Name: 드로소필라 오키테의 핵 이주 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: 배우세요 Drosophila 오키테 핵 이주를 실시간 현미경으로 관찰하는 방법을. 12시간 동안 생체 상태를 유지하며 세포 이동 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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우리는 원래 프로토콜을 개발하고 우리와 함께 그림 3의 몇 가지 그래픽 요소를 공유 장 앙투안 레페산트와 니콜라스 티소트에 매우 감사드립니다. 그림 4의 사진을 찍은 패니 롤랜드 고셀린에게 감사드립니다. 우리는 또한이 기술의 개량에 기여 도움이 토론에 기여한 다른 실험실 구성원과 이 원고를 개선하는 데 도움이 그의 의견에 대한 나다니엘 Henneman에 감사드립니다. 우리는 프랑스 바이오 이미징 (ANR-10-INBS-04)의 회원 인 자크 모노드 연구소의 이마고세인 핵심 시설을 인정합니다. Maëlys Loh는 프랑스 연구부(MESRI)의 박사 학위 펠로우십의 지원을 받고 있습니다. 앙투안 구이체와 프레드 버나드는 ARC (그랜트 PJA20181208148), 협회 데 엔트레프리즈 콘트레 르 암 (그랜트 게플루크 2020 #221366)과 IdEx Université 드 파리 (ANR-18-IDEX-0001)의 출현 보조금에 의해 지원되었다.

