Name: 수지상 가지 및 방향자동 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 배우세요 SOA를 활용한 2D 형광 이미지에서 수지상 가지의 방향과 형태를 자동 분석하는 방법입니다. 이 계산 도구는 신경망 성장 패턴을 신속하게 식별하여 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 문화 이미지의 준비에 대한 박사 Orly Weiss에게 감사드립니다.

참고 : 이스라엘 보건부는 실험 동물의 윤리적 사용을 위해 프로토콜 IL-218-01-21에 따라 마우스의 사용을 승인했다. SOA는 윈도우와 호환 10 파이썬 3.9. 오픈 소스 코드로 사용할 수 있습니다: https://github.com/inbar2748/DendriteProject. 이 링크에는 README도 있습니다. 소프트웨어를 다운로드하기 위한 길찾기가 있는 DM 파일, 소프트웨어 웹 사이트에 대한 링크 및 모든 패키지의 필수 버전에 대한 정보가 포함된 요구 사항 파일입니다. 소프트웨어를 사용하여 수행된 분석의 추가 예도 이곳에 제공되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62679/62679fig01.jpg"> 그림 1: 세분화 및 성장 방향 분석을 위한 SOA 워크플로우입니다. 다음은 수지상 네트워크 및 데이터 분석의 형광 이미지의 처리 단계입니다. 2D 이미지는 업로드되고 세분화되어 있습니다(두 단계로 수지상 분기가 선으로 감지된 다음 관련 선이 병합됨) 각 수지상 분기의 공간 정보를 얻습니다. 데이터는 이미지의 모든 수지상 분기에 대해 수집됩니다. 마지막으로, 데이터는 원하는 형태학적 매개 변수를 제공하기 위해 분석된다. 약어: SOA = 세분화 및 방향 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62679/62679fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. SOA 응용 프로그램을 엽니 다.
<ol><li>URL 주소 열기: https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA, SOA.zip 지퍼 폴더를 찾아, 두 번 클릭하여 ZIP 파일을 다운로드합니다.</li>
	<li>SOA.zip 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 폴더의 압축을 풀고 파일 추출을 선택합니다. 열리는 추출 경로 및 옵션 창과 추출된 파일에 대한 경로를 표시하는 대상 주소 텍스트 상자를 관찰합니다. 다른 위치로 추출하려면 창 오른쪽 패널의 폴더 중 하나를 클릭하여 대상 폴더로 만듭니다. 확인을 클릭하여 해당 폴더로 파일을 추출합니다.</li>
	<li>추출된 SOA 파일을 열고 SOA.exe 두 번 클릭합니다. 검은 색 창이 열리기를 기다린 후 응용 프로그램이 나타납니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62679/62679fig02.jpg"> 그림 2: SOA의 GUI를 사용하는 워크플로의 예입니다. 왼쪽 열: 워크플로의 GUI 섹션입니다. 중간 열: 워크플로 중에 처리된 수지상 네트워크의 이미지(배율 막대: 20 μm). 오른쪽 열: 중간 열 이미지에서 빨간색 사각형으로 표시된 영역의 배율(배율 막대: 4 μm). 1단계: 이미지 선택 및 업로드. 2단계: 세분화의 첫 번째 단계는 식별된 수지상 분기를 나타내는 선의 검출입니다. 3단계: 세분화의 두 번째 단계는 개별 수지상 분기에 있는 세그먼트 라이닝의 근접 기반 합병입니다. 모든 단계의 설정을 수정할 수 있습니다. 약어: SOA = 세분화 및 방향 분석; GUI = 그래픽 사용자 인터페이스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62679/62679fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 분석할 이미지를 엽니다.
<ol><li>SOA 뷰어 업로드 메뉴 표시줄| 파일 | 선택 컴퓨터 파일에서 이미지를 선택| .png .jpg .tif .bmp | 오픈 | 파일의 경로를 | 다음.
</li>
</ol>3. 세분화 최적화
참고: SOA 뷰어 속성 메뉴 모음에서 선택한 매개 변수의 값을 변경하여 세분화 프로세스 설정을 조정합니다. 임계값과 같은 매개 변수에 대한 자세한 설명은 보충 재질에 제공됩니다.
<ol><li>Edge에서 임계값을 선택하고 숫자를 입력하여 디스플레이의 임계값을 조정합니다. 참고: 임계값의 수가 낮을수록 더 많은 선이 감지됩니다. 임계값은 0에서 255까지의 숫자입니다. 기본 값이 0으로 설정되었습니다.</li>
	<li>병합 선:<ol>
<li>병합할 최소 거리를 선택하고 숫자를 입력 하는 Min 거리를 선택하여 디스플레이에 병합할 최소 거리를 조정합니다. 참고: 병합할 최소 거리는 0~30픽셀입니다. 기본 값은 20으로 설정됩니다.</li>
		<li>병합할 최소 각도를 선택하고 숫자를 입력 하는 Min 각도를 선택하여 디스플레이에 병합할 수 있습니다. 참고: 병합할 최소 각도 는 0~30°입니다. 기본 값은 10으로 설정됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미리 보기 세분화 이미지 만들기를 클릭합니다. 참고: 분할 결과의 미리 보기 이미지가 업데이트된 값에 따라 표시됩니다. 또한 병합 하기 전에 선 수와 병합 후 줄의 수가 표시됩니다.</li>
	<li>세그먼트의 최대 식별을 위해 매개 변수를 변경합니다. 속성을 변경해야 하는 경우 창 닫기 버튼을 클릭하고 3.1-3.4 단계를 따릅니다.</li>
</ol>4. 출력 파일을 만듭니다.
<ol><li>확인을 눌러 세분화 이미지와 분석 그래프를 시각화합니다. .xlsx 파일이 저장되는 위치를 선택하기 위해 나타나는 창을 관찰합니다.</li>
	<li>파일 이름 | 삽입 저장 | 선택 데이터가 있는 .xlsx 파일을 만들고 저장할 때까지 기다립니다. 참고: .xlsx 파일 외에도 원본 이미지를 표시하는 파일, 선 인식 이미지, 분할의 최종 이미지 및 세 가지 분석 그래프를 표시하는 파일이 자동으로 표시됩니다.
</li>
</ol>5. 탐색 도구 모음
참고: 탐색 도구 모음은 모든 그림 창에 포함되어 있으며 데이터 집합을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 도구 모음 하단의 각 단추는 아래에 설명되어 있습니다.
