수지상 척추 연구를 위한 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)

두뇌에 있는 각 신경은 대략 7, 000 시냅스에 의해 그밖 신경 세포와 연결됩니다. 포유류 뇌의 시냅스는 주로 수지상 척추라고 불리는 막의 작은 돌출에 위치한다는 것을 제외하십시오. 시냅스와 수지상 척추 등의 가소성, 학습 및 기억 과정과 같은 중요한 뇌 기능.

전자 현미경 검사법만 수지상 척추에 포스트냅틱 입력이 있는지 여부에 대한 완전한 통찰력을 제공한다는 점에 유의해야 합니다. 수지상 척추 이미징에 대한 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 그러나, 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사는 고해상도로 많은 양의 조직을 이미지할 수 있는 독특한 가능성을 제공합니다.

직렬 블록 기반 스캐닝 전자 현미경 기술은 중금속과 강한 대조를 포함하는 샘플 준비의 특별한 프로토콜을 필요로한다. 관류 동안 내 기본 고정은 우리가 번개 전자 현미경 검사에 동일한 뇌를 사용할 수 있었습니다. 마우스는 희생되고 온화한 1 차 고정으로 perfused되었습니다.

뇌는 반으로 절단되었고 한 반구는 면역 형광 전용 고정, 냉동 보호제로 고정되었고, 극저온을 사용하여 슬라이스하고 면역 형광 연구를 위해 처리되었습니다. 다른 반구가 전자 현미경 고정제로 고정되어 진동으로 슬라이스하고 전자 현미경 연구를 위해 준비된 곳. 직렬 블록 기반 스캐닝 전자 현미경 연구를 위한 뇌 슬라이스는 수지에 평평한 대조를 이루고, 해마의 CA1 영역을 핀에 장착하고 직렬 블록 기반 스캐닝 전자 현미경으로 이미지화되었다.

노란색 상자에 강조 표시된 프로토콜의 일부가 비디오에 등장했습니다. 100개의 미생물 조각으로 고정되어 절단된 조직을 3분 동안 차가운 인산염 버퍼로 5회 세척하십시오. 4%의 오스뮴 테트산화물과 3%의 칼륨 페로시야니드의 일대일 혼합물을 준비합니다.

최종 제품은 갈색으로 바뀝니다. 이 혼합물에 샘플을 담그다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 놓습니다.

그리고 이 단계에서부터 는 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 1 시간 동안 부드러운 흔들림으로 그들을 인큐베이션하십시오. 한편, TCH 솔루션을 준비합니다.

이중 증류수 10밀리리터와 0.1그램의 TCH를 섞으세요. 1시간 동안 60°C로 설정된 오븐에 넣습니다. 수시로 솔루션을 스위서하는 것이 중요합니다.

준비가 되면 실온으로 식힙니다. 이제 샘플을 두 번 증류수로 각각 3분 동안 5회 세척한 다음 여과된 TCH 용액에 담급됩니다. 슬라이스가 검은색으로 바뀝니다.

실온에서 20분 동안 배양하십시오. 샘플을 2회 증류수로 각각 3분 동안 5회 세척하고 실온에서 30분 동안 2%의 오스뮴 테트리옥사이드로 배양합니다. 다시 말하지만, 샘플을 3 분 동안 5 번 두 번 증류물로 씻고 여과 된 1 % 또는 아밀 아세테이트에 넣습니다.

하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오. 다음 날, D-아스파트 준비로 시작합니다. 납 질산과 60°C까지 미리 따뜻하게 된 아파르산 용액을 섞습니다.

혼합물을 섭씨 60도로 설정된 수조에 넣고 수산화 나트륨 1개를 사용하여 pH를 5.5로 조정합니다. 유리병을 납으로 닫고 섭씨 60도에서 30분 간 그대로 둡니다. 해결책은 분명해야 합니다.

흐린 경우 폐기해야 하며 새로운 것을 준비해야 합니다. 그 동안, 가스 이중 증류수로 샘플을 3분 동안 5회 세척하고 30분 동안 60°C의 오븐에 보관하십시오. 새로 준비된 납 아스파트에 이액에 샘플을 담그고 20분 동안 섭씨 60도로 설정된 오븐에 배양합니다.