1. 이미징 중간 준비
<ol><li>사용 당일 신선한 미디어를 준비하십시오. 슈나이더 배지의 파이펫 200 μL (L-글루타민과 0.40 g/L의 NaHCO3은 10% 열 불활성 태아 송아지 혈청, 페니실린 의 100 U/mL, 그리고 100 mg/mL의 연쇄상 구균)로 보완되었습니다.</li>
	<li>인슐린 의 30 μL 와 보충 10 mg/mL.</li>
	<li>열 불활성 태아 종아리 세럼 4 μL을 추가합니다.</li>
</ol>2. 관측실 준비
<ol><li>파이펫 팁으로 천공슬라이드(도 4D)의아래쪽 구멍 주위에 소량의 실리콘 그리스를 발라주세요.</li>
	<li>두께 0.13-0.16mm의 24 x 50mm 커버슬립을 배치합니다.</li>
	<li>파이펫 팁의 넓은 끝으로 커버슬립을 밀봉하고슬라이드(도 4F,G)에실리콘 링 내부를 만들기 위해 실리콘을 평평하게 하기 위해 커버슬립에 압력을 가한다.</li>
</ol>3. 난소 해부
<ol><li>CO2 패드에서 원하는 표현형의 암컷 비행을 마취시화한다.</li>
	<li>해부 우물에서 이미징 배지의 150 μL에서 여성을이송한다(도 4H).</li>
	<li>포셉으로 흉부를 잡고 두 번째 포셉으로 등복부 큐티클을 꼬집어 한 여성을 엽니다.</li>
	<li>큐티클 개구부 시 쉽게 볼 수 있는 난소 쌍을 분리하고 분리합니다.</li>
	<li>자궁, 배기 및 근육 칼집(그림 4I)을조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>이미징 배지의 10-15 μL 을 떨어 뜨리고 이미징 챔버에 난소 1개를 전달한다(도4J,K).</li>
</ol>4. 달걀 챔버 격리
<ol><li>난소를 분리하려면 난소의 후방 끝을 바늘로 (이전 단계로) 잡습니다. 다른 바늘로 세균을 조심스럽게 잡아당겨 바오리올을 따로 떼어 놓습니다.</li>
	<li>계란 챔버에 나머지 근육 칼집을 제거; 칼집을 들고 다른 하나는 큰 챔버를 통해 ovariole에 당기고 (단계 9 이상).</li>
	<li>흔들리지 않는 오바리오레가 가라앉고 커버슬립에 연락하도록 허용합니다.</li>
	<li>집게의 도움으로 미세 챔버에서 늦은 단계와 난소의 나머지 부분을 제거합니다. 조심스럽게 획득을 용이하게하기 위해 바늘로 다른 사람으로부터 혈관을 거리(도 4L).</li>
</ol>5. 관측실 폐쇄
<ol><li>투과성 멤브레인의 작은 사각형(10 x 10mm)을 자른다(도4M,N).</li>
	<li>어떤 기포(도 4O)를추방하기 위해 이미징 매체의 상단에 멤브레인을 신중하게 적용합니다.</li>
	<li>밀폐막의 윤곽에 우물 주위에 할로카본 오일의 얇은 층으로 챔버를 밀봉(도 4P,Q).</li>
</ol>6. 이미징
<ol><li>40배 목표(HCX PL 아포, 1.25NA, 오일 침수)를 사용하여 반전된 현미경의 슬라이드 홀더에 이미징 설정을 배치합니다.</li>
	<li>핵이 마이그레이션할 준비가 된 다른 단계 6 난모세포의 위치를 찾아 저장합니다.</li>
	<li>488 및 561 nm 레이저를 설정합니다. 150mW의 측정 된 출력 레이저 전력으로 레이저 전력의 30 %와 300 ms 및 500 ms 노출을 각각 사용합니다.</li>
	<li>실험을 설정합니다. 핵을 중심으로 1 μm의 간격으로 15 분-41 섹션의 간격으로 12 h의 시간 경과를 취하십시오. 참고: 위에서 설명한 노출 시간에 따라 이 설정을 사용하면 약 45초에서 한 위치를 획득할 수 있습니다. 위치 변경으로 인해 지연이 있으므로 이러한 조건에서 최대 12개의 포지션을 설정하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>7. 이미지 분석
<ol><li>플러그인 직교 보기를 사용하여 소프트웨어 피지에서 영화를 처리하고 수동으로 핵을 추적합니다.</li>
</ol><img alt="현미경으로 초파리 배아 분석을 위한 미세 주입 기술 시퀀스." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: 단계 마이크로 챔버 장착 사진. (A, B, C) 필요한 도구의 준비 : 잘 플레이트, 집게, 바늘, 이미징 매체, 실리콘 그리스, 투과 성 멤브레인 및 알루미늄 슬라이드를 해부. (D)파이펫 팁이 있는 알루미늄 슬라이드 뒷면의 실리콘 그리스를 적용합니다. (E)유리 커버슬립이 실리콘 그리스에 붙어 챔버의 바닥을 만듭니다. (F,G) 피펫 팁의 넓은 극단으로 커버슬립의 압력 적용으로 챔버 내부의 조인트를 만듭니다. (H,I) 이미징 미디어에서 플라이 난소의 해부. (J)마이크로 챔버에서 이미징 매체의 한 방울의 파이프팅. (K,L) 바늘을 사용하여 마이크로 챔버에서 혈관의 분리. (M,N,O) 투과성 멤브레인은 10 x 10mm 정사각형으로 절단하고 마이크로 챔버에서 배지의 방울 위에 배치합니다. (P,Q) 할로탄소 오일마이크로 챔버밀봉. 샘플을 이미지화할 준비가 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol><li>Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li>
<li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891(2009).</li>
<li>Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li>
<li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila%3A+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+and+round+gets+you+somewhere%3A+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li>
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<li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li>
<li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li>
<li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).</li>
<li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Oogenesis%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

다른 프로토콜은 실시간 이미징 분석12,13에대한 Drosophila 계란 챔버 전 vivo를 준비하고 문화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 참신은 중공 알루미늄 슬라이드, 커버슬립 및 O2/CO2 투과성 멤브레인을 사용하여 생성된 이미징 챔버의 사용입니다. 이 셋업의 주요 장점은 샘플에 압력을 가하지 않고 Z의 움직임을 제한하는 것입니다. 따라서, 난모세포는 여전히 자유롭게 움직일 수 있으며, 이것이 첫 번째, 40x 목표가 사용되고 둘째, z-스택이 40 μm을 따라 획득되는 반면, 난소는 6단계에서 약 20 μm 높이이다.
이 프로토콜은 비교적 간단하지만 각 단계는 분석에 중요합니다. 마이크로 챔버의 준비, 투과성 멤브레인 및 챔버의 밀봉은 가스 교환을 허용하고 이미징 매체의 건조를 방지하고, 따라서, 샘플. ...

