 집게 쌍을 사용하십시오. 코플린 항아리에 남은 자일렌을 보충하고 연기 후드의 실온에서 10분 동안 배양합니다. 실온에서 5분 동안 99.5%의 에탄올로 섹션을 배양합니다.

인큐베이션 후 코플린 항아리에서 슬라이드를 제거합니다. 실험실 닦아 또는 종이 타월에 슬라이드의 뒷면을 닦아 에탄올 방울이 사라질 때까지 잠시 공기 건조. 액체 차단제 또는 PAP 펜을 사용하여 각 조직 섹션 주위에 매우 가까운 원을 만들어 혼성화 용액에 의해 커버되는 데 필요한 확장 영역을 제한하여 섹션과의 잉크 접촉을 피하십시오.

혼성화 솔루션을 준비하고 사용되는 솔루션의 50마이크로리터당 0.5마이크로그램의 프로브를 추가합니다. 슬라이드의 섹션에 솔루션을 피펫합니다. 유연한 플라스틱 커버립으로 섹션을 오버레이하여 사용된 액체의 부피가 전체 섹션을 덮도록 합니다.

습도를 제공하기 위해 과도한 혼성화 솔루션 또는 PBS에 담근 물티슈 또는 종이 타월이있는 파이펫 팁 박스가있는 습한 챔버를 만듭니다. 증발을 줄이기 위해 설정된 프로브에 따라 적어도 3시간 동안 습한 챔버의 슬라이드를 45~50도에서 배양한다. 플라스틱 커버를 제거하고 50도에 미리 워밍 된 코플린 항아리에 FISH 세척 버퍼의 슬라이드를 배양하십시오.

코플린 항아리를 섭씨 50도 오븐에 10~20분간 다시 넣습니다. FISH 세척 버퍼를 제거하고 코플린 항아리에 PBS로 교체하십시오. 코플린 항아리를 PBS로 리필한 직후 PBS를 장식합니다.

병에서 슬라이드를 제거하고 전체 섹션 의 상단에 카운터 스테인을 피펫, 파이펫 팁으로 조직을 만지지 않도록하는 동안. 섭씨 45분 동안 배양하세요. 신선한 PBS로 얼룩을 3번 빠르게 씻으시다.

슬라이드 뒷면을 닦아내거나 종이 타월에 대고 대부분의 PBS가 파이펫 팁에 연결된 진공 선에 의해 보조된 섹션에서 증발하도록 합니다. 마운팅 매체를 사용하여 단면을 마운트합니다. 커버슬립가장자리를 따라 선명한 매니큐어로 페인팅하여 슬라이드에 커버립을 부착하여 슬라이드 가장자리에서 벗어나십시오.

실온에서 설정하십시오. 무리바쿨룸 장과 함께 식민지화된 마우스 모노콜로드의 단종과 무리바쿨룸 장과 박테로이드 테로이드테테오타미크로 한 쌍식민지의 이미지가 여기에 표시됩니다. 샘플은 Muribaculum 분리에 대한 특정 태그 3 개의 프라임 시아닌-3FISH 프로브로 염색되었으며 또한 로다민 바인딩 렉틴 UEA-1 및 DAPI와 함께 대응하였다.

시아닌-3 FISH, DAPI, 그리고 결합된 시아닌-3 FISH 및 DAPI 채널로 얼룩진 섹션의 이미지는 Muribaculum 장의 국소화를 보여줍니다. 모든 박테리아 모양 및 박테리아 크기의 DAPI 신호는 모노 식민지 상태에서 시아닌-3로 표시됩니다. 이중 식민지화 상태에서, 이러한 시아닌-3 및 DAPI 이중 양성 세포 이외에, 예상대로 시아닌-3 음의 DAPI 염색 세균세포가 있다.

더 긴 필라멘트 박테리아를 제외하고, 더 큰 DAPI 양성 구조는 숙주 세포에서 식물 물질 또는 핵입니다. 상피의 경도뿐만 아니라 상피의 경도및 얕은 단면 세그먼트를 제공하는 깊이에서 단면된 장 세그먼트는 지하실의 단면과 일정한 점액 층 이나 박테리아의 단면만 드러내는 얕은 단면이 장의 발광 조각을 제공하지 않는다는 것을 증명합니다. 고르지 않은 조직이나 커버슬립 커버리지는 흐릿하고 고르지 않게 조명된 타일 스캔을 초래합니다.

일반 배경과 높은 배경의 예도 여기에 표시됩니다. 우리가 microbiota에 관하여 더 많은 것을 배울 때, 시퀀싱과 같은 대량 분석이 실제로 다른 미생물 종 사이 무슨 일이 일어나는지 그리고 어떻게 함께 상호 작용하는지 결정하기위하여 충분하지 않다는 것을 정말 명백해집니다. 이를 위해서는 이미징이 필요합니다.

기술의 이 모형은 몇몇 정말 중요한 발견, 예를 들면, 규정식에서 섬유의 박탈이 마틴단에서 연구 결과와 같은 병원체에 의한 점액 층의 숱이 및 잠재적으로 감염을 일으키는 원인이 된다는 것을, 뿐만 아니라 삼투압 설사의 효력및 점액 층의 고갈이 실제로 호스트 와 microbiota 둘 다에 어떻게 영향을 미치는지 연구. 그리고 이들은 Sonnenberg 그룹뿐만 아니라 우리 그룹에 의해 수행 된 연구였다.