Name: 섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 학습하세요 섬유아세포가 정의된 역학적 조건에서 자체 환경을 구축하고 조직하는 방법을 통해 방향성 조직을 생성하는 기술을. 이 프로토콜은 최대 48개 조건을 병렬로 비교할 수 있어 섬유증 질환의 기전 연구와 약물 선별에 활용됩니다.

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이 작품은 독일 심장 학회 (GLS를 위한 DGK 연구 펠로우십)와 독일 연구 재단(GLS 및 AD를 위한 IRTG 1816 프로젝트를 통해 DFG)에 의해 지원되었습니다. DFG 417880571 및 DFG TI 956/1-1 MT; MT 및 WHZ에 대한 SFB 1002 TP C04; WHZ에 대한 SFB 1002 TP S01; 및 WHZ에 대한 EXC 2067/1-390729940J). WHZ는 독일 연방 과학 교육부(프로젝트 IndiHEART를 통해 BMBF)와 독주 레두크(20CVD04)의 지원을 받고 있습니다. MT, WHZ 및 SL은 독일 심장 혈관 연구 센터 (DZHK)에 의해 지원됩니다.

GLS와 SL은 원고초안을 작성했습니다. 모든 저자는 프로토콜 개발에 기여하고 원고를 편집했습니다. TM, MT 및 WHZ는 myriamed GmbH. WHZ의 과학 고문입니다.

제시된 프로토콜은 1 차인간 CF에서 ECT의 생성을 기술합니다, 이는 그들의 세포외 매트릭스 환경에 이 세포의 기계적 충격을 공부하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
섬유아세포는 계획된 ECT 실험(0.75 x 106 세포/ECT)에 충분한 세포를 산출하기 위해 확장될 필요가 있다. 최상의 재현성을 위해, 2D 단층 배양에서 냉동 또는 조직 유래 섬유아세포를 각 통로 내에서 최대 80% 수렴하고 ECT 생성에 사용하기 전에(프로토콜 단계 3)에 사전 배양하는 것이 좋습니다. 1 차적인 인간 CF 단층및 유래 ECT를 배양하기 위하여는, CF에 적합한 상업적인 매체 및 보충교재를 사용하는 것이 좋습니다 ( 재료의 표 참조). 세럼을 위한 중간 보충은 표준 2D 배양에서 CF의 확장을 보장하는 데 매우 중요합니다. ECT 생성 및 추가 배양을 포함한 3D 배양에서 혈청이 없거나 낮은 혈청 조건을 사용하여 선택된 섬유아세포 유형에 ...

