Name: 오픈 글로브 부상 및 치료 성능을 추적하기위한 전방 세그먼트 장기 문화 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 학습하세요 전방 세그먼트 장기 배양 플랫폼을 이용하여 오픈 글로브 안구 손상을 추적하고 치료제 효능을 평가하는 방법을. 이 기술은 동물 실험 없이 안과 손상 연구에 활용됩니다.

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이 자료는 임시 각막 수리 획득 프로그램 (미국 육군 의료 마테리엘 개발 기관)과의 기관 간 협정 (#19-1006-IM)을 통해 미국 국방부가 지원하는 작업을 기반으로합니다.

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저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다. 이 기사에서 표현된 견해는 저자의 견해이며 미 육군 보건부, 육군, 국방부 또는 미국 정부의 공식 정책이나 입장을 반영하지 않습니다.

방법론을 사용할 때 성공 가능성을 높이기 위해 강조해야 하는 ASOC OG 부상 플랫폼의 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 전방 세그먼트 해부 동안, 궤적 메쉬워크를 보존하는 것은 필수적이지만 올바르게 수행하는 것은 어렵습니다. TM이 중단되면 눈은 생리적 압력을 유지하지 않으며 실험용 자격 기준을 충족시키지 못합니다. 적절한 해부를 얻을 때까지 추가 무균 기술 과제를 도입하는 대신 먼저 정상적인 조건에서 해부 과정을 연습하는 것이 좋습니다. 둘째, ASOC 접시에 눈을 설정할 때, 유체가 누출되는 것을 방지할 만큼 단단하지만 ASOC 접시에 손상을 입히는 것을 방지할 수 있을 만큼 느슨합니다. 눈이 단단히 고정되지 않으면, 액체는 IOP의 거의 또는 전혀 결과로 비 생리적 수단을 통해 눈에서 누출됩니다. 그러나 눈을 아래로 잡고 있는 클램핑 링은 플라스틱이며 과도하게 조여지면 쉽게 깨질 수 있습니다. 반지 아래의 경구 조직이 처음 24 시간 동안 조직을 압축하고 풀어 주면서 2 일 동안 눈을 아래로 고정하는 것이 필수적입니다. ...