<ol><li>이전에 정의된 뷰 사이를 앞뒤로 이동하려면 앞으로 및 뒤로 단추를 사용합니다. 참고: 홈, 포워드 및 뒤로 단추는 웹 브라우저의 홈, 포워드 및 백 컨트롤과 유사합니다. 홈 은 기본 화면인 원본 이미지로 돌아갑니다.</li>
	<li>확대/축소 버튼을 사용하여 이동 및 확대/축소합니다. 패닝 및 확대/축소를 활성화하려면 줌 버튼을 누릅니다.<ol>
<li>그림을 이동하려면 왼쪽 마우스 버튼을 길게 누릅니다. 마우스 버튼을 놓고 이미지의 선택한 점이 새 위치에 나타납니다. 패닝하는 동안 x 또는 y 키를 길게 누르면 모션을 x 또는 y 축으로 제한합니다.</li>
		<li>확대/축소하려면 오른쪽 마우스 버튼을 길게 누르고 새 위치로 드래그합니다. 오른쪽으로 이동하여 x축을 확대하고 왼쪽으로 이동하여 x축을 축소합니다. y축 및 위/아래 모션에서도 동일한 작업을 수행합니다. 확대/축소할 때 마우스 아래의 점이 고정되어 있어 해당 점을 확대하거나 축소할 수 있습니다. 수정자 키 x, y 또는 CONTROL 을 사용하여 줌을 각각 x, y 또는 종횡비 보존으로 제한합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>확대/축소-사각형 모드를 활성화하려면 확대/축소-사각형 단추를 클릭합니다 . 커서를 이미지 위에 놓고 왼쪽 마우스 버튼을 누릅니다. 단추를 들고 마우스를 새 위치로 드래그하여 직사각형 영역을 정의합니다. 참고: 왼쪽 마우스 버튼을 누르면 축 보기 제한이 정의된 영역으로 확대됩니다. 오른쪽 마우스 버튼을 누르면 축 보기 제한이 축소되어 정의된 영역에 원래 축을 배치합니다.</li>
	<li>서브플롯 구성 도구를 사용하여 하위 플롯의 모양을 구성합니다. 참고: 서브플롯의 왼쪽, 오른쪽, 위쪽 및 아래쪽 측면과 행과 열 사이의 공백은 연장하거나 압축할 수 있습니다.</li>
	<li>파일 저장 대화 상자를 열려면 저장 단추를 클릭하고 파일을 .png. .ps, .eps, .svg 또는 .pdf 다음 형식으로 저장합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Ferrante, M., Migliore, M., Ascoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+dendritic+branch-point+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional impact of dendritic branch-point morphology.</a> Journal of Neuroscience. 33 (5), 2156-2165 (2013).</li>
<li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons%3A+dendritic+structure+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 206-221 (2008).</li>
<li>Chklovskii, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Connectivity+and+Neuronal+Morphology%3A+Two+Sides+of+the+Same+Coin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic Connectivity and Neuronal Morphology: Two Sides of the Same Coin.</a> Neuron. 43 (5), 609-617 (2004).</li>
<li>Chapleau, C., Larimore, J., Theibert, A., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+dendritic+spine+development+and+plasticity+by+BDNF+and+vesicular+trafficking%3A+fundamental+roles+in+neurodevelopmental+disorders+associated+with+mental+retardation+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurodevelopmental+Disorders%22%5BJournal%5D)">Modulation of dendritic spine development and plasticity by BDNF and vesicular trafficking: fundamental roles in neurodevelopmental disorders associated with mental retardation and autism.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 1 (3), 185-196 (2009).</li>
<li>Irwin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Spine+Structural+Anomalies+in+Fragile-X+Mental+Retardation+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dendritic Spine Structural Anomalies in Fragile-X Mental Retardation Syndrome.</a> Cerebral Cortex. 10 (10), 1038-1044 (2000).</li>
<li>Kaufmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+anomalies+in+disorders+associated+with+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation.</a> Cerebral Cortex. 10 (10), 981-991 (2000).</li>
<li>Pinchas, M., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+branch+intersections+are+structurally+regulated+targets+for+efficient+axonal+wiring+and+synaptic+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic branch intersections are structurally regulated targets for efficient axonal wiring and synaptic clustering.</a> PLoS ONE. 8 (12), 82083(2013).</li>