섬유성 질환의 연구에 있는 중요한 장애물은 섬유아세포및 그들의 병리학 적인 유도체의 행동에 통찰력을 제공하는 대표적인 인간 3D 조직 모형의 부족입니다. 섬유질 공정을 연구하기 위해, 표준 2D 배양 시스템은 분리된 섬유아세포가 비준수 2D 기판에서 배양할 때 α 부드러운 근육 액틴(SMA)으로 빠르게 변형되기 때문에 최적이 다합니다1,2,3. 따라서, 표준 2D 배양에서 섬유아세포는 규칙적인 "건강한" 조직 표현형을 반영하지 않는다3,4,5,6. 유연한 기판에 배양비(10kPa) 및 섬유성(35kPa) 조직 환경을 시뮬레이션하기 위해 도입되었지만, 병리생리학에 있어서 매우 중요한 제3차원이 부족하다. 조직 공학은 정의되고 실험적으로 튜닝할 수 있는 세포외 매트릭스(ECM)-컨텍스트에서 섬유아세포 배양을 허용함으로써 이러한 한계를 극복할 수 있는 기회를 제공하며, 예를 들어 세포성, ECM 조성 및 ECM 농도의 변경에 의해 조직 생체 역학을 결정할 수 있다.
섬유아세포를 사용하여 다양한 3D 모델이 생성되었습니다. 부동 디스크와 마이크로스피어는 첫 번째 디스크 중 하나였으며 콜라겐이 시간에 따라 리모델링되고 압축된다는 것을 보여줍니다. 섬유아세포는 콜라겐 피브릴에 견인력을 발휘하며, 성장 인자 베타 1(TGF-β1)을 변형시키는 것과 같은 프로 섬유성 제제의 첨가에 의해 촉진될 수 있는 과정입니다.8,9,10,11,12,13,14,15,16. 그러나 자유롭게 부동 배양은 제어된 외부 로딩을 허용하지 않으므로 지속적으로 축소 또는 압축 모델을 구성합니다. 시트와 같은 엔지니어링 조직은 조직의 생체 역학 적 특성, 즉 유니, bi, 다차축 또는 순환 균주 테스트를 통해 동종 적 특성을 연구 할 수있는 가능성을 열었습니다.17,18,19,20. 이러한 모델은 세포 골격 무결성 및 actomyosin 세포 골격 수축과 긍정적으로 상관 관계를 발견 된 조직 강성에 세포 수의 영향을 입증하기 위해, 예를 들어, 사용되었습니다18,19. 그러나 힘 변환기 및 앵커 포인트의 클램프 포인트 주변의 비 균일한 조직 변형에 의해 강제-균주 변환이 복잡하다는 점에 유의해야 합니다. 이 고유의 제한은 개 뼈 또는 고리 모양의 조직에 의해 우회 될 수 있습니다, 앵커 지점에서 일부 조직 집행을 제공21,22,23. 링 모양의 조직은 세포 콜라겐 하이드로겔을 링 모양의 금형에 분배하여 제조할 수 있습니다. 하이드로겔이 컴팩트함에 따라, 조직은 금형의 압축할 수 없는 내부 막대 주위에 형성되며, 이는 추가 조직 수축을 위한 저항을 제공합니다.24,25,26,27. 초기 및 전형적으로 최대 다짐 후, 조직은 정의된 조직 길이에서 원형 ECT를 더 억제하기 위해 조절 가능한 스페이서로 옮겨질 수도 있습니다.3,24,25,26,27,28,29,30. 생물물리학적 특성은 단방향 또는 동적 변형 하에서 적절한 부하 세포를 가진 표준 수평 또는 수직 변형 응력 장치에서 평가될 수 있습니다.3. 조직은 크게 균일 한 원형 구조를 가지고 있으며 바 / 후크 (앵커리지 포인트 및 / 또는 힘 변환기)에 보유 할 수 있기 때문에, 이들은 여전히 로딩 바 주위에 압축 영역을 둘러싸고 있지만, 이 형식은 클램핑에 비해 더 균일 한 변형을 허용3. 더욱이, 고정된 조직은 양극성 세포 모양을 유도하고, 세포는 이소성 견인을 촉진하는 힘 선을 따라 신장에 의해 조직력에 적응합니다31,32,33,34,35,36. 우리는 이전에 기능적인 긴장 긴장 실험에 있는 단 하나 뻣뻣한 극의 주위에 쥐와 인간 적인 심장 섬유아세포 (CF)에서 고리 모양 ECT를 적용하고 바이러스성 으로 변환된 섬유아세포를 사용하여 기능 연구의 이득 그리고 손실을 수행했습니다24,25,26 약리학 연구37. 추가, 우리는 ECT 모형에 있는 CF 매개한 섬유증에 있는 성다름을 확인할 수 있었습니다27.
상용 벤더( 자료 표 참조)에서 극저온 보존 CF로 획득한 1차 인간 CF로 본보기인 인간 ECT 생성을 위한 다음 프로토콜은 링 형 조직의 장점을 병렬 고콘텐츠 테스트를 위해 설계된 48웰 플랫폼을 위한 거시적 조직을 쉽게 생성하는 방법과 결합합니다.
중요한 것은, ECT 모형은 그밖 섬유아세포, 예를 들면, 피부 섬유아세포38,39의 조사에서 문서화된 사용과 함께 특정 섬유아세포 모형에 제한되지 않습니다. 더욱이, 환자의 생검에서 섬유아세포는 동등하게 잘 작동하고, 섬유아세포의 선택은 궁극적으로 해결될 과학적 질문에 달려 있습니다.
본 프로토콜에 기재된 ECT의 생성에 사용되는 플랫폼은 시판되는 48웰 3D 세포/조직 배양 플레이트(도 1A)이다. 48웰 플레이트의 도움으로 정의된 형상 및 기계적 부하하에서 ECT 형성 및 기능을 제조, 배양 및 모니터링하는 방법이 설명되어 있습니다. 형성된 ECT는 통합된 플렉시블 폴에 의해 유지되며, 기계적 하중은 서로 다른 경도(Shore A 값 36-89)를 사용하여 최종 목적에 따라 미세 조정될 수 있으며, 굽힘 강성에 영향을 가합니다. 해안A 값이 46인 폴을 추천합니다. 또한 이 프로토콜은 이전에 설명된 사용자 지정 원형 몰드와 호환되며, 여기서 ECT는 단일 뻣뻣한 rod37 주위에 유지된다. 이 금형의 치수는 그림 1B에 부여됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> 그림 1: 주조 금형의 회로도 표현. (A) 두 개의 유연한 기둥이 있는 주조 금형의 기술 도면 및 치수. 금형은 금형의 본체에서 이중 옹열극을 고정하는 짧은 벽에 의해 구분된 내부 둘레로 구성됩니다. 유연한 기둥은 서로 자유로운 수평 거리를 가지며 베이스에 연결되어 있습니다. 금형은 180 μL 주조 부피를 허용합니다. 각 금형의 우물은 배양 매체의 최소 600 μL의 부피 용량을 허용합니다. 다른 재료 조성물은 특정 강성을 가진 극을 생성하는 데 사용할 수 있습니다 (예를 들어, TM5MED-TM9MED). (B) 하나의 딱딱한 막대가 있는 링 모양의 금형의 기술 도면 및 치수. 이것은 ECT 주조 프로토콜37과 함께 사용할 수있는 뚜렷한 형상 및 기계적 환경을 가진 대체 금형입니다. 