Name: 시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 배우세요 단일분자 형광 증강 기법을 활용하여 α-시누클레인의 안정적인 국소 구조를 식별하는 방법입니다. 이 기술은 단백질 표면 근처의 염료 표지 위치를 기반으로 한 구조적 이종집단을 포착하여 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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A56C α-Syn 돌연변이를 코딩하는 pT-t7 플라스미드는 아사프 그루피 박사, 댄 아미르 박사, 엘리샤 하스 박사의 선물로 우리에게 주어졌습니다. 이 논문은 국립 보건원 (NIH, 보조금 R01 GM130942 E.L. 하위 상으로), 이스라엘 과학 재단 (보조금 3565/20 킬코로나 내에서 - 코로나 바이러스 연구 프로그램을 억제), 밀너 기금과 예루살렘히브리어 대학 (시작 기금).

모든 저자는 이해 상충을 공유하지 않습니다.

광범위한 생화학 적 및 생물리 연구는 α 신과 그 무질서한 자연33,34,35,36,37,38의구조적 특성을 연구하기 위해 수행되었다. 여러 작품은 이미 자유롭게 확산 smFRET를 활용하여 결합이 없는 α-Syn 단조량의 분자 내 역학을 조사합니다. 이러한 작품들은 α-Syn의 높은 동적 이질성을 보고하여, 공초점 지점을 통해 일반적인 확산 시간 내에 여러 가지 구조 종의 평균 아웃으로 이어져 단일 FRET 인구39,40의출현으로 이어진다. 그러나, smFRET 측정은 3-...

지난 2년간, 단일 분자 형광계 방법은 생체 분자1,2,다른 생체 분자 파라미터가 어떻게 분포되는지뿐만 아니라 하위 밀리초 해상도3,4,5에서이러한 매개 변수의 상이한 하위 집단 간에 동적으로 상호 작용하는 방법을 탐구하는 강력한 도구가 되었다. 이러한 기술의 파라미터는 FRET 측정 6,7,형광 이소트로피8,9,형광 양자 수율 및 수명10,11에서에너지 전달 효율을 포함하며, 12 또는 개선 된13 메커니즘의 상이한 형광의 함수로서. 단백질 유발 형광 향상(PIFE) (PIFE)(PIFE) 14는 염료14,15,16,18,18, 18, 18, 18의 부근의 단백질 표면에 의해 유발된 흥분 상태에서 형광의 자유 이소성 화에 대한 비질 방해의 함수로서 형광 양자 수율 및 수명의 향상을 소개합니다. . FRET와 PIFE 는 측정된 파라미터가 측정 중인 표지된 생체 분자 내의 공간 측정에 직접 연결되기 때문에 분광 눈금자 또는 근접 센서로 간주됩니다. FRET 효율은 3-10 nm20범위 내에서 염료 쌍 사이의 거리와 관련이 있지만, PIFE 트랙은 0-3 nm19범위내에서 염료와 인근 단백질의 표면 사이의 거리와 관련된 형광 양자 수율 또는 수명이 증가한다.
단일 분자 FRET는 본질적으로 무질서한 단백질(IDP)(21) (21)예를 들어, α-시뉴클레인(α-Syn)(22)와같은 많은 다른 단백질 시스템에 대한 구조적 통찰력을 제공하는 데 널리 사용되어 왔다. α-신은 상이한 생체분자에 결합하고 상이한 조건하에서23,24,25,26,27,28,29,30의상이한 조건하에서 정렬된 구조를 형성할 수 있다. 그러나, 결합되지 않은 경우, α-Syn 단백체는 빠르게 상호 변환적합성(31,32)과높은 형태 이질성을 특징으로 한다.
α-Syn의 적합성은 이전에 이러한 고이질 및 동적 단백질 시스템의 형성 역학을 식별하는 데 도움이 되는 다양한 기술을 사용하여 연구되었으며,33,34,35,36,37,38, 39. 흥미롭게도, 완충제에서 α-Syn의 단일 분자 FRET(smFRET) 측정은 단일 FRET 인구39,40을 보고한결과,이는 공초점 지점을 통해 α-Syn의 일반적인 확산 시간보다 훨씬 빠른 시간에 동적으로 상호 변환되는 적합성의 시간 평균 결과이며(보통 보다 적은 마이크로초, 심지어 는 그보다 빠른40배) 41. 그러나, 3-10 nm 거리 감도를 가진 FRET 분광 눈금자를 사용하여 때때로 α-Syn과 같은 작은 단백질의 전반적인 구조 적 변화에 대해서만 보고합니다. 거리 민감도가 짧은 분광 근접 센서를 활용한 단일 분자 측정은 현지 구조물의 역학에 대해 보고할 가능성이 있습니다. 본명 에서 우리는 α-Syn의 단일 분자 PIFE 측정을 수행하고 100 ms만큼 느린 그들 사이의 전환과 다른 지역 구조에 매핑 형광 수명의 다른 하위 집단을 식별합니다. 이 작업은 버퍼에서 자유 확산 α-Syn 분자의 시간 해결 된 smPIFE 측정을 요약하고 단거리 단일 분자 분광 근접 센서로서 SDS 기반 멤브레인에 바인딩될 때.