<li>Cove, J., Blinder, P., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contacts+among+non-sister+dendritic+branches+at+bifurcations+shape+neighboring+dendritic+branches+and+pattern+their+synaptic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Contacts among non-sister dendritic branches at bifurcations shape neighboring dendritic branches and pattern their synaptic inputs.</a> Brain Research. 1251, 30-41 (2009).</li>
<li>Blinder, P., Cove, J., Foox, M., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+among+non-sister+dendritic+branches%3A+An+activity-controlled+mean+to+strengthen+network+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Convergence among non-sister dendritic branches: An activity-controlled mean to strengthen network connectivity.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3782(2008).</li>
<li>Glaser, J., Glaser, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron+imaging+with+neurolucida+-+PC-based+system+for+image+combining+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Neuron imaging with neurolucida - PC-based system for image combining microscopy.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 14 (5), 307-317 (1990).</li>
<li>Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Measure%3A+a+web-accessible+tool+for+the+analysis%2C+comparison+and+search+of+digital+reconstructions+of+neuronal+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies.</a> Nature Protocols. 3 (5), 866-876 (2008).</li>
<li>Torben-Nielsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+extendable+python+library+to+analyze+neuronal+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">An efficient and extendable python library to analyze neuronal morphologies.</a> Neuroinformatics. 12 (4), 619-622 (2014).</li>
<li>Parekh, R., Ascoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+morphology+goes+digital%3A+A+research+hub+for+cellular+and+system+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal morphology goes digital: A research hub for cellular and system neuroscience.</a> Neuron. 78 (1), 206(2013).</li>
<li>heng, J., Zhou, X., Sabatini, B. L., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuronIQ%3A+A+novel+computational+approach+for+automatic+dendrite+SPINES+detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%222007+IEEE%2FNIH+Life+Science+Systems+and+Applications+Workshop%22%5BJournal%5D)">NeuronIQ: A novel computational approach for automatic dendrite SPINES detection and analysis.</a> 2007 IEEE/NIH Life Science Systems and Applications Workshop. , 168-171 (2007).</li>
<li>Image processing and analysis in Java. NIH. ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij">https://imagej.nih.gov/ij</a> (2021).</li>
<li>Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+survival+and+durability+of+neurons+and+astrocytes+on+3-dimensional+aragonite+biomatrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices.</a> Tissue Engineering. 13, 461-472 (2007).</li>
<li>Morad, T. I., Hendler, R. M., Weiss, O. E., Canji, E. A., Merfeld, I., Dubinsky, Z., Minnes, R., Francis, Y. I., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliosis+of+astrocytes+cultivated+on+coral+skeleton+is+regulated+by+the+matrix+surface+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography.</a> Biomedical Materials. 14 (4), 045005(2019).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