링 모양의 금형 조립 방법은 게시된 더 큰 형식28,41에서 적용되었습니다. 간단히 말해서, 이 방법은 (1) 폴리테트라플루오로틸렌(PTFE) 성형 스페이서(직경 8mm)를 폴리디메틸실록산(PDMS, 실리콘)으로 유리 접시(직경 60mm)로 부은, (2) PDMS 폴 홀더(1.5mm 직경)를 중앙에 고정하는 등(3mm)의 직경을 유지한다. 중공 공간 결과물은 180μL의 주조 부피를 허용합니다. 각 유리 접시는 여러 각각 금형 (예시 적으로 5 금형으로 표시)을 결합 할 수 있으며 배양 매체의 최대 5 mL에 대한 용량을 가지고 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>세포 배양 시약:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase 용액</td><td>Merk Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>해리 시약 &ndash; TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 분말, 고혈당</td><td>Gibco</td><td>12100061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 섬유아세포 성장 매체-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>FBM&nbsp; 섬유아세포 성장 기초 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3131</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 섬유아세포 성장 매체-2 SingleQuots,&nbsp; 보충제 및 성장 인자</td><td>Lonza</td><td>CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 매체 3 KIT</td><td>PromoCell</td><td>C-23130</td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 기초 배지 3</td><td>PromoCell</td><td>C-23230</td><td></td></tr><tr><td>성장 배지 3 SupplementPack</td><td>PromoCell</td><td>C-39350</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 (10000 U/mL)/ 스트렙토마이신 (10000 &mu; L/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 용액(NaOH) 1.0 N</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2770-100ML</td><td></td></tr><tr><td>세포 공급원:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>심실에서 나오는 정상 인간 심장 섬유아세포(NHCF-V)</td><td>Lonza</td><td>CC-2904</td><td></td></tr><tr><td>인간 심장 섬유아세포(HCF-c)</td><td>PromoCell</td><td>C-12375</td><td></td></tr><tr><td>인간 심장 섬유아세포( HCF-p)</td><td>PromoCell</td><td>C-12377</td><td></td></tr><tr><td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td><td>ATCC</td><td>SCRC- 1041</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 소스:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01 M HCl LLC의 콜라겐 I형(소)</td><td>콜라겐 솔루션</td><td>FS22024</td> 0.02 M HCl Corning 354236~4 mg/mL 약물 내 <td>6-7 mg/mL</td></tr><tr><td>콜라겐 I형(쥐 꼬리)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>약물:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin-A (Lat-A)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 제품:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>세포 배양 플라스틱 제품</td><td>Sarstedt 및 Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesh 세포 여과기 (나일론, 기공 크기 40 &mu; m)</td> <td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>myrPlate-uniform</td><td>myriamed GmbH</td><td>TM5 med</td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫 와이드 오프닝, 멸균 (10mL)</td> <td>Corning</td><td>07-200-619</td><td></td></tr><tr><td>특정 기기 :</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1/2 &Prime용 Bi-telecentric CORE 렌즈; 검출기</td><td>OptoEngineering</td><td>TCCR12096</td><td></td></tr><tr><td>Area scan camera Basler ace acA4024</td><td>Basler</td><td>107404</td><td></td></tr></tbody></table>

섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

섬유아세포는 전형적으로 매우 역동적인 세포로 생화학적 및 생화학적 자극에 대응하여 심섬유아세포로 빠르게 분화합니다. 심장 섬유증을 포함한 섬유성 과정의 현재 이해는 가난한 남아, 이는 새로운 항 섬유 치료의 개발을 방해. 제어 가능하고 신뢰할 수 있는 인간 모델 시스템은 섬유증 병리학을 더 잘 이해하기 에 매우 중요합니다. 이것은 섬유아세포와 3차원(3D) 환경에서 섬유아세포및 섬유조직의 병리생리학에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 48웰 주조 판에서 엔지니어링된 결합 조직(ECT)을 생성하는 매우 재현가능하고 확장 가능한 프로토콜이다. ECT는 정의 된 생체 기계적 부하하에서 연구를 허용, 튜닝 강성으로 극 주위에 생성됩니다. 정의된 로딩 조건하에서 세포 매트릭스 상호 작용에 의해 제어되는 현상 적응을 연구할 수 있습니다. 병렬 테스트는 48웰 형식으로 가능하며, 부하에 대한 조직 압축 및 수축과 같은 여러 매개 변수의 시간 과정 분석을 위한 기회를 제공합니다. 이러한 파라미터로부터 조직 강성 및 탄성과 같은 생체 역학적 특성을 연구할 수 있다.

ECT는 처음 24시간 내에 초기 세포 콜라겐 하이드로겔 부피에 비해 약 95%의 다짐에 도달한다. 제어 조건하에서 조직 압축 및 수축은 주조 후 몇 시간 동안 계속되며 특히 5일째까지 증가합니다(그림 5A). 극 편향은 다음 15 일 동안 더 증가 할 수 있습니다 (20 일 은 가장 긴 시간 테스트했다). 극 편향의 크기는 세포 유형, 세포 상태 및 세포 및 조직 배양 조건에 따라 달라집니다. 전형적으로, 생체역학적 특성은 배양 5일째에 측정되지만, 언제든지 선택할 수 있다. ECT 모델의 적용 가능성의 예로, 이 프로토콜이 조직 기능에 대한 액틴 세포골격 무결성의 영향을 연구하는 데 어떻게 도움이 되는지 를 보여 주었습니다. ECT는 48웰 주조 플레이트에서 제조되었고 액틴 중합 억제제 라트룬쿨린 A(Lat-A, 7 ng/mL)로 처리하였다. 처리는 대조군에 비해 CSA에서 1.7 배의 유의한 증가에 의해 표시된 ECT 다짐을 감소 (...

여기에 제시된 프로토콜은 기계학 연구, 질병 모델링 및 스크리닝 애플리케이션에 적합한 이중 극이 있는 다중 우물 판에서 48개의 조직의 병렬 배양에 대한 엔지니어링 된 결합 조직을 생성하는 프로토콜입니다. 프로토콜은 다른 장기와 종에서 섬유 아세포와 호환되며 인간의 기본 심장 섬유 아세포와 함께 여기에 예시됩니다.