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 장치</td><td>Merc</td><td>C7715</td><td>컷오프: 100kDa</td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>시스테아민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>투석 백 - MEGA GeBaFlex-tube</td><td>Gene Bio-Application</td><td>MEGA320</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마-알드리치</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>패스트 시밴드 염색 용액</td><td>유전자 바이오 응용</td><td>SB050</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마-알드리치</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap 탈염 5mL</td><td>시그마-알드리치</td><td>GE17-1408</td><td></td></tr><tr><td>6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산(트롤록스)</td><td>시그마-알드리치</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)</td><td>시그마-알드리치</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>시그마-알드리치</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 염화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MonoQ 컬럼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54807</td><td></td></tr><tr><td>단백질 LoBind 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108094</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>헹굼 &micro;-slide 18</td><td>Ibidi</td><td>81816</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71507</td><td></td></tr><tr><td>멸균 세포 스프레더, Drigalski 주걱</td><td>미니 플라스트</td><td>815-004-05-001</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 황산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-Cy3&nbsp; maleimide</td><td>abcam</td><td>ab146493</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75259</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

분광 눈금을 사용하여 단일 생체 분자와 역학의 여러 적합성을 추적함으로써 구조적 역학에 대한 이해와 생물학에 대한 기여에 혁명을 일으켰습니다. FRET 기반 눈금자는 3-10 nm 범위에서 염료 간 거리에 대해 보고하는 동안, 단백질 유발 형광 향상(PIFE)과 같은 다른 분광 기술, 짧은 0-3 nm 범위에서 염료와 단백질 표면 사이의 근접성에 대한 보고. 선택의 방법에 관계없이, 한 번에 하나씩 자유롭게 확산되는 생체 분자를 측정하는 데 사용하는 것은 각 하위 집단이 밀리초 이내에 변경되지 않은 단일 형태 또는 밀리초보다 훨씬 빠르게 상호 변환되는 다중 적합성을 나타내는 생체 분자의 분리된 중앙 분산 하위 집단을 산출하는 실험 파라미터의 히스토그램을 검색합니다. 히스토그램에 보고된 파라미터가 염료 FRET 효율인 단일 분자 FRET에서, 완충제의 α-시뉴클레인 단조근과 같은 본질적으로 무질서한 단백질은 이전에 빠르게 상호 변환하는 다중 적합성의 단일 평균 아웃 하위 집단을 나타내는 것으로 보고되었다. 이러한 과거 발견은 FRET 기반 통치자의 3-10 nm 범위에 의존하는 동안, 우리는 우리가 사이트 특정 sCy3 표지 α-시뉴클레인 단백질의 형광 수명을 추적 단일 분자 PIFE를 사용하여 테스트에이 단백질을 넣어 하고자 한 번에 하나씩. 흥미롭게도, 이 짧은 범위 분광 근접 센서를 사용하여, sCy3 표지 α-Synuclein는 10-100 ms에서 상호 변환하는 명백하게 다른 평균 수명을 가진 몇몇 일생 하위 인구를 전시합니다. 이러한 결과는 α-시뉴클레인이 전 세계적으로 무질서할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 안정적인 지역 구조를 달성한다는 것을 보여줍니다. 요약하자면, 이 작품에서는 한 번에 하나의 생체 분자를 로컬 또는 글로벌 구조 변화를 추적하는 다양한 분광 근접 센서를 사용하는 이점을 강조합니다.