2D 심상에서 형태학적 정보를 추출하기 위한 효과적인 전략은 생물학적 이미징 데이터를 따라잡기 위해 시급히 필요합니다. 이미징 데이터는 몇 시간 안에 생성될 수 있지만 이미지에 대한 심층 분석은 시간이 오래 걸립니다. 그 결과, 이미지 처리는 분명히 많은 분야에서 주요 장애물이되었다. 이것은 특히 생물학적 샘플을 다룰 때 데이터의 복잡성이 높기 때문입니다. 또한 많은 사용자가 특수 프로그래밍 및 이미지 처리 기술이 부족하기 때문에 쉽고 사용자 친화적인 방식으로 이미지 처리를 수행할 수 있는 자동화된 도구가 필요합니다. SOA가 유용할 것으로 예상되는 이유입니다. 대표적인 결과는 수지상 네트워크의 복잡성에도 불구하고 몇 가지 간단한 단계로 이미지의 수지상 분기를 식별할 수 있는 자동화된 세분화를 보여 줍니다. 작업 과정은 간단하고 직관적이며, 다양한 공간 정보는 즉시 노력없이 얻을 수 있습니다. 여러 알고리즘이 사용되어 형광 이미지의 개별 수지상 분기를 감지하고 결과에 대한 여러 분석을 수행했습니다. 알고리즘에 대한 자세한 설명은...