몇 년 동안 드로소필라 오키테는 핵 이주를 연구하는 모델 시스템으로 부상했습니다. Drosophila oocyte는 계란 챔버에게 불린 다세포 구조물에서 발전합니다. 계란 챔버는 여포 체 세포의 상피 층으로 둘러싸인 16 개의 생식 세포 (15 명의 간호사 세포 및 난미세포)를 포함합니다. 계란 챔버 개발은 14 단계로 세분화되었습니다(그림 1A),그 동안 oocyte 성장하고 배아의 초기 개발에 필요한 매장량을 축적할 것이다. 개발 중, 현미경 재구성 및 모계 결정요인의 비대칭 수송시, 난소세포는 안테로-등대 및 등류 복부를 따라 편광한다. 이 축은 배아의 후속 극성 축과 이 난미1의수정에서 발생하는 성인을 결정한다. oogenesis 동안, 핵은 oocyte에 비대칭 위치를 채택합니다. 6단계에서, 핵은 세포에 중심을 두고 있다. 난십체에 의해 수신되는 후방 여포 세포에 의해 방출되는 신호를 아직 확인되지 않은 후, 핵은 7단계(도 1B)2,3단계에서전방 및 측면 혈장 막 사이의 교차를 향해 이동한다. 이러한 비대칭 위치는 등대-복부 축의 판정을 유도하기 위해 요구된다.
<img alt="난모세포 및 간호사 세포 핵 단계를 보여주는 초파리 난실 챔버의 형광 현미경." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 드로소필라 멜라노가스터 달걀 챔버. (A)핵 봉투와 플라즈마 멤브레인에 라벨을 붙이는 유비-PH-RFP를 표시하는 Fs(2)Ket-GFP를 발현하는 형질전환 파리로부터의 고정 된 오방. ovariole는 다른 단계에서 계란 챔버를 개발로 구성되어 있습니다. 성숙은 배아 줄기 세포가 상주하는 전방 팁(왼쪽)에서 발아마리움을 가진 전방 후방 축을 따라 증가하고 후방 끝(오른쪽)에서 구층이 증가합니다. (B)핵이 난낭을 중심으로 하는 oogenesis(왼쪽)의 6단계에서 디스크 공초점 현미경을 회전시킴으로써 살아있는 계란 챔버의 Z-프로젝션. 핵은 전방 플라즈마 멤브레인 (난소와 간호사 세포 사이)와 측면 혈장 막 (난낭과 여포 세포 사이)와 접촉하여 단계 7 (오른쪽)에서 비대칭 위치를 채택하기 위해 마이그레이션됩니다. 이러한 위치는 등쪽 측의 결단을 유도하고, 따라서 계란 챔버의 등복부 축을 유도할 것이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
수십 년 동안, 이 핵 이주는 면역 염색에 의하여 고정된 조직에 공부되었습니다. 이 접근 방식은 특히이 과정이 마이크로 튜블러4,5의조밀 한 네트워크에 따라 달라지는 것을 입증 할 수 있게했습니다. 최근에는 몇 시간 동안 난낭의 라이브 이미징과 호환되는 조건을 제공하는 프로토콜을 개발하여 이 과정을 동적으로6으로연구할 수 있게 되었습니다.
따라서, 처음으로, 우리는 핵이 이동 하는 동안 우대 및 특성 궤적을 설명할 수 있었다, 전방 플라즈마 멤브레인을 따라 하나 (APM) 및 oocyte의 측면 플라즈마 멤브레인을 따라 다른(그림 2). 이러한 최신 결과는 핵 마이그레이션과 같은 동적 프로세스를 연구할 때 실시간 이미징 프로토콜의 중요성을 강조합니다.
<img alt="&lt;span&gt;난자 형성 다이어그램: 난모세포, 간호사 세포, 난포 세포; 축 방향 및 세포 분화.&lt;/span&gt;" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 핵의 다른 이동 경로의 회로도 표현. oogenesis의 단계 6에서, oocyte는 중앙 핵을 가진 큰 세포입니다. 이 단계에서, 전방 후방 극성 축은 여포 세포와 접촉하여 난낭의 후방/측면 플라즈마 멤브레인으로 설정되고 전방 플라즈마 멤브레인(노란색)은 간호사 세포2와접촉한다. 우리는 이전에 핵이 전방 플라즈마 막 (APM)을 따라, 측면 혈장 막 (LPM)을 따라 또는 세포질 (STAD, 곧장 안테로-등쪽 피질)을 통해 이동할 수 있다고 보고했다6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
