가을 육군벌레, 스포드옵테라 검소한에서 활동적인 피기박 트랜스포사스 중재 된 세균라인 변환
2021년 9월 23일
가을 군벌레, 스포드옵테라 검거르다에서성공적인 생식선 변환은, 활동적인 돼지박 트랜스포사제의 mRNA를 사용하여 달성되었다.
이 프로토콜은 돼지 박 기반 변환 시스템을 사용하여 형질 전환 육군 벌레의 생산을 보여줍니다. 우리는 이러한 방법이 가을 육군 벌레뿐만 아니라 lepidopteran 곤충뿐만 아니라 변환을 개선하는 데 도움이되기를 바랍니다. 여기에 설명된 방법은 lepidopteran 해충 곤충의 생식선 변환을 효율적으로 만듭니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 동료 인 Xien Chen 박사가 될 것입니다. 먼저 12개의 수컷 강아지와 12개의 암컷 강아지를 상자에 넣습니다. 성인에게 먹이를 주기 위해 상자에 10% 자당 용액을 놓습니다.
종이 타월로 상자를 덮습니다. 둘째 날, 하룻밤 강렬한 빛에 성인을 노출. 3일째에는 성인을 어두운 곳으로 옮는다.
위치를 초과 한 후 2 시간 이내에 배아를 수집합니다. 신선한 달걀을 얼음 위에 넣은 신선한 달걀과 함께 종이 타월 조각에 물 방울을 넣습니다. 계란을 미세한 브러시로 유리 슬라이드에 부드럽게 옮기고 유리 슬라이드에 하나씩 정렬합니다.
유리 슬라이드를 미세 주입 하기 전에 얼음에 정렬 하는 계란으로 유지 합니다. 마이크로리터 피기박 계 EGFP 발현 마이크로리터 피기박 계 EGFP당 200 나노그램의 혼합물을 마이크로리터 활동적인 피기박 트랜스포사아제 mRNA당 200 나노그램, 자동 마이크로인젝터의 보상 압력을 사용하여 알에 멸균 증류수를 주입한다. 주입된 계란을 섭씨 27도 이상 또는 마이너스 1도, 부화할 때까지 60플러스 또는 마이너스 10%의 상대 습도로 유지하십시오.
부화한 애벌레를 인공 식단에 먹이고 각 유충을 초기 커드와 스타 스테이지에서 작은 컵 한 잔으로 옮기습니다. 강아지를 수집하고 케이지에 약 150 여성과 150 수컷 강아지를 배치합니다. 계란을 수집하기 위해 케이지에 크기 15 센티미터 에 의해 30 센티미터 30 센티미터의 종이 타월의 여러 조각을 걸어.
매일 달걀로 종이 타월을 수집하고 부화 할 때까지 적절한 조건에서 계란을 유지하십시오. 신난 유충을 섭씨 4도에서 5분간 유지하여 고정한 다음 얼음 냉판에 옮긴다. 형광 스테레오 현미경으로 고정 된 신생아 애벌레를 검사하십시오.
EGFP 양성 신생아를 선택하고, 27플러스 또는 섭씨 1도를 뺀 후 약 2주 만에 푸팔 단계로 올리세요. 시험관내에서 합성된 활동적인 피기박 트랜스포사제 mRNA는 1%아가로즈 젤을 사용하여 검출되었다. PDS 주입 배아는 EGFP 신호를 보여주지 않았고, EGFP 표현 플라스미드 및 활동적인 피기박 트랜스포사제 mRNA 주입 배아는 PGP 형광을 보였으며, 이는 돼지박 건설이 성공적이었음을 나타냅니다.
G0 성인의 자기 십자가에서 유래 하는 계란에서 얻은 G1 애벌레 강한 EGFP 신호를 보였다. 프로모터 및 EGFP 단편을 함유한 단편은 EGFP 양성 애벌레로부터 분리된 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 성공적으로 증폭되었다. 그러나, 동일한 단편은 유전체 DNA가 야생형 애벌레로부터 템플릿으로 분리되었을 때 검출되지 않았다.
미세 주입을 위한 계란은 가능한 한 신선해야 하며, 개발을 늦추기 위해서는 미세 주입 전에 얼음에 보관해야 합니다. 이 기술은 해충 곤충 기능적인 유전체학에 있는 질문에 대답하고 이 글로벌 해충을 위한 유전 통제 방법을 개발하는 연구원을 위한 쪽을 포장합니다.
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개요
본 연구는 piggyBac 기반의 형질전환 시스템을 이용하여 가을밤나방(Spodoptera frugiperda)의 성공적인 생식세포선 형질전환을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 나비목 해충의 형질전환 효율을 개선하며, 이러한 생물체에 대한 기능 유전체학 연구를 강화합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 해충 곤충의 유전 공학
- 형질전환 생물학 기법
- 기능 유전체학 응용
배경
- Fall armyworm은 중요한 농업 해충입니다.