수지상 형태 발생은 수지상 나무의 구조가 뉴런1,2,3에서 시냅스 통합의 전산 특성에 영향을 미치기 때문에 신경 과학의 중심 주제입니다. 더욱이, 수지상 분지의 형태학적 이상 및 수정은 퇴행성 및 신경 발달 장애4,5,6에 연루됩니다. 수지상 파급 효과가 더 쉽게 시각화 될 수있는 신경 배양에서, 비 자매 수지상 분기 사이의 상호 작용은 분기를 따라 시냅스 클러스터링의 사이트와 정도를 조절, 시냅스 호형성 및 가소성에 영향을 미칠 수있는 행동7,8,9. 따라서, 2차원(2D) 뉴런 배양을 이용한 수지상 나무의 형태학적 파라미터의 특성화는 뉴런의 단일 및 네트워크의 수지상 형태 발생 및 기능을 이해하는 데 유리하다. 그러나 수지상 분기는 "단순화된" 2D 신경 배양에서도 복잡한 메시를 형성하기 때문에 어려운 작업입니다.
수지상 구조물을 자동으로 추적하고 분석하기 위해 여러 가지 도구가 개발되었습니다10,11,12,13. 그러나 이러한 도구의 대부분은 3D 뉴런 네트워크를 위해 설계되었으며 2D 네트워크와 함께 사용하기에는 자연적으로 너무 복잡합니다. 반면, 덜 진보된 형태학적 분석 도구는 일반적으로 컴퓨터 지원 수동 노동의 중요한 구성 요소를 포함하며, 이는 매우 시간이 많이 걸리고 작업자 바이어스14에 취약합니다. 'ImageJ'15'(커뮤니티에서 개발한 생물학적 이미지 분석 도구의 방대한 컬렉션을 갖춘 NIH 오픈 소스 이미지 처리 패키지)와 같은 기존 반자동 도구는 사용자 수동 노동을 크게 줄입니다. 그러나 이미지 처리 중에 일부 수동 개입이 여전히 필요하며 세분화의 품질은 바람직하지 않을 수 있습니다.
이 백서는 2D 뉴런 네트워크 내의 수지상 분기의 직접 세분화 및 방향 분석을 허용하는 간단한 자동화 된 도구 인 SOA를 제공합니다. SOA는 2D 이미지에서 다양한 라인과 같은 물체를 감지하고 형태학적 특성을 특성화할 수 있습니다. 여기에서 는 SOA를 사용하여 수지상 의 2D 형광 이미지에서 수지상 분기를 배양했습니다. 이 소프트웨어는 수지상 분기를 식별하고 병렬 및 공간 분포와 같은 형태학적 매개 변수의 측정을 성공적으로 수행합니다. SOA는 다른 세포 모형의 세포 프로세스의 분석 및 비 생물학 네트워크를 공부하기 위한 쉽게 적응될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>매트플롯립</td><td>&nbsp; 2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom 및 Matplotlib 개발 팀; 2012 - 2021 Matplotlib 개발팀.</td><td>3.4.2</td><td>Python 2D 플로팅 라이브러리</td></tr><tr><td>matplotlib-scalebar</td><td>Philippe Pinard</td><td>0.7.2</td><td>matplotlib 용 아티스트</td></tr><tr><td>NumPy</td><td>NumPy 커뮤니티.</td><td>1.20.3</td><td>과학 컴퓨팅 라이브러리</td></tr><tr><td>OpenCV</td><td>OpenCV 팀을</td> 위한 기본 패키지 <td>4.5.2.54</td><td>오픈 소스 컴퓨터 비전 라이브러리</td></tr><tr><td>PyCharm</td><td>JetBrains</td><td>2020.3.1(Community Edition)</td><td>버전 빌드 #PC-203.6682.86, 2020년 12월 18일에 빌드. 런타임 버전: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. VM : JetBrains sro의 OpenJDK 64 비트 서버 VM 윈도우 10 10.0. 메모리: 978M, 코어: 4</td></tr><tr><td>PyQt5</td><td>Riverbank Computing</td><td>5.15.4</td><td>GUI python</td></tr><tr><td></td><td>Python Software Foundation License</td><td>3.9 버전</td><td></td></tr><tr><td>Qt Designer</td><td>The QT Company Ltd.</td> 관리<td>5.11.1 버전</td><td></td></tr><tr><td>scipy</td><td>커뮤니티 라이브러리 프로젝트</td><td>1.6.3</td><td>수학, 과학 및 공학을위한 오픈 소스 소프트웨어의 Python 기반 생태계</td></tr><tr><td>Seaborn</td><td>Michael Waskom.</td><td>0.11.1</td><td>Python의 통계 데이터 시각화 라이브러리.</td></tr><tr><td>Windows 10</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xlsxwriter</td><td>John McNamara</td><td>1.4.3</td><td>Excel XLSX 파일 생성을 위한 Python 모듈</td></tr></tbody></table>