난구 핵 이동은 약 3 h6의현상이며, 지금까지 실제 마이그레이션의 시작을 촉발시키는 이벤트는 알 수 없습니다. 이주의 시작은 또한 이 기계장치를 공부하는 데 이용된 단백질 돌연변이에 의해 연기될 수 있습니다. 이러한 알려지지 않은 변수는 오랜 기간(10-12h)에 걸쳐 이미지를 획득하도록 동기를 부여했습니다. 따라서 난모세포가 살아 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 계란 챔버가 발전함에 따라 구형에서 타원형 모양으로 안테로 후방 축을 따라 길게 변합니다. 이러한 신장은 1단계에서 8단계로, 안후축7에수직으로 발생하는 여포 세포의 회전에 의해 구동된다. 또한, 맥동 특성이있는 근육의 관 칼집은 계란 챔버를 둘러싸고 있습니다. 그것의 생리적 기능은 지속적으로 oviduct를 향해 개발 여포를 밀어하는 것입니다 8. 해부 후 계란 챔버의 진동을 유발하는 움직임을 제한하기 위해 높이 150 μm을 측정하는 관측 마이크로 챔버(도 3A)를설계했습니다. 이 높이는 10단계와 11단계에서 여포의 크기보다 약간 높습니다. 계란 챔버의 회전을 유지하면서 시료의 수직 이동을 상당히 제한하여 여포 발달에 제한된 결함을 초래합니다. 그런 다음 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 다중 위치 시간 경과 획득에 의해 해부 된 계란 챔버에 12 시간 동안 라이브 이미징을 수행합니다. 여기서 우리는 6단계와 7단계 사이의 난소핵 이주를 연구하기 위한 우리의 의정서를 설명합니다.
<img alt="미세유체 챔버 다이어그램; 생물학적 관찰을 위한 치수, 조립 세부 사항 및 실리콘 그리스 사용." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 도 3: 관측실의 회로도 표현. (A)(상단 보기) 슬라이드 의 중간에 드릴웰의 높이 (A)와 둘레 (A')와 알루미늄 슬라이드의 정확한 치수. (B)(하단 뷰) 우물을 차단하는 커버슬립은 실리콘 그리스로 슬라이드에 밀봉된다. (C)(최고 보기) 해부 된 ovarioles는 가스 투과성 멤브레인에 의해 덮여 있는 화상 진찰 매체에서 개발한다. 할로카본 오일은 멤브레인을 안정화하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
핵 이주를 따르고 난마세포의 궤적을 정밀하게 평가하기 위해서는 핵 봉투와 플라즈마 멤브레인 모두에 대한 마커가 필요합니다. 이 목표를 가지고, 높은 신호 / 소음 비율을 가지고 라이브 이미징의 과정을 통해 퇴색하지 않는 두 개의 전간이 선택되었습니다. 플라즈마 멤브레인에 라벨을 붙이기 위해 RFP에 융합된 인간 인지질제 C ∂1(PLC∂1)의 Pleckstrin Homology(PH) 도메인을 인코딩하는 P[ubi-PH-RFP]를 사용하는 것이 좋습니다. 본 PH 도메인은난소9의혈장 막을 따라 분포된 인포이노시타이드 PI(4,5)P2에 결합한다. 핵 봉투의 경우, GFP가 Drosophila ß-importin을 인코딩하는 유전자 내에 GFP가 삽입되는 P[PPT-un1]Fs(2)는 동질적이고 강렬한신호(10)를표시한다. 어린 파리(1~2일)는 난소 해부 24-48h 전에 건조한 효모가 들어있는 신선한 유리병에 놓입니다.
이 라이브 이미징 분석의 경우, 시료에 대해 반응성이 없는 1mm 두께의 알루미늄 조각이 현미경 슬라이드의 치수로 절단되었습니다. 슬라이드 중앙에 16mm 직경의 구멍이 있어 0.85mm로 반소되어 있습니다. 이 카운터보어는 깊이가 150 μm(도3A)인추가 6mm 직경 구멍을 가지고 있습니다. 커버슬립은 알루미늄챔버(도 3B)의바닥에 실리콘 그리스(시료에 대한 불활성)로 접착된다. 샘플을 중간 채워진 우물에 배치한 후,O2/CO2교환에 투과가능한 멤브레인을 매체 위에 배치하고 할로카본 오일(도3C)에둘러싸여 있다.
해부에 대 한, 0.05 x 0.02 mm의 팁 치수를 가진 스테인레스 스틸 집게를 사용 하 여 하는 것이 좋습니다., 그리고 0.20 m m 직경 바늘 의 분리에 대 한(도 4B,C). 마이그레이션하는 핵은 카메라가 장착된 회전 디스크 공초점 반전 현미경 CSU-X1에 이미지됩니다. 다중 위치 이미지는 24°C에서 15분마다 타임랩트에 의해 획득되었다. 15분 간격을 통해 샘플에 대한 형광 단백질 및 광독성의 제한된 광표백으로 다중 위치 획득을 수행할 수 있습니다. 또한, 짧은 간격은 핵 궤적을 따르는 훨씬 더 유익한 데이터를 제공하지 않을 것입니다. 영화는 피지 소프트웨어(11)를 통해 처리및 분석됩니다.