오픈 글로브 (OG) 부상은 치료하지 않거나 적어도 부상 후 안정화 될 때 시력의 영구적 인 손실을 초래할 수있습니다 1. 그러나 지연은 시골 지역이나 군사 시나리오의 전장과 같이 안과 개입에 대한 접근이 쉽게 제공되지 않는 외딴 지역에서 만연합니다. 치료가 쉽게 제공되지 않을 때, 현재의 치료 기준은 의료 개입이 가능할 때까지 단단한 방패로 눈을 보호하는 것입니다. 군의학에서는 현재 24시간까지 지연되지만, 향후2, 3,4의대기 대피가불가능한도시 환경에서 전투 작전에서 최대 72시간까지 증가할 것으로 예상됩니다. 이러한 지연은 안과 개입에 대한 액세스가제한된시골, 원격 민간 응용 프로그램에서 더 길 어질 수 있습니다5,6. 치료되지 않은 OG 부상은 눈의 방수 씰이 손상되기 때문에 안구 압력(IOP)의 감염 및 손실에 매우 취약하여7,8. IOP의 손실은 조직 생존에 영향을 미칠 수 있으며, 부상과 치료 사이의 지연이 너무 길면 시력을 회복할 가능성이 낮은 의료 개입이가능합니다 9.
안과 전문의가 도달할 때까지 OG 부상을 밀봉하기 위한 적용하기 쉬운 치료법의 개발을 가능하게 하기 위해 벤치탑 OG 부상 모델은 이전에10,11을개발하였다. 이 모델로, IOP는 압력 트랜스듀서에 의해 포착되는 동안 전체 돼지 눈에서 고속 부상이 발생했습니다. 그런 다음 치료법을 적용하여 OG 부상부위(12)를밀봉하는 능력을 평가할 수 있다. 그러나, 이 모형은 전체 돼지 눈을 사용하기 때문에, 환자가 특수 치료에 도달할 때까지 치료가 상해 부위를 안정시켜야 하는 가능한 72h 창에 걸쳐 장기적인 성능을 추적하는 방법 없이 즉각적인 치료 성능을 평가할 수 있다. 그 결과, 전방 세그먼트 장기 배양(ASOC) OG 부상 모델이 개발되어 장기 치료성능을추적하는 플랫폼으로서 이 프로토콜에 상세하였다.
ASOC는 각막과 같은 전방 세그먼트의 혈관 조직을 유지 관리하는 데 널리 사용되는 기술로, 다주 동안 에뉴클레션 후14,15,16,17. 전방 세그먼트는 생리적 유량에서 유체를 침전하고, ASOC 설정18,19동안 IOP 조절을 담당하는 조직인 궤적 메쉬워크 유출 영역을 보존함으로써 생리적 IOP 하에서 유지된다. ASOC 플랫폼은 조직을 생리적으로 유지하고, 공압 구동 장치를 사용하여 OG 손상을 유도하고, 치료를 적용하고, 부상 후 최소 72시간 동안 의 상해 안정화를 추적할 수있다 13.
여기서 프로토콜은 ASOC 플랫폼을 사용하기 위한 단계별 방법론을 제공합니다. 먼저 ASOC 플랫폼을 설정하고 제작하는 방법을 자세히 설명합니다. 다음으로, 프로토콜은 전방 세그먼트를 무균하시키고 궤적 메쉬워크를 유지하는 방법을 자세히 설명한 다음, 맞춤형 장기 배양 접시에 전방 세그먼트 조직을 설정하는 것입니다. 그런 다음, 오픈 글로브 부상을 만들고 부상 직후 치료 적용하는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 눈의 기능적, 기계적 및 생물학적 특성과 부상이 얼마나 잘 안정화되었는지 를 평가하는 이 방법과 함께 사용할 수 있는 특성화 매개변수에 대한 개요를 제공합니다. 전반적으로,이 모델은 오픈 글로브 부상을 안정화하고 치료하기위한 제품 개발을 가속화하고 부상 후 가난한 비전 예후를 개선하는 데 필요한 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>10-32 폴리카보네이트 스트레이트 플러그, 남성 나사가 달린 파이프 커넥터</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K431</td><td></td></tr><tr><td>10-32 소켓 캡 나사, &frac12; "</td><td>McMaster-Carr</td><td>92196A269</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 주사기</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Ball-End L key</td><td>McMaster-Carr</td><td>5020A25</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1696484</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; 인트라메딕&nbsp; PE 160 튜빙</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-12E</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>Puritan</td><td>25-8061WC</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 매체</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>세계 정밀 기기</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>거즈</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>고온 실리콘 O-링, 너비 2mm, ID 4mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>5233T47</td><td></td></tr><tr><td>대형 집게</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500365</td><td></td></tr><tr><td>대형 수술용 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>503261</td><td></td></tr><tr><td>중간 톱니 집게</td><td>세계 정밀 도구</td><td>501217</td><td></td></tr><tr><td>못 (펑크 물체)</td><td>McMaster-Carr</td><td>97808A503</td><td></td></tr><tr><td>나일론 주사기 필터</td><td>Fisher</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>페트리 디쉬 (100 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트, 3방향, 수컷이 있는 스톱콕&nbsp; 루어&nbsp; 잠금</td><td>Fisher</td><td>NC9593742</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 18 G&nbsp; 90도&nbsp; 각도 분배 바늘</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A81</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 18 G 스트레이트 &frac12; &#039;&rsquo; 분배 바늘</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A675</td><td></td></tr><tr><td>멸균 100 mL 비커와 뚜껑</td><td>VWR</td><td>15704-092</td><td></td></tr><tr><td>Vannas&nbsp; 가위</td><td>World Precision Instruments</td><td>WP5070</td><td></td></tr></tbody></table>