수지상 가지 및 방향자동 식별

Automatic Identification of Dendritic Branches and their Orientation

신경 수 지상 나무의 구조는 뉴런에서 시 냅 스 입력의 통합에 중요 한 역할을. 따라서, 원점의 형태의 특성화는 신경 기능의 더 나은 이해를 위해 필수적이다. 그러나, 수지상 나무의 복잡성, 고립 될 때 특히 신경 네트워크 내에 있을 때, 완전히 이해 되지 않았습니다. 우리는 2D 신경 배양의 형광 심상에서 수지상 분기의 방향을 자동 측정할 수 있는 새로운 계산 도구인 SOA (세분화 및 방향 분석)를 개발했습니다. Python으로 작성된 SOA는 세분화를 사용하여 수지상 분기를 이미지 배경과 구별하고 각 분기의 공간 방향에 데이터베이스를 축적합니다. 그런 다음 데이터베이스는 네트워크에서 수지상 분기의 방향 분포 및 병렬 수지상 분기 성장의 보급과 같은 형태학적 매개 변수를 계산하는 데 사용됩니다. 얻어진 데이터는 뉴런 활동 및 생물학 및 약리학 자극에 응하여 원달의 구조적 변화를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다.

문화에서 수지상 네트워크의 이미지에 대한 대표적인 분석이 수행되었습니다. 세포는 바란 외에 의해 설명된 바와 같이 추출되었다. 16,17. 간략하게, 해마 세포는 산후 쥐의 두뇌에서 추출되고 1-2 주 동안 2D 유리 덮개에 경작되었습니다. 배양은 수지상 단백질 마커, 마이크로튜드 관련 단백질 2(MAP2)에 대한 항체를 사용하여 간접면역형광을 통해 고정및 염색하였다. 수지상 네트워크의 이미지는 형광 현미경을 사용하여 수집되었고, 10개의 이미지는 SOA를 사용하여 처리되었다.
도 1 은 수지상 네트워크 분석을 위한 일반적인 SOA 워크플로우를 보여 주며. 입력은 2D 형광 현미경 이미지입니다. 이미지 세분화는 두 단계로 수행됩니다: 첫 번째 단계는 수지상 분기를 선으로 식별하고, 두 번째 단계는 사용자가 ...

제시된 것은 2D 형광 심상에서 신경 수지상 분기의 방향을 간단하고 직접 자동적으로 측정할 수 있는 계산 도구입니다.

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology ...