<table><tbody><tr><td>마취 CO2 패드</td><td>Dutscher</td><td>789060</td><td>마취 파리</td></tr><tr><td>커버슬립 (24x50 mm)</td><td>니트 유리</td><td>VD12450Y100A</td><td>관찰실 준비</td></tr><tr><td>겸자 Dumont # 5</td><td>Carl Roth</td><td>K342.1</td><td>해부</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 바늘</td><td>Entosphinx</td><td>20</td><td>해부</td></tr><tr><td>열 비활성화 태아 송아지 혈청</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7524</td><td>이미징 매체</td></tr><tr><td>인슐린 용액 소 췌장</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10516 - 5ml</td><td>이미징 매체</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P0781</td><td>이미징 매체</td></tr><tr><td>투과성 멤브레인</td><td>Leica</td><td>11521746</td><td>관찰 챔버 준비</td></tr><tr><td>Schneider Medium</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-91500</td><td>이미징 매체</td></tr><tr><td>실리콘 그리스</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>335148</td><td>관측실 준비</td></tr><tr><td>스피닝 디스크 컨포칼</td><td>Zeiss</td><td>CSU-X1</td><td>핵 이동 관측</td></tr><tr><td>볼탈 레프 오일 10S</td><td>VWR</td><td>24627 - 188</td><td>관측 챔버 준비</td></tr></tbody></table>