오픈 글로브 부상 및 치료 성능을 추적하기위한 전방 세그먼트 장기 문화 플랫폼

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

오픈 글로브 부상은 시각적 결과가 좋지 않아 시력이 영구적으로 상실되는 경우가 많습니다. 이것은 부분적으로 안과 배려가 쉽게 유효하지 않는 시골 환경 및 군사 약 응용에 있는 상해 그리고 의학 내정간섭 사이 연장된 지연 때문입니다. 치료되지 않은 부상은 눈이 방수 씰을 잃은 후 감염에 취약할 뿐만 아니라 안구 내 저혈압으로 인한 조직 생존 능력의 상실에 취약합니다. 일시적으로 오픈 글로브 부상을 밀봉하는 치료법은 제대로 발달되면 적절한 안과 치료가 가능해질 때까지 안구 압력을 복원하고 감염을 예방할 수 있습니다. 제품 개발을 용이하게하기 위해, 여기에 상세한 전방 세그먼트 장기 문화 오픈 글로브 부상 플랫폼의 사용으로 최소 72 h 부상 후 치료 성능을 추적할 수 있습니다. 돼지 전방 세그먼트 조직은 사용자 정의 된 장기 문화 접시에서 유지 및 생리 내 혈압에서 개최 할 수 있습니다. 펑크 부상은 군관련 부상 크기와 유사하게 직경 4.5mm의 부상 크기를 생성할 수 있는 공압 구동 시스템으로 생성될 수 있습니다. 안구 압력의 손실은 적절한 부상 유도 및 눈의 방수 씰의 손실을 확인하는 72 시간 후 부상에 대해 관찰 할 수있다. 치료 성능은 부상 유도 후 눈에 응용 프로그램에 의해 추적 한 다음 며칠 동안 안구 압력을 추적 할 수 있습니다. 또한, 전방 세그먼트 상해 모델은 투명성, 안구 역학, 각막 상피 건강 및 조직 생존 가능성을 평가하는 것과 같은 전방 분단 생리학을 기능적 및 생물학적으로 추적하는 널리 사용되는 방법에 적용가능하다. 전반적으로, 여기서 설명된 방법은 안과 치료가 쉽게 제공되지 않을 때 일시적으로 오픈 글로브 부상을 밀봉하기 위한 생물재료 치료제 를 개발하기 위한 필요한 다음 단계이다.

광학 일관성 단층 촬영 (OCT)을 통해 캡처 된 이미지는 성공적인 부상 유도가 어떻게 보이는지 설명하기 위해 OG 부상 눈을 위해 표시됩니다. 그림 3은 부상 직후와 72시간 후 AS 조직을 부상시키고 OG가 부상한 후 제어 및 OG 부상에 대한 이미지를 보여줍니다. 두 개의 뷰가 표시됩니다: 부상 부위를 통과하는 단면 이미지와 이미지의 표면적을 시각화하기 위해 하향식 최대 강도 투영(MIP)이 표시됩니다. 제어 눈은 각막에 눈에 띄는 혼란을 보여주지, 명확한 부상은 OG 부상 후 전체 각막을 교차 위치 할 수있는 동안. MIP에서 부상은 모양과 크기가 불규칙하다는 것이 분명하지만 부상 크기는 72 h 이상 감소합니다. 이전에는 이 효과가테스트된여러 부상 크기에 대해 중요한 것으로 나타났습니다.
이 프로토콜에 설명된 OG 부상 모델의 기본 데이터 출력은 실험 설정 과정에서 내혈관 압...

오픈 글로브 눈 부상은 시골 또는 군사 관련 시나리오에서 며칠 동안 치료되지 않을 수 있으며, 그 결과 실명이 발생할 수 있습니다. 시력 상실을 최소화하기 위해 치료법이 필요합니다. 여기서, 우리는 장기 문화 오픈 글로브 부상 모델을 자세히 설명합니다. 이 모형을 사용하면 이러한 부상을 안정화하기위한 잠재적 인 치료법을 적절하게 평가 할 수 있습니다.

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...