IDP로서, 다른 생체 분자에 바인딩되지 않을 때, α-Syn은 몇 마이크로초40에서, 심지어 수백 나노초41에서전이와 함께 다중 적합성 사이의 구조적 역학을 나타낸다. α-Syn이 공초점 지점을 교차하면 적합성 간에 수천 번의 전환이 발생할 수 있습니다. 실제로, 이것은 smFRET가39,40을사용했을 때의 경우였습니다. 여기서 우리는 α-Syn의 로컬 형태 역학을 조사하기 위해 smPIFE 측정을 수행합니다.
이 측정은 α-Syn A56C 돌연변이체에서 시스테인의 티올 그룹에 부착된 설포-Cy3(sCy3) 염료로부터 방출되는 형광광자를 기록한다. sCy3 플루오로포어는 흥분된 상태에서 이소성화를 겪을 수 있습니다. 그러나 sCy3은 트랜스 이좀러에서 흥분을 일으킬 때 광자...

시간 해결된 단일 분자 단백질 유도 형광 향상은 단백질의 국소 구조적 변화에 민감한 유용한 형광 분광 근접 센서이다. 여기서 우리는 그렇지 않으면 구형비정형및 불안정으로 알려진 α-시뉴클레인에서 안정적인 지역 적합성을 발견하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