에폭시 수지 준비. 재료의 무게를 측정하고 가속기 DMP 30을 추가하기 전에 적어도 30 분 동안 수지를 잘 섞습니다. 에탄올의 등급 희석으로 바이러스를 준비합니다.

그런 다음 샘플을 오븐에서 꺼내 두 번 증류수로 3 분 동안 다시 씻습니다. 한편, 수지와 100%에탄올을 1대1 비율로 섞어 50%의 수지를 얻습니다. 잘 섞으세요.

이에 따라 에탄올의 각 희석시 샘플을 5분 동안 탈수합니다. 샘플이 완전히 건조해서는 안된다는 것을 기억하십시오. 샘플을 30분 동안 50%의 수지로 먼저 침투한 다음 1시간 동안 100%의 수지로 샘플을 먼저 침투한 다음 하룻밤 사이에 신선한 100% 수지로 다시 침투합니다.

다음 날, 샘플을 1시간 동안 신선한 100% 수지에 넣은 다음 불소 중합체 포함 시트 사이에 포함시됩니다. 에탄올로 기름을 바른 임베딩 시트 조각을 준비하고 지지로 사용될 유리 슬라이드를 제쳐 놓습니다. 유리 슬라이드에 포함 시트 조각을 놓고 수지를 한 방울 만넣은 다음 나무 막대기를 사용하여 샘플을 조심스럽게 옮습니다.

두 번째 조각으로 덮습니다. 기포를 피하십시오. 조직이 매우 깨지기 때문에 부드럽게하십시오.

다른 유리 슬라이드를 포함 시트 조각 위에 조심스럽게 놓고 적어도 48 시간 동안 70섭씨에서 오븐에 샘플을 치료하십시오. 레이어를 분리하고 임베디드 샘플 조각을 면도날로 잘라냅니다. 파라핀으로 옮겨.

이렇게 하면 정전기로 인해 시료를 잃을 위험이 최소화됩니다. 에탄올로 기름을 바른 알루미늄 핀을 가져 가라. 전도성 에폭시를 잘 섞고 약간의 양을 사용하여 샘플을 핀에 장착하십시오.

전도성 에폭시를 섭씨 70도에서 10분간 치료하십시오. 샘플 블록의 각 면을 다이아몬드 나이프로 잘라낸 다음 조직이 노출될 때까지 블록의 얼굴을 연마합니다. 전도성 페인트를 사용하여 샘플을 핀에 접지하고 치료합니다.

충전을 최소화하기 위해 샘플은 얇은 금 또는 금 팔라듐층으로 코팅된 것을 발견해야 합니다. 시료가 있는 핀을 일련 블록 기반 스캐닝 전자 현미경의 챔버에 놓습니다. 샘플을 칼에 정렬한 다음 챔버를 닫고 매개 변수를 설정합니다.

이미지 스택을 수집합니다. 설명된 방법을 사용하여, 마우스 뇌 조직의 이미지가 얻어졌다. 해마 의 큰 이미지는 한 영역을 촬영하고 이미징은 층 방사의 중심에 설정되었다.

이미지 더미를 획득하고 수지상 척추 및 시냅스와 같은 관심 있는 개체가 분할되었습니다. 양질의 조직 형태는 명확하게 보이는 막과 시냅스 소포 및 잘 보존된 미토콘드리아로 얻어졌다. PSD 95 항체의 면역 형광 연구는 4 %의 PFA와 온화한 1 차 고정 및 전통적인 고정이 비교 결과를 준다는 것을 확인했습니다.

제시된 프로토콜은 직렬 블록 기반 스캐닝 전자 현미경 검사법, 고품질 조직 형태 및 12개의 눈에 보이는 멤브레인을 사용하여 뇌 조직 이미지를 획득하여 10개의 올바른 세분화 및 재구성을 용이하게 합니다. 내 1 차 고정은 PSD 95 면역 형광 및 전자 현미경 이미징 수지상 척추의 분석을 위해 동일한 뇌를 사용할 수 있게했습니다. 여기서 우리는 PSE 9, 500 신진을 사용합니다.

그러나 다른 쪽도 사용할 수 있습니다.