오픈 글로브 부상은 치료왼쪽경우 시력의 영구적 인 손실로 이어질 수 있습니다. 이 전방 세그먼트 기관 배양 모형은 동물 실험을 위한 필요 내의 이 상해의 평가를 허용합니다. 이 프로토콜은 오픈 글로브 부상, 치료 치료, 장기 배양 플랫폼을 사용하여 3 일 이상 부상을 안정화 할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 닥터 보이스 연구소의 연구 기술자인 트렌트 피어슨(Trent Pearson)이 될 것입니다. 시작하려면, 외과 커튼과 총 해부에 필요한 악기를 놓는다. 해부 현미경에 눈을 시각화하기위한 바이오 안전 캐비닛을 설정합니다.접시 조립을위한 바이오 안전 캐비닛을 설정합니다. 바이오 안전 캐비닛 내부에 오픈 글로브 부상 유도 작업 공간을 설정합니다. 펑크 플랫폼 앞에 있는 실험실 잭에 크로스 트래킹 바이스를 배치합니다.여분의 궤도 조직을 제거하고 항생제 항mycotic PBS로 눈을 씻은 후, 눈을 되살리기 위해 항생제 항mycotic PBS에 눈을 두는 거즈를 담근다. 멸균 면도날이나 메스를 사용하여 눈의 적도 근처에서 절개를 만듭니다. 그런 다음 앞쪽 눈을 격리하기 위해 구부러진 수술 가위를 사용하여 눈을 헤아리습니다.마이크로 가위를 삽으로 사용하여 전방 세그먼트에서 유리체 유머를 떠서 마이크로 가위로 전방 세그먼트에서 렌즈를 제거합니다. 조리개 뿌리에 홍채를 서서히 잘라내어 궤적 메쉬워크가 보일 때까지 복사합니다. 홍채 주위의 절단 을 360도 연장하고 전체 궤도 메쉬 워크 영역을 노출하고 필요한 경우 trabecular 메쉬 워크를 덮는 남은 잔류 홍채를 청소하십시오.조직의 1 밀리미터 얇은 밴드를 떠나 회반 메쉬 워크 영역에 주모 체 잔해 후방을 손질. 페트리 접시에 전방 세그먼트를 배치 한 후. 면봉을 미디어에 적시고 각막 중앙에 부드럽게 두드려 안료를 제거합니다.집게로 눈을 잡고 닦아 서 clera 주위에 여분의 안료를 제거 합니다. 반전된 전방 세그먼트를 바닥 접시의 높은 영역에 놓고 각막이 높은 영역의 중심에 남아 있는지 확인합니다. 새로 배치된 전방 세그먼트 위에 클램핑 링을 배치하고 L 키로 나사를 부드럽게 조입니다.오링이 있는 유체 커넥터를 접시 하단의 나사 포트에 부착합니다. 첫 번째 유체 커넥터는 18 게이지 90도 구부러진 바늘 허브, 튜브 길이, 18 게이지 바늘 허브, 나일론 주사기 필터, 3 방향 밸브 및 미디어로 채워진 20 mm 주사기를 부착합니다. 제2 유체 커넥터는 18 게이지 90도 구부러진 바늘 허브, 튜브 길이, 18 게이지 바늘 허브, 제1 유체 커넥터에 대해 입증된 3방향 밸브를 부착한 다음 멸균 10 밀리리터 주사기의 배럴 부분을 부착하여 액체와 거품을 잡기 위해 저수지 역할을 합니다.3방향 밸브를 주사기에 적절하게 열어 놓고 첫 번째 유체 커넥터 포트를 사용하여 미디어를 통해 부드럽게 밀어냅니다. 전방 세그먼트를 팽창시키기 위해 튜브를 미디어로 채우고 결국 저수지를 채웁니다. 미디어를 부드럽게 접시에 밀어 거품을 제거하고 거품을 밀어 접시를 반전.전방 세그먼트 장기 배양 접시를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 튜브 라인을 인큐베이터 도어 의 바닥을 통해 튜브 라인을 지시하여 도어 개폐에 대한 간섭을 방지합니다. 압력 변환기 기기에 저장소와 튜브 라인을 배치합니다.PBS가 튜브 라인에 유입되는 기포를 피하기 위해 라인을 통과하는 동안 측면 3방향 밸브를 설정된 압력 변환기에 연결합니다. 개방형 부상 유도를 위해 준비된 바이오 안전 캐비닛 내부에는 천자 플랫폼의 압력 조절기가 직경 4.5mm의 물체에 적절한 천자 힘을 생성하기 위해 평방 인치당 50 파운드의 힘으로 설정합니다. 펑크 플랫폼 앞에 있는 실험실 잭에 크로스 트래킹 바이스를 배치합니다.피스톤 암을 최대 거리로 확장하고 각막 정점을 천공 물체의 1밀리미터 영역 내에 배치하고, 피스톤 암을 철회하고, 전방 세그먼트를 천공 오브젝트에 1센티미터 더 가깝게 놓습니다. 천자 장치를 발사하려면 장치를 켜고 장치에 두 번째 스위치를 사용하여 솔레노이드 밸브를 엽니다. 눈에서 장치를 철회하려면 두 번째 스위치를 누르고, 부상 부위에서 누출된 육안 검사 및 미디어 유출에 의한 적절한 부상 유도를 확인합니다.수술 후, 각막 상피 무결성은 광학 일관성 단층 촬영을 사용하여 이미징을 통해 평가되었다. 부상당한 전방 세그먼트 조직은 부상 직후와 72 시간 후 부상을 입은 직후 에 이미지화되었습니다. 뚜렷한 부상이 부상 후 각막을 통해 위치하는 동안 제어 눈은 각막에 눈에 띄는 혼란을 표시하지 않습니다.하향식 최대 강도 투영에서 부상은 모양과 크기가 불규칙하다는 것이 분명했지만 부상 크기는 72시간 이상 감소했습니다. 수술 전 첫 3일 동안 인터로큘러 압력은 수용 가능한 범위에서 압력 안정성을 결정하는 것으로 관찰되었다. 대표적인 결과 5개의 눈 중 3개는 허용 가능한 인터로큘러 압력 범위 내에 속한다.오픈 글로브 부상과 치료 개입으로 인해 인터로큘러 압력이 변경됩니다. 오픈 글로브 부상 유도 후, 압력은 크게 감소하고 실험이 완료 될 때까지 낮은 남아 있었다. 피부결합 접착제를 사용한 부상당한 조직의 치료는 치료되지 않은 조직에 비해 인터로컨압력을 증가시켰으며, 이는 이 방법이 안구 압력을 복원하기 위한 치료제의 효능을 측정하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.장기 배양에서 세그먼트의 초기 설정은 조직의 장기적인 안정성에 매우 중요합니다. 링을 과도하게 조이면 조직에 스트레스를 유발하고 규정 준수를 줄일 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