SOA는 복잡한 2D 라인 네트워크의 이미지에서 중요한 형태학적 정보를 식별, 세분화 및 추출하기 위한 사용자 친화적인 인터페이스를 제공하는 자동화된 도구입니다. 작업 프로세스는 간단하고 직관적이며 데이터를 즉시 쉽게 가져옵니다. 또한 SOA는 적응력이 뛰어나고 유연하기 때문에 다른 애플리케이션을 위해 분석 용량을 확장할 수 있습니다.SOA는 비신경 세포의 네트워크, 세포 골격에 의해 생성된 복잡한 구조물 및 나노튜브와 같은 비생물학적 네트워크와 같은 다른 유형의 2D 네트워크의 분석에 사용될 수 있다. 웹 페이지를 열고 SOA를 찾습니다. 지퍼 폴더를 지퍼, 두 번 클릭하여 zip 파일을 다운로드합니다.마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 추출 파일을 선택하여 폴더의 압축을 풀수 있습니다. 추출된 파일에 대한 경로를 표시하는 대상 주소 텍스트 상자에서 열리는 옵션 창에서 추출 경로를 관찰합니다. 다음으로 추출된 SOA 파일을 열고 SOA.exe 두 번 클릭합니다.검은 색 창이 열리기를 기다린 후 응용 프로그램이 나타납니다. SOA 뷰어 업로드 메뉴 모음에서 파일을 선택한 다음 컴퓨터 파일에서 이미지를 선택하고 클릭합니다. 열려 있는 클릭하고 파일의 경로를 관찰한 다음 다음을 클릭합니다.가장자리의 세분화 최적화의 경우 임계값을 선택하고 숫자를 입력하여 디스플레이의 임계값을 조정합니다. 병합 선에서는 병합및 숫자를 입력하는 최소 거리를 선택하고, 병합할 최소 각도를 선택하여 디스플레이에 병합할 최소 거리를 조정하여 병합할 수 있는 최소 각도를 선택하여 병합하고 숫자를 입력합니다. 그런 다음 미리 보기 세분화 이미지 만들기를 클릭하고 매개 변수를 변경하여 세그먼트의 최대 식별을 달성합니다.속성을 변경해야 하는 경우 닫기 창 버튼을 클릭하고 병합할 최소 거리와 각도로 임계값을 재조정합니다. 출력 파일을 만들려면 분석 그래프에서 세분화 이미지를 시각화하려면 확인을 누릅니다. 나타나는 창에서 xlsx 파일이 저장되는 위치를 선택합니다.파일 이름을 삽입한 다음 저장을 선택하고 데이터가 있는 xlsx 파일을 만들고 저장할 때까지 기다립니다. 이전에 정의된 뷰 사이를 앞뒤로 이동하려면 앞뒤로 단추를 사용합니다. 확대/축소 버튼을 눌러 패닝 및 확대/축소를 활성화한 다음 마우스를 원하는 위치로 이동합니다.그런 다음 왼쪽 마우스 버튼을 길게 누르고 길게 누른 다음 새 위치로 드래그하여 그림을 이동합니다. 마우스 버튼을 놓고 이미지의 선택한 점이 새 위치에 나타납니다. X 또는 Y 키를 길게 누르면 축의 모션을 제한합니다.확대/축소하려면 오른쪽 마우스 버튼을 길게 누르고 새 위치로 드래그합니다. 오른쪽으로 이동하여 x축을 확대하고 왼쪽으로 이동하여 x축을 축소합니다. 위아래 모션에서 y축에서도 동일한 작업을 수행합니다.확대/축소 할 때 마우스 아래의 점이 고정되어 있으므로 해당 점을 확대하거나 축소 할 수 있습니다. 수정자 키, X, Y 또는 컨트롤을 사용하여 줌을 X, Y 또는 종횡비 보존으로 제한합니다. 확대/축소를 활성화하여 사각형 모드로 이동하려면 확대/축소를 클릭하여 사각형 단추를 클릭합니다.커서를 이미지 위에 놓고 왼쪽 마우스 버튼을 누릅니다. 단추를 들고 마우스를 새 위치로 드래그하여 직사각형 영역을 정의합니다. 서브플롯 구성 도구를 사용하여 서브플롯의 모양을 구성합니다.파일 저장 대화를 열려면 저장 단추를 클릭하고 파일을 적절한 형식으로 저장합니다. 일반적인 SOA 워크플로우는 형광 방지 MAP2 항체로 레이블이 부착된 수지상 네트워크의 대표적인 2D 이미지에 적용됩니다. SOA의 GUI를 사용하면 원본 이미지를 분할된 이미지와 비교할 수 있으며 세분화 설정에 대한 변경 사항이 미치는 영향을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.수지상 분기는 병렬 및 비병렬로 분류됩니다. 분석이 완료되면 테스트된 범위 내의 병렬 분기 수를 추출하여 주파수 그래프로 플로팅합니다. 수지상 분기 간의 병렬 성장 정도가 임의인지 또는 지시되는지 여부를 이해하기 위해, 이 그래프의 결과는 배양에서 수지상 분기와 동일한 수의 선의 무작위 성장 시뮬레이션에서 추출한 것과 비교된다.그런 다음 SOA는 병렬 분기 간의 거리뿐만 아니라 병렬 및 비 병렬 수지상 분기의 길이와 평균 길이를 측정합니다. 우선성장 방향이 존재하는지 여부를 결정하기 위해 SOA는 수지상 분기의 성장 각도분포를 표시하여 각 그룹의 바람직한 성장 방향과 특정 수지상 지점을 신속하게 식별할 수 있도록 합니다. SOA 출력은 보다 심층적이고 복잡한 분석을 수행하는 도구의 데이터베이스로 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY 조직 투명화를 통한 온전한 신경 수상돌기의 이미징 및 정량화. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오에서는 컨포칼 현미경 및 3D 재구성 기술을 사용하여 수지상 가지, 척추 형태 및 신경 분포를 조사하기 위해 제거된 마우스 뇌의 준비, 이미징 및 분석을 보여줍니다.