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

이 프로토콜은 섬유아세포가 정의된 기계적 조건하에서 자체 환경을 구축하고 구성할 수 있게 합니다. 이들은 세포의 자연 환경에 필적하는 뻣뻣함과 매트릭스 조성을 가진 이색성 조직을 초래합니다. 이 방법을 사용하면 최대 48개의 조건을 병렬로 비교할 수 있습니다.사용된 세포 유형 및 배양 조건에 대하여 유연합니다. 잘 정의된 몇 가지 구성 요소만 사용함으로써 실험실 간에 재현할 수 있습니다. 프로 섬유성 인자 또는 항섬유성 약물을 적용함으로써, 이 프로토콜은 어떤 종류의 섬유증 질환의 근본적인 프로세스 및 치료를 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 박사 과정 학생인 알리사 데그레이브(Alisa Degrave)가 될 것입니다. 우선, 유리병이 소량의 얼음만 남을 때까지 약 2분간 섭씨 37도에서 수조에서 저온 보존 된 심장 섬유아아를 해동하십시오. 다음으로, 섬유아세포 성장 배지의 10밀리리터를 함유한 적절한 멸균 원심분리기 튜브로 2밀리리터 세로지학적 파이펫을 사용하여 세포 서스펜션을 드롭방향으로 전달한다.최적의 세포 검색을 위해 극저온 바이알을 FGM 1밀리리터로 헹구고 원심분리기 튜브로 옮김합니다. 부드럽게 세포를 다시 중단하고 세포 배양 플라스크로 전송합니다. 5 일 동안 또는 세포가 80 %의 합류에 도달 할 때까지 매일 FGM을 보충합니다.배양 된 세포에서 배지를 심은 후, PBS및 흡량의 6 밀리리터로 세포를 세척한 다음 세포 해리약6 밀리리터를 세포에 추가하고 세포 분리가 보일 때까지 배양합니다. 세포 협회 시약에 있는 빠진 세포에 FGM의 6-12 밀리리터를 추가하여 효소 활동을 중화합니다. 10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 4~8회 부드럽게 파이펫을 사용하여 단일 셀 서스펜션을 보장하고 세포를 신선한 50 밀리리터 수집 튜브로 이송합니다.제조업체의 지시에 따라 자동화된 셀 카운터의 도움으로 수율을 확인하고 셀 아래로 펠릿을 사용하십시오. 원심 분리 후, 상류체를 흡인, 펠릿을 빼내고 FGM에서 세포를 다시 중단하는 튜브를 쓸어. 다음으로, 40 마이크로미터 메쉬 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 변형한 다음 자동화된 셀 카운터를 사용하여 전기 전류 배제에 의한 셀 수와 생존가능성을 평가하여 엔지니어링 된 결합 조직 또는 ECT 준비를 진행하기 전에 신뢰할 수있는 세포 수를 보장합니다.ECT를 준비하려면 FGM을 추가하여 밀리리터당 890만 개의 세포 현탁액을 섭씨 20~25도에서 조절하고 세포를 얼음 위에 유지합니다. ECT 하이드로겔 혼합물의 개별 성분을 함유한 다른 모든 튜브를 얼음에 옮기고 빈 50밀리리터 원심분리기 튜브를 미리 냉각하여 혼합물을 준비한다. 기포 형성을 피하는 사전 냉각된 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 텍스트에 설명된 구성 요소를 추가하여 ECT 하이드로겔 혼합물을 준비하기 시작합니다.첫째, 산 수용성 콜라겐 타입 I 하이드로겔을 넓은 보어 팁이 있는 서학적 파이펫으로 피펫. DMEM을 추가하여 적절한 혼합을 위해 튜브를 부드럽게 소용돌이시켜 콜라겐 용액의 소금 함량을 조정합니다. pH를 중화하려면 튜브를 소용돌이치면서 0.2 개의 어금니 나트륨 수산화나트륨을 추가하고 페놀 레드 인디케이터의 적색을 관찰하여 중화를 확인합니다.그런 다음 튜브를 부드럽게 소용돌이치는 동안 셀 서스펜션을 드롭와이즈로 추가합니다. 거품 형성을 피하고 전단 응스트레스를 최소화하기 위해 넓은 보어 팁이 있는 세로지학적 파이펫을 사용하여 한 번만 위아래로 부드럽게 배관하여 서스펜션을 섞습니다. 튜브를 10번 부드럽게 소용돌이어 철저한 혼합을 합니다.주조 과정 전반에 걸쳐 얼음에 ECT 하이드로겔 혼합물을 함유한 원심분리기 튜브를 보관하십시오. ECT 하이드로겔 혼합물에 1밀리리터 파이펫 팁을 적재한 다음, 콜라겐 매트릭스 조립의 무결성에 영향을 미칠 수 있는 과도한 전단 력을 피하고 전체 플레이트가 15~20분 안에 완료되도록 하는 과도한 전단력을 피하고 48웰 주조 판의 각 금형에 180 마이크로리터의 하이드로겔 혼합물을 고르게 분배한다. ECT 혼합물의 불연속 분포로 금형 내에서 완전한 루프가 형성되어 완전한 ECT 링 형성을 방지할 수 있습니다.