- piggyBac 트랜스포존 시스템은 유전자 전달 효율성이 높은 것으로 알려져 있습니다.
- 생식선 형질전환을 개선하는 것은 해충 방제 전략에 있어 매우 중요합니다.
사용된 방법
- piggyBac 플라스미드 및 mRNA의 난자 미세주입
- 생물학적 모델로서의 Spodoptera frugiperda
- 형질전환 유충 스크리닝을 위한 형광 현미경 관찰
주요 결과
- 형질전환 유충에서 EGFP의 성공적인 발현은 piggyBac 시스템의 기능성을 입증하였습니다.
- 게놈 DNA 증폭을 통해 EGFP 발현을 확인하여, 형질전환 유충과 야생형 유충을 구분하였습니다.
- 해당 형질전환 기술은 유전자 변형 해충을 생성하는 데 효율적임이 입증되었습니다.
결론
- 본 연구는 Spodoptera frugiperda의 생식세포선 형질전환을 위한 강력한 방법을 수립하였습니다.
- 연구 결과는 농업 해충의 유전적 제어 방안을 발전시키는 데 기여합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
fall armyworm과 같은 농업 해충에서 효율적인 생식세포 변형(germline transformation) 체계를 구축하면, 해충 방제 파이프라인에서 표적 검증 및 기전적 리스크 제거를 위한 기능 유전체학 연구가 가능해집니다. 이 프로토콜은 유전자 기능을 조사하고 질병 관련 곤충 모델에서 표현형 결과를 평가할 수 있는 확장 가능한 시스템을 제공함으로써 초기 발견 단계를 지원합니다. 성공적인 형질전환은 유전적 해충 관리 전략을 위한 하위 스크리닝 및 바이오마커 발견을 용이하게 합니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 해충 유전자의 기능적 조사를 가능하게 하여 유전자 제어 전략을 위한 표적을 검증합니다.
- 운용적 가치: 일관된 표적 평가를 위해 형질전환 라인을 생성할 수 있는 재현 가능한 시스템을 제공합니다.
- 예측적 가치: 해충 모델에서 유전자 파괴와 표현형 효과를 연결함으로써 메커니즘적 리스크 제거를 지원합니다.
스크리닝 및 어세이 개발
- 과학적 가치: 유전적 섭동의 고효율 스크리닝을 위한 형광 리포터 라인을 생성합니다.
- 운영적 가치: 표준화된 PCR 기반 유전자형 분석 및 삽입 부위 검증을 위한 TAIL-PCR을 가능하게 합니다.
- 분석 준비도: 화합물 스크리닝 및 표현형 분석에 적합한 안정적인 형질전환 균주를 생산합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 발견 단계의 유전자 검증을 유전자 제어 메커니즘의 전임상 평가와 연결합니다.
- 위험 조정 추진: 현장 적용 전 유전자의 필수성과 표현형 영향에 대한 평가를 용이하게 합니다.
- 바이오마커 정렬: 감수성 또는 저항성 특성과 관련된 유전적 마커의 식별을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 방법은 형질전환을 통한 타겟 검증을 가능하게 하고, 표현형 스크리닝을 통한 리드 물질 발굴을 지원하며, 안정적인 유전자 모델을 통해 전임상 결정에 정보를 제공함으로써 초기 발견 워크플로우에 통합됩니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 군대나방의 유전자 결손 또는 과발현을 가능하게 하여 표적의 관련성을 평가함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 유전적 또는 화학적 조절제의 재현 가능한 스크리닝을 위해 표준화된 형질전환 라인을 생성합니다.
- 분석(Analytics): transgene의 삽입 및 발현 수준을 측정하기 위해 정량적 PCR 및 형광 판독값을 제공합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 유전자 기능 발견을 유전적 해충 제어 방식의 전임상 평가와 연결합니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 포트폴리오 전반의 표적 검증을 위해 나비목 해충 종 전반에 적용 가능한 재사용 가능한 형질전환 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 해충 모델에서의 직접적인 유전자 조작을 통해 타겟 검증의 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 미세주입 및 스크리닝 프로토콜을 통해 확장 가능하고 재현 가능한 형질전환 시스템을 제공합니다.
- 전략적 가치: 타겟 필수성에 대한 생물학적 불확실성을 줄임으로써 go/no-go 결정의 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 해충 모델에서의 in vivo 표현형 검증을 기반으로 타겟의 리스크 조정 우선순위 설정을 가능하게 합니다.
구현 시 고려 사항
- 곤충 배아학 및 미세주입 기술에 대한 전문 지식이 필요함.
- 자동 미세주입기, 형광 실체 현미경 및 검증을 위한 PCR 장비가 필요함.
- 팀 간 배아 수집, 주입 조건 및 형질전환 스크리닝을 위한 표준화된 프로토콜이 요구됨.
- 나비목 종에 따른 온도, 습도 및 먹이 프로토콜의 최적화가 필요함.
- 배아의 품질과 신선도에 의존하며, 미세주입 효율은 발달 시기에 따라 영향을 받음.