단일 분자, 단백질 유발 형광 향상은 단백질 구조 적 하위 인구와 적합성을 연구 할 때 단일 분자 FRET 측정을 칭찬 할 수 있으며, 특히 뚜렷한 구조적 하위 인구가 안정적인 국소 구조에 대해 보고할 때 특히 발생합니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 표면에 염료 라벨링 부위의 부근을 기반으로 뚜렷한 사이트 별 구조 하위 집단을 포착한다는 것입니다. 단일 분자, 단백질 유도 형광 향상은 뚜렷한, 국소, 구조적 하위 집단을 조사하기 위해 관심있는 모든 생체 분자 시스템에 적용 될 수있다.먼저 저단단백질 결합 튜브에서 측정 버퍼에서 25피코폴라 Sulfo-Cy3 표지알파 시뉴클레인을 준비한다. 밀리리터 BSA당 1밀리그램의 마이크로리터 100개를 18실 현미경 커버 슬라이드에 넣고 1분 동안 배양한 다음 BSA를 폐기하십시오. 커버 슬립 슬라이드의 챔버에 25 피코폴라 Sulfo-Cy3 라벨 알파 시뉴클레인 샘플의 100 마이크로 리터를 추가합니다.다음으로, 데이터 수집을 위해, 고숫자 조리개 물 침지 목적 렌즈의 상단에 초순수 한 방울을 추가하고, 스테이지 챔버에 커버 슬립 슬라이드를 고정한 다음 현미경 단계의 상단에 어셈블리를 설치한다. 객관적인 렌즈를 위쪽으로 가져와 서 커버 슬립 슬라이드 의 하단에 있는 객관적인 렌즈 얼룩 위에 물방울을 바르고 레이저 셔터를 엽니다. 객관적인 렌즈가 위쪽으로 움직이면 CCD 카메라의 통풍이 좋은 링 패턴을 검사합니다.첫 번째 링은 물/유리 인터페이스의 초점을 나타내며, 두 번째 링은 유리와 샘플 용액 사이의 인터페이스에서 초점을 나타냅니다. 목표 렌즈의 높이를 75 마이크로미터로 늘려 커버 슬립의 유리 표면으로부터 의 자가 형광을 최소화하기 위한 용액 깊숙이 레이저 초점을 가져옵니다. 약 100, 마이크로 와트 객관적인 렌즈에서 레이저 전력을 조정합니다.미리 정의된 시간 동안 감지된 광자의 인수를 시작합니다. Jupyter 노트북을 열고 샘플 노트북을 엽니다. FRETBursts 및 Photon-HDF5 데이터 파일을 로드합니다.인터포토른 시간의 히스토그램을 사용하여 데이터 수집 의 30초마다 배경 속도를 계산합니다. 20개의 연속 광자용 한 번에 하나의 광자의 시간 창을 이동하고, 즉각적인 광자 속도 F가 데이터 수집 기간 동안 배경 속도보다 11배 이상 큰 경우 광자 데이터를 수집한다. 버스트 크기 및 광자의 배설물, 버스트 지속시간, 버스트 밝기, 버스트 에서 순간 광자 속도의 가장 큰 값, 버스트 분리, 연속 버스트 사이의 시간 간격 사이의 시간 차이를 계산합니다.이벤트 축을 로그리스믹 스케일로 버스트 밝기 값의 히스토그램을 플롯합니다. 버스트 밝기 임계값을 히스토그램이 부패 패턴을 나타내는 최소 버스트 밝기 값으로 정의하고 버스트 밝기 임계값보다 큰 밝기 값을 가진 버스트를 선택합니다. 버스트 평균 형광 수명 측정의 경우, 광자 수축을 로지반스믹 스케일로 선택한 버스트의 모든 광자에 대한 광자 나노타임의 히스토그램을 플롯한다.나노시간 임계값을 광나노시간의 히스토그램이 부패 패턴을 나타내는 최소 나노시간 값으로 정의한다. 나노타임 임계값보다 나노타임이 큰 광자만 선택합니다. 선택한 모든 광자 나노타임의 대수 평균을 계산합니다.광자 나노시간 대수 평균으로부터 나노시간 임계값을 뺍니다. 얻어진 값은 버스트의 평균 광나노시이며, 평균 형광 수명에 직접 비례한다. 모든 버스트 평균 형광 수명의 히스토그램을 플롯합니다.형광 수명의 중앙 분산 하위 인구가 나타날 수 있습니다. 값이 낮은 평균을 가진 하위 인구는 황색으로 방해되지 않은 Sulfo-Cy3를 가진 분자 종을 나타내고, 더 높은 가치의 평균을 가진 하위 인구는 더 sterically 방해된 S-Cy3를 가진 분자 종을 나타냅니다. 느린 버스트 역학 평가를 위해, 터지는 분리 시간의 히스토그램을 로개리스믹 스케일에서 분리 시간 축으로 플롯합니다.동일한 분자 하위 모집단을 정의하는 최대 분리 시간 미만으로 분리되는 연속 버스트의 모든 쌍을 저장하려면 선택합니다. 히스토그램 또는 특정 분리 시간 임계값 이하로 되풀이되는 버스트의 모든 쌍에 대해 첫 번째 및 두 번째 버스트의 평균 형광 수명의 분산플롯을 플롯합니다. 단일, S-Cy3 표지, 알파 시뉴클레인-56 분자의 평균 형광 수명의 히스토그램은 첫 번째 하위 집단이 1.6 나노초의 특징적인 형광 수명을 가지고 있음을 보여주었으며, 56년 후 단백질 표면이 거의 없는 알파-synuclein 구성 상태를 나타낸다.두 번째 하위 인구는 3.5 나노 초의 특징적인 형광 수명을 가지고 있었고 잔류물 56 부근에서 더 많은 단백질 표면을 가진 알파 시뉴클레인 형성 상태를 나타냅니다. 알파-시뉴클레인 분자의 비아밀로이드 베타 성분 세그먼트는 SDS 소포에 결합시 헬리컬, 헤어핀 구조를 채택하는 것으로 알려져 있으며, 이는 약 3나노초의 특징적인 수명을 가진 단일 꽃병 수명 집단으로 확인되었으며, 1.6나노초의 특성수명을 가진 하위 집단의 부재. 연속, 단일 분자 버스트 사이의 분리 시간의 히스토그램은 100 밀리초보다 빠르게 분리 시간에 대한 반복 분자를 보고하며, 여기서 첫 번째와 두 번째 버스트는 동일한 분자에서 발생합니다.모든 단일 분자 버스트의 평균 형광 수명 히스토그램은 짧은 특성 수명을 가진 하위 인구뿐만 아니라 개별 분자가 버스트 지속 시간보다 느린 다른 평균 수명 값 사이의 전환을 겪을 수 있음을 나타내는 긴 특성 수명을 보였다. 최대 100 밀리초의 파열 분리 시간 안에, 짧은 일생 하위 인구에 있는 첫번째 파열로 시작하고, 긴 일생 하위 인구 내의 두 번째 파열로 재발한 분자의 분수가 있었습니다. 긴 일생 하위 집단에서 첫 번째 버스트로 시작하고, 짧은 일생 인구 내에서 두 번째 파열로 재발한 분자의 분수는 10 에서 100 밀리초 안에 있는 두 하위 집단 사이 전환을 나타냅니다.실험 결과를 분석할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 배경에서 단일 분자 형광 신호를 적절히 분리하고 충분한 광자 나노타임으로 파열을 분석하는 것입니다. smPIFE의 개발은 연구원이 단일 분자 수준에서 핵산 단백질 상호 작용을 탐구하는 길을 열었습니다. 이 발전은 단백질 내의 현지 구조 역학을 연구하기위한 토대를 마련합니다.

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Research

연구

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Biochemistry

생화학

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