드로소필라 오키테의 핵 이주

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

살아있는 세포 화상 진찰은 세포 내의 세포 운동, 세포 골격 재배열, 또는 극성 패터닝을 통제하는 세포 및 분자 기계장치를 이해하기 위하여 특히 필요합니다. 난소 핵 포지셔닝을 연구할 때, 라이브 이미징 기술은 이 과정의 역동적인 사건을 포착하는 데 필수적입니다. Drosophila 계란 챔버는 다세포 구조와 수많은 유전 도구의 큰 크기와 가용성 때문에이 현상을 연구 하는 우수한 모델 시스템. Drosophila 중간 oogenesis 도중, 핵은 microtubule 생성한 힘에 의해 중재된 비대칭 위치를 채택하기 위하여 oocyte 내의 중앙 위치에서 이동합니다. 핵의 이 이동 및 위치는 태아의 극성 축과 후속 성인 비행을 결정하기 위하여 필요합니다. 이 마이그레이션의 한 가지 특징은 3차원(3D)으로 발생하여 라이브 이미징이 필요하다는 것입니다. 따라서, 핵 이동을 규제하는 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 해부 된 계란 챔버를 배양하고 회전 디스크 공초점 현미경 을 사용하여 시간 경과 취득에 의해 12 시간 동안 라이브 이미징을 수행하는 프로토콜을 개발했습니다. 전반적으로, 우리의 조건은 우리가 오랜 시간 동안 Drosophila 계란 챔버를 보존 할 수 있습니다, 따라서 3D의 샘플의 많은 수에서 시각화 할 핵 마이그레이션의 완료를 가능하게.

마이그레이션하기 전에 핵은 동적이며 사전 마이그레이션으로 정의된 기간 동안 중앙 위치 주위의 진동이 발생합니다. 이 작은 움직임은 난모세포의 중간에 평형을 유지하는 밀고 당기는 힘의 균형을 반영한다. 핵의 궤적을 정량화함으로써, 우리는 APM과 LPM 궤적이 비슷한 비율을 가지고 있음을 보여 주었다. 우리는 핵과 혈장 멤브레인6사이의 첫 번째 접촉에 의해 궤적의 본질을 정의한다. 따라서, 핵은 이를 따라 미끄러지기 전에 APM 또는 LPM에 도달하여 두 혈장 멤브레인의 교차점에 도달한다(도5,영화 1-2). 또한, 우리는 뚜렷한 단서가 각 궤적을 선호한다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어, 난낭의 핵과 후방 막 사이에 클러스터된 중척추생물은 APM 궤적을 가능하게 한다. 반대로, 핵 봉투에 비대칭적으로 위치한 미세...

Drosophila에서,oocyte 핵은 oogenesis 도중 microtubule 의존적인 이주를 겪습니다. 여기서, 우리는 계란 챔버 전 vivo에라이브 이미징을 수행하여 마이그레이션을 따라 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 우리의 절차는 회전 디스크 공초점 현미경 검사를 사용하여 다중 위치 3D 타임 랩스 영화를 취득하기 위해 12 시간 동안 살아있는 계란 챔버를 유지합니다.