균일하고 기능적인 조직 형성을 위해 균일한 ECT 하이드로겔 주조를 보장하기 위해 파이펫팅 중에 내부 우물로 파이프팅하고 거품을 형성하는 것을 피하십시오. ECT 하이드로겔 혼합물을 15~30분 동안 재구성하기 위해 세포 배양 인큐베이터 내부에 48웰 주조 판을 조심스럽게 배치한다. 잠복 후, 젤과 같은 불투명한 것처럼 보입니다.바닥에서 ECT 분리를 피하기 위해 벽을 따라 부드럽게 섭씨 37도의 600 마이크로리터를 부드럽게 넣습니다. 분석될 때까지 매일 500마이크로리터의 FGM마이크로리터로 배지를 교체하십시오. 원하는 시점에서 스테레오 현미경을 사용하여 ECT의 상단 및 측면 뷰의 현미경 이미지를 기록합니다.이미지 처리 프로그램을 사용하여 라인 스캔 분석을 수행합니다. 스케일을 설정하고 직선 도구를 사용하여 각 이미징 평면에서 암당 최소 6개의 위치에서 ECT 직경을 추적하고 측정합니다. 고해상도 흑백 이미지 센서와 거의 UV 광원이 장착된 고정 된 거리에 배치 된 통합 영역 스캔 카메라가있는 레코딩 장치 아래에서 48 웰 주조 플레이트를 이미지합니다.콘트라스트를 최대화하기 위해 형광염을 함유한 폴 팁의 자동 검출을 수행합니다. 소프트웨어에서 녹화된 이미지를 실행하여 어두운 배경이나 이미지 처리 프로그램에서 고대비 밝은 픽셀을 감지하여 자동화된 분석을 사용하여 일일 레코드의 극 사이의 거리를 측정합니다. 옹극에서 ECT를 제거하고 전송 후크 및 ECT 루프를 삽입합니다.그런 다음 ECT를 고정된 팔에 고정된 두 개의 후크와 PBS로 채워진 섭씨 37도의 연성 장기 목욕이 장착된 확장동적 기계식 리오미터의 트랜스듀서 암으로 이송합니다. 리오미터를 초당 후크 사이의 초기 거리의 약 1%로 설정하여 일정 선형 속도로 동축 장력을 적용합니다. 초당 0.03밀리미터의 일정한 스트레칭 속도를 일반적인 ECT 치수와 함께 사용할 수 있습니다.트랜스듀서의 힘을 찢고 스트레칭을 시작합니다. 단면 면적에 의해 측정된 힘을 정상화한 후 ECT 파열 지점까지 기록을 유지하고 다른 생체 역학 적 파라미터를 결정하는 응력 -변형 곡선을 플롯한다. 조직이 미세 골절을 시작하기 직전에 탄성 영역의 상한은 수율 지점에 해당하며 그 균주는 조직 탄성의 척도입니다.플라스틱 영역은 수율 점과 실패 지점 사이에 있습니다. 실패 점은 조직의 파열로 인한 스트레스의 급격한 하락에 해당하며, 조직 확장성의 척도인 궁극적 인 변형을 정의합니다. 세 번째 측정점은 조직이 스트레치 중에 깨지지 않고 견딜 수 있는 가장 높은 스트레스에 의해 정의된 최대 강도에 해당합니다.곡선 아래 영역에 의해 주어진 탄력성과 인성은 각각 수율 점 및 실패 지점까지 조직에 의해 흡수되는 에너지에 해당한다. 각 획득 된 곡선에 대해, 탄성 영역의 선형 부분의 경사는 탄성 계수라고도 영의 계수에 해당합니다. 조직의 강성을 측정하는 기계적 특성입니다.이 프로토콜을 사용하여 제어 조건하에서 ECT 다짐 및 수축이 있었고 FCS의 존재는 주조 후 몇 시간 후에 계속되었으며 특히 5 일째까지 증가했습니다. ECT가 액틴 중합 억제제 라트룬쿨린 A로 처리되었을 때, ECT 다짐은 대조군에 비해 상당히 높은 단면 영역에 의해 표시된 바와 같이 감소되었다. 조직의 수축은 문화의 5 일 동안 평가되었다.라트룬큘린 A가 없을 경우, 수축은 5일째까지 점차 증가하여 약 40%의 수축률을 기록했다. 그러나, Latrunculin A 존재는 단지 대략 20%의 최대 수축의 결과로 조직 수축에 영향을 미쳤습니다. 액틴 중합 억제는 대조군에 대한 조직 강성에 약 50%의 현저한 감소를 주도하였다.이러한 결과는 액틴 세포골격무결성이 ECT 다짐, 수축 및 경직에 필수적이라는 것을 보여줍니다. 신뢰할 수 있는 고품질 콜라겐 솔루션을 선택하고 생존가능성이 높은 단일 셀 서스펜션을 사용하여 엔지니어링 된 결합 조직을 재구성하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 모델 시스템은 비파괴 방식으로 내생 콜라겐 (재) 조직 리얼 타임으로 공부하는 데 사용할 수있는 근섬유 채워진 섬유소 젤에서 시작됩니다. 모델 시스템은 서로 다른 세포 소스, 중간 첨가제와 함께 사용할 수있는, 매우 조정할 수 있으며, 특정 요구에 쉽게 적용 할 수 있습니다.