Confocal Microscopy Imaging of intact dendritic arbors and spine morphology in a cleared mouse brain(투명화된 쥐 뇌에서 온전한 수지상 가지와 척추 형태에 대한 컨포칼 현미경 이미징)

출처: Ting, C., et al., 열과 층의 수지상 형태 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 초파리 뇌를 준비하고, 공초점 현미경으로 GFP 표지 수질 수상돌기의 수평 및 정면 이미지 스택을 캡처하고, 층과 열에 걸쳐 형태를 분석하기 위한 3D 재구성을 생성하는 절차를 보여줍니다.

Drosophila Medulla 층과 기둥에 걸친 수지상 형태 분석

출처: Gouder, et. al. 인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생된 피라미드 뉴런의 수지상 가시의 3차원 정량화. J. Vis. 경험. (2015).이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 형질도입된 면역 표지 피라미드 뉴런에서 수지상 가시의 이미징 및 분석을 보여줍니다. 배경 소음이 감소하고 수상돌기가 직경과 길이를 추정하여 추적됩니다. 자동화된 척추 분할에는 수상돌기 및 척추 치수에 대한 매개변수 설정과 척추 분류가 포함됩니다. 3D 모델이 생성되고 분석을 위해 내보내집니다.

공초점 현미경 이미징을 사용한 수지상 가시의 정량화

우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

여기, 우리는 열 및 레이어 초파리 수질 신경 세포의 수지상 라우팅을 분석하는 방법을 보여줍니다. 워크 플로우는 추적 기준 열 배열 수지상 아버를 등록하기위한 3 차원 공간에서 수지상 구조를 분석하기위한 이미지 품질과 연산 툴을 개선하기 위해 이중 - 뷰 영상 법을 포함한다.

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

이 프로토콜에서 초파리, 수지상 morphogenesis의 연구를 위해 사용 될 수 있는 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)의 정량 분석에 집중 한다.

초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

여기에서는 Drosophila 애벌레 뇌의 실시간 준비에서 매우 운동성 수지상 필로포디아를 이미지화하기 위해 사용한 방법과 수상돌기의 정량적 평가를 위해 시간 경과 3D 이미징 데이터 세트를 정량화하기 위해 개발한 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 개발에 역학.

초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

우리는 신경 화학적 및 행동 적 이상을 뒷받침 할 수있는 뉴런과 수지상 척추의 잠재적 인 형태 학적 변화를 평가하는 데 중요한 피라미드 뉴런에 라벨을 지정하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

신경 수지상 형태는 종종 기능의 근간을 이수합니다. 실제로, 뉴런의 발달에 영향을 미치는 많은 질병 프로세스는 형태학적 표현형으로 나타납니다. 이 프로토콜은 그대로 수지상 식소및 연관된 척추를 분석하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다.

선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화

수지상 가시는 대부분의 흥분성 시냅스의 시냅스 후 구획입니다. 수지상 척추 형태의 변화는 신경 발달, 노화, 학습 및 많은 신경 및 정신 장애 중에 발생하며, 이는 신뢰할 수 있는 수지상 척추 분석의 중요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용하여 수상돌기 척추 형태를 정확하고 재현성 있게 정량화하는 방법을 설명합니다.

자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화

배우세요 SOA를 활용한 2D 형광 이미지에서 수지상 가지의 방향과 형태를 자동 분석하는 방법입니다. 이 계산 도구는 신경망 성장 패턴을 신속하게 식별하여 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

수지상 가지 및 방향자동 식별

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