광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사를 사용하여 안구 약물 전달 시스템의 생체 내 측두 체 이미징

우리는 경내 주입 후 눈에 리포좀의 스파티오 측두분포를 비침습적으로 연구하기 위해 광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사(CLM)의 사용을 위한 프로토콜을 제시한다.

이 프로토콜은 수정이 최적의 약물 전달 시스템을 설계하는 데 중요한 조직 거주 시간에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해 새로운 제제의 검사를 용이하게합니다. 이 기술은 비침습적이며 실시간 이미징을 허용하여 샘플링을 위해 동물의 과도한 사용을 줄입니다. 약물 전달 시스템은 단순히 하나의 나노 담체에 치료 약물 및 이미징 moiety를 포함시켜 이미징 및 치료 응용 프로그램을 위해 재설계 될 수 있습니다.

이것은 암과 전염병 치료에 유용한 응용 프로그램이 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 선임 연구원 인 라샤 Msallam이 될 것입니다. 우선, 수축 주사 2시간 전에, 에반스 블루또는 EB킬로그램당 2.5밀리그램의 꼬리를 통해 마우스를 정맥내로 주입한다. 5%의 이소플루란으로 마우스를 분리한 후 마우스를 코 콘으로 옮기고 가열 패드에 진정된 마우스를 유지합니다.

그런 다음, 주입 할 눈 근처 수염을 손질. 눈에 직접 0.5%의 프록시메타카인 염산염 용액을 주입합니다. 다음으로, 형광 리포솜이 장착된 32게이지 바늘을 장착한 10마이크로리터 유리 주사기를 적재하고 기포가 주사기에 존재하지 않도록 합니다.

트위저를 사용하여 결막을 들어 올리고 천천히 리포솜을 하위 경련 공간에 주입한 다음 바늘을 천천히 철회하여 다시 흐르지 못하게 합니다. 형광 리포솜으로 채워진 결점의 형성을 보장합니다. 눈에 1% 퍼지산 드롭을 관리하고 의식을 되찾을 때까지 마우스를 모니터링합니다.

CLM 시스템을 켭분입니다. 프로브를 CLM 시스템에 연결합니다. 이 시점에서 필드 오브 뷰 및 수집 파일의 위치를 선택합니다.

레이저 강도를 조정하여 형광 DHPE에 대한 형광 검출이 선형 범위에 있는지 확인하고, 서로 다른 시점에서 촬영한 이미지 간의 비교를 위해 강도를 일관되게 유지합니다. 시스템이 15분 동안 워밍업된 후 각 레이저에 대한 클렌징, 헹구기 및 플루오로-4 솔루션을 포함하는 교정 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 시스템을 교정합니다. 간단히 말해서, 클렌징 바이알에 각각 5초 동안 팁을 침지한 다음 헹구는 바이알에 침지하여 교정을 시작합니다.

배경 녹화를 위해 팁을 공중에 남겨두고 프로브의 다양한 섬유에서 배경 값을 정상화하여 이미지 균일성을 보장합니다. 다시, 클렌징 유리병에 5 초 동안 팁을 담그고 헹기 유리병에 담급. 다음으로, 신호 값을 정상화하기 위해 5초 동안 플루오로-4 488-나노미터를 함유한 바이알에 팁을 침수한다.

클렌징 바이알에서 5초 동안 팁 침지와 헹구는 바이알을 반복합니다. 이전 단계에서 기록된 형광 신호가 사라질 때까지 헹구는 유리병에 팁을 보관하십시오. 이어서, 플루오로-4 660나노미터를 함유하는 바이알에서 팁을 전달하여 프로브내의 상이한 섬유로부터 신호 값을 정상화한다.

보정 후 프로브 배경에 대한 값이 100 미만인지 확인합니다. 그렇지 않으면 면 팁 어플리케이터로 프로브를 반복 세척하십시오. 가열 패드가 부착 된 동물 온도 컨트롤러를 켜고 온도를 섭씨 37도로 조정합니다.

수술 커튼으로 가열 패드를 덮은 후 가열 패드에 코 콘을 고정합니다. 유도 챔버에서 5%이소플루란을 사용하여 마우스를 분리한 후 마우스를 코 콘으로 옮기고 가열 패드에 진정된 마우스를 유지합니다. 이어서, 마취제 0.5%의 프록시메타카인 염산염 용액을 눈에 주입한다.

안구 표면을 세척하고 렌즈의 결정화를 피하기 위해 식염수 방울을 떨어 뜨려 눈을 윤활하게하십시오. 이어서, 현미경의 안면을 회전시키고 조정하여 마우스 눈을 인체공학적으로 0.67배 배율로 직접 초점으로 본다. 레이저를 켜고 프로브를 눈 부위에 직접 펜처럼 배치하여 이미지화합니다.

그런 다음, 관심 영역에서 눈의 형광을 관찰하기 위해 수집 기록을 시작합니다. 모든 영역이 눈 맵에 따라 플래그를 지정하고 레이블이 지정되어 정확한 프레임에서 정확한 프로브 위치를 알 때 레코딩을 중지합니다. 수집 파일은 이전에 선택한 위치에 있는 비디오 파일로 자동으로 저장됩니다.

형광 화상 진찰은 clera와 각막 지구 사이 명백한 분화를 밝혔습니다. 에피클레라와 결막의 높은 혈관화는 eb를 가진 빨갛게 얼룩진 clera 지구를 일으키는 원인이 되었습니다. 혈관이 없는 각막은 검은 색으로 나타났다. 반두와 클레라의 대조 형광은 7 일 연구에서 관찰되었다.

플루오레세인 염료 주입 대조군 마우스는 리포솜 유래 형광의 특이성을 확인하였다. 형광 강도는 1 일과 3 일에 높았다. 녹색 형광은 시간이 지남에 따라 림푸스와 clera 영역의 리포솜 감소를 추진했다.

현세적 팔다리와 우수한 팔다리 지역에서 1일부터 3일까지 의형신호의 차이는 현세적 인 사지 부위, 특히 각막 주변지역에 중립적 인 리포좀을 선호하는 것을 나타내는 중요하지 않았다. 주사 후 날에 현세및 우수한 부위의 경우, 클론의 형광은 림푸스보다 6배 높았다. 셋째와 일곱 번째 날에 의해, 리포솜은 안구 통관 메커니즘에 기인하는 시간적 및 우수한 지역에 있는 경막에서 현저하게 감소되었습니다.

가장 낮은 양의 형광은 주입 부위로부터의 거리로 인해 비강 및 열등한 지역에서 검출되었다. 레코딩이 중지되기 전에 눈 맵에 따라 플렉 프레임을 레이블지정하는 것이 중요합니다. 레이저 강도를 일관되게 유지하고 다양한 실험에서 적절한 비교를 위해 최대 배경 값을 정의합니다.

납 제형의 식별에 따라, 동물에 대한 포괄적인 약동및 생체 분배 연구는 약물의 생체 이용률을 연구하고, 그들의 제형의 치료 효능을 검증하기 위하여 수행될 수 있다.