엔지니어링 섬유소 기반 조직의 면역 조직 및 제약 조건의 적용에서 생성하고 세포와 콜라겐 (재) 조직을 유도하는 스트레인

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

Dupuytren의 질병 (DD)는 손바닥의 fibroproliferative 질환이다. 여기서는 3 차원 (3D) 배양 계에서 배양 DD로부터 표본을 절제 프로토콜을 제시한다. 이러한 단기 배양 시스템은 3 차원 구조의 보존과 섬유 성 조직의 분자 특성을 허용한다.

인간의 Dupuytren의<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 근섬유 아세포의 연구와 세포 외 기질 상호 작용에 대한 문화

섬유아세포 행동은 다양한 임상 개체의 기초가 되지만, 주로 내재된 이질성으로 인해 특성화가 제대로 이루어지지 않은 상태로 남아 있습니다. 전통적인 섬유아세포 연구는 체외 조작, 생체 내 섬유아세포 거동 마스킹에 의존합니다. 세포 배양이 필요하지 않은 마우스 피부 섬유아세포의 분리를 위한 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

우리는 초보자 (예를 들어, 학생)에 의해 수행 할 수있는 쉽고 빠르고 신뢰할 수있는 방법으로 기본 성인 섬유 아아세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 효소 조직 소화와 기계적 동요를 초음파와 결합하여 1 차 섬유 아아아를 얻습니다. 프로토콜은 특정 실험 요구 사항(예를 들어, 인간 조직)에 쉽게 적응될 수 있다.

초음파 증강 원발성 섬유아세포 분리

많은 연구자들은 스프레드시트가 아닌 데이터베이스로 보다 효율적으로 관리할 수 있는 "중간 크기", 저속 및 다차원 데이터를 생성합니다. 여기서는 다차원 데이터 시각화, 관계형 데이터베이스 구조의 테이블 연결, 반자동 데이터 파이프라인 매핑, 데이터베이스 사용 등 데이터베이스의 개념적 개요를 제공하여 데이터 의미를 설명합니다.

조직 공학에서 중간 크기의 저속, 다차원 데이터를 효율적으로 관리하는 데이터베이스

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. 섬유아세포는 전처리된 배양판에 씨를 뿌리고 매트릭스 생성을 위한 아스코르브산으로 자극된다. 행렬은 탈세포화되고 관련 세포(예를 들어, 내피 세포)를 배양하도록 차단된다.

섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용

여기에 제시된 것은 고처리량, 다차원 형식으로 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 스페로이드(CS)의 생성 및 냉동 보존을 위한 일련의 프로토콜입니다. 이 3차원 모델은 질병 모델링, 고처리량 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼 역할을 하며 냉동 보존 후에도 기능을 유지합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

여기에서는 하중을 견디는 힘줄 코어 조직과 질병 및 부상에 의해 활성화된 세포 집단을 포함하는 외인성 구획 사이의 힘줄 세포 누화를 모방하는 조립체 모델 시스템을 제시합니다. 중요한 사용 사례로, 외인성 내피 세포의 질병 관련 활성화를 조사하기 위해 시스템을 배포하는 방법을 보여줍니다.

질병 및 복구에서 세포 누화를 조사하기 위한 힘줄 집합체 엔지니어링

다음 프로토콜은 광범위한 조직 공학 응용 분야에 적용할 수 있는 나노 스케일 패턴의 섬유소를 가진 콜라겐 하이드로겔 제조를 위한 전단 기반 압출 방법을 제시합니다.

조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산

학습하세요 섬유아세포가 정의된 역학적 조건에서 자체 환경을 구축하고 조직하는 방법을 통해 방향성 조직을 생성하는 기술을. 이 프로토콜은 최대 48개 조건을 병렬로 비교할 수 있어 섬유증 질환의 기전 연구와 약물 선별에 활용됩니다.

섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

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