신문은 인간의 시체 같은 기증자의 안구 세계에서 망막 조직을 내장을 들어낸하는 간단한 소비세 각막에 대한 기술과 설명합니다. 기술은 안구 세계의 다른 조직을 손상시키지 않고 이식, 수술이나 연구 목적을 위해 사용되는 소비세 양질의 조직에 도움이됩니다 여기서 설명했다.

위한 간편한 기법<em&gt; 현장에서</em인간 안구 글로브에서 각막 및 망막 조직의 내장 적출의&gt; 절단

이 비디오에서는 돼지 눈의 각막이 있는 앞쪽 부분을 해부하는 방법을 보여줍니다. 분리된 분절은 안과 질환의 병태생리학을 연구하기 위한 장기 배양에 사용할 수 있습니다.

전방 안구 절제술: 돼지의 눈에서 전방 분절이 있는 각막을 분리하는 방법

이 비디오에서는 돼지 눈에서 각막이 있는 전방 안구를 배양하는 방법을 보여줍니다. 이 배양 시스템은 눈 부상을 연구하기 위한 실험 모델로 사용됩니다.

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Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

증강 현실 기술은 대퇴골 머리의 골괴사에 대한 핵심 감압에 적용되어이 수술 절차의 실시간 시각화를 실현했습니다. 이 방법은 코어 감압의 안전성과 정밀도를 효과적으로 향상시킬 수 있습니다.

증강 현실 탐색 유도 대퇴골 머리의 골괴사에 대한 코어 감압

본 연구는 핵이 있는 구체의 고해상도 라이브 셀 이미징을 가능하게 하기 위해 3D 프린팅 홀더를 활용하는 새로운 실험 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 생체 외 글로브 에서 상처 입은 각막 상피의 세포 칼슘 신호 전달 활성을 실시간으로 관찰 할 수 있습니다.

새로운 3D 프린팅 홀더를 사용한 온전한 생체 외 구체의 라이브 셀 이미징

VisualEyes2020(VE2020)은 시각적 안구 운동 자극을 표시, 기록 및 동기화하는 맞춤형 스크립팅 언어입니다. VE2020은 접합 안구 운동(단속 및 부드러운 추적), 접합 안구 운동(수렴), 조절 및 각각의 조합에 대한 자극을 제공합니다. 두 가지 분석 프로그램이 시선 추적 및 숙박 기록 시스템의 데이터 처리를 통합합니다.

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비종양성 지구본의 철저한 그로잉 및 표준화된 절편은 고품질의 재현 가능한 조직병리학적 절편을 얻는 데 중요합니다. 성인 및 태아의 비종양 지구본의 표준화된 매출에 대한 지침이 여기에 제공됩니다. 사례 기반 의사 결정에 대한 기준을 포함하여 구체 절편에 대한 다양한 옵션을 시연하고 논의합니다.

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마우스 망막의 신경교세포(glial interactions)를 연구하기 위한 생체 외 이식 모델(Ex vivo Explant Model for Study Glial Interactions in the Mouse Retina)

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오픈 글로브 부상 및 치료 성능을 추적하기위한 전방 세그먼트 장기 문화 플랫폼

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