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

이 기술은 살아있는 화상 진찰 현미경 검사를 사용하여 oocyte 핵 이주와 같은 해부 Drosophila 계란 챔버에서 긴 생물학적 과정을 관찰할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 살아있는 화상 진찰 현미경 검사를 능력을 발휘하기 위하여 12 시간 동안 살아 있는 해부한 계란 방을 유지하는 방법을 설명합니다. 시작하려면, 파이펫 200 슈나이더 매체의 마이크로 리터와 보충 30 밀리 리터 당 10 밀리그램의 마이크로 리터, 다음 열 불활성화 태아 종아리 혈청의 네 마이크로 리터를 추가.파이펫 팁을 사용하여 구멍이 뚫린 슬라이드의 아래쪽에 있는 구멍 주위에 소량의 실리콘 그리스를 적용합니다. 커버슬립을 배치하고, 파이펫 팁의 넓은 끝을 사용하여 커버슬립에 압력을 가하여 실리콘 그리스를 평평하게 하여 슬라이드에 실리콘 링 내부를 만듭니다. 마취된 암컷 파리를 이미징 배지의 150마이크로리터를 함유한 해부 우물로 이송한다.암컷을 해부하려면 집게를 사용하여 흉부를 잡고 두 번째 집게로 등복부 표피를 꼬집습니다. 조심스럽게 자궁, oviduct 및 근육 칼집을 제거합니다. 큐티클 개구부시 보이는 난소 쌍을 분리하고 분리합니다.난소에 이미징 배지의 10-15 마이크로리터를 떨어뜨리고, 하나의 난소를 이미징 챔버로 옮기다. 혈관을 분리하려면 바늘을 사용하여 난소의 후방 끝을 잡습니다. 다른 바늘을 사용하여 바오리움을 따로 괴롭히기 위해 제마리움을 조심스럽게 당깁니다.한 바늘로 칼집을 잡고 계란 챔버에 남아있는 근육 칼집을 제거하기 위해 다른 바늘로 큰 챔버를 통해 ovariole을 당깁니다. 흔들리지 않는 오바리오레가 가라앉고 커버슬립에 연락하도록 허용합니다. 집게를 사용하여 소실에서 후반 단계와 난소의 나머지 부분을 제거합니다.바늘을 사용하여 오병의 거리를 조심스럽게 멀리하여 획득을 용이하게하십시오. 투과성 멤브레인의 작은 10 mm 사각형을 잘라냅니다. 이미징 매체 의 상단에 멤브레인을 조심스럽게 적용하여 기포를 배출합니다.그런 다음 멤브레인의 윤곽에 우물 주위에 할로카본 오일의 얇은 층으로 챔버를 밀메트로 밀봉. 반전된 현미경의 슬라이드 홀더에 이미징 설정을 배치하고 40X 목표를 사용합니다. 야생 형 계란 챔버의 난소 핵의 이동은 살아있는 이미징 현미경 을 사용하여 캡처되었습니다.핵은 두 혈장 멤브레인의 교차점에 도달하기 위하여 궤적을 따라 미끄러지기 전에 전방 플라즈마 막 또는 측측 혈장 막에 도달합니다. 막 기형, 무질서한 여포 세포, 기절한 세포 및 수축된 핵은 죽어가는 계란 챔버의 첫번째 표시입니다. 화상 진찰의 8 시간 전에 퇴화한 oocyte는 일반적으로 검출되지 않습니다.그러나, 조기 변성의 드문 경우는 해부 또는 장착 단계 중 문제로 인한 것입니다. 계란 챔버를 손상 그들의 생존을 손상. 그래서 섬세한 손 정밀 한 해부 및 마이크로 챔버의 준비는 가장 중요 한.이 절차를 통해 우리는 오낭 핵이 이주 하는 동안 세 가지 다른 궤적을 취할 수 있으며 다른 세포기관은 난구체 내에서 이러한 궤적을 조절할 수 있음을 시각화 할 수 있었습니다.

nuclear-migration-in-the-drosophila-oocyte

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한...

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

이 프로토콜에 설명된 직립 이미징 방법을 사용하면 발달 중인 Drosophila melanogaster 난자의 극을 자세히 시각화할 수 있습니다.  이 최종 보기는 여포 상피에서 여러 세포 유형의 배열과 형태에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

우리는 성숙한 초파리 난모세포의 수집, 준비 및 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 방법을 사용하면 염색체 거동과 방추체 조립 및 감수분열 중 기능을 시각화할 수 있습니다.

고정의 이미지 Prometaphase 및 중기 감수 분열의 I위한 기술<em&gt; 초파리</em&gt; 난 모세포

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

이 프로토콜은 생쥐 난모세포 시스템의 핵 모양과 내부 막이 없는 세포 소기관에 대한 세포골격의 물리적 영향을 문서화하기 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 이 프레임워크는 다른 세포 유형 및 컨텍스트에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

배우세요 Drosophila 오키테 핵 이주를 실시간 현미경으로 관찰하는 방법을. 12시간 동안 생체 상태를 유지하며 세포 이동 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

드로소필라 오키테의 핵 이주

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