Name: 가을 육군벌레, 스포드옵테라 검소한에서 활동적인 피기박 트랜스포사스 중재 된 세균라인 변환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 학습하세요 가을 육군벌레(Spodoptera frugiperda)의 piggyBac 기반 생식계 변환법을 통해 유전자 변형 해충 생산 및 기능 유전체학 연구를 효율적으로 수행하는 방법을.

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보고된 연구는 국립 과학 재단 I/UCRC에 의해 지원됩니다, 자지동물 관리 기술 센터, 그랜트 No IIP-1821936에 따라 및 산업 파트너에 의해, 농업 및 식품 연구 이니셔티브 경쟁 보조금 번호 2019-67013-29351 및 국립 식품 농업 연구소, 미국 농업의 부(2019-67019)와 미국 농농업부 (2019-67019)와 미국 농무부 (2019-67013)와 2353057000 미국 농무부 (2019-67013).

1. hyPBase mRNA의 체외 합성
참고: hyPBase 서열의 전체 코딩 시퀀스는 합성 및 pTD1-Cas9 벡터에 삽입되었다 (재료의 표참조) hyPBase 표현 카세트를 포함하는 pTD1-hyPBase 구조를 생산, T7 프로모터 : 폴리 헤드린 -5'UTR : hyPBase : 폴리 히프린 - 3'UTR. pTD1-hyPBase 구조의 전체 시퀀스는 보충 재료에제공됩니다.
<ol><li>체외 합성을 위한 템플릿 준비<ol>
<li>PCR 반응을 수행하여 전방 프라이머, 5'-atgcgggtgaaataccgcacaggcg-3', 역프라이머 5'-tagaggccaaggttatgctag-3', 고충실도 폴리머라제 및 pTD1-hyPBase 플라미드를 사용하여 하이PBase 표현 카세트를 증폭시한다. 참고: PCR 반응(50 μL의 최종 부피)에는 10x 반응 버퍼의 5.0 μL이 포함되어 있습니다. 4.0 μL 의 10 mM 데옥시뉴클레오사이드 삼중산염(dNTP), 플라스미드 1.0 μL(50μg/μL), 고충실도 폴리머라제 1.0 μL, 10μM 의 전방 및 역프라이머 각각 1.0 μL, 뉴클레아스 프리 워터 33 μL. 설정은 다음과 같이: 3 분 동안 95 °C의 초기 인큐베이션, 10 초에 대한 98 °C의 35 사이클, 15 초에 대한 60 °C, 2 분 동안 68 °C.</li>
		<li>신선한 트리세테이트 에틸렌디아민 테트라아세산(TAE) 완충제에서 120V의 1% 아가로즈 젤로 PCR 제품을 30분 간 확인하고 젤 추출 키트로 제품을 정화합니다. 참고 : PCR 제품 정화 키트를 사용하지 마십시오. pTD1-hyPBase 플라스미드의 미량조차도 체외 합성의 효율을 크게 감소시다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
상용 키트를 이용한 hyPBase mRNA의 체외 합성<ol>
<li>냉동 시약을 완전히 해동하고, 효소와 2배 NTP/CAP 용액을 얼음 위에 보관하고, 해동된 10x 반응 버퍼를 실온에서 남깁니다.</li>
		<li>다음 구성 요소를 추가하여 실온에서 반응을 조립 : 2x NTP / CAP 용액 : 10 μL; 10x 반응 버퍼: 2 μL; 템플릿 DNA: 0.1-0.2 μg; 효소 혼합: 2 μL; 20 μL에 핵이없는 물.</li>
		<li>혼합물을 위아래로 부드럽게 파이프팅하여 시약을 37°C에서 2-4h로 부드럽게 섞는다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>염화리튬 강수량에 의한 합성 mRNA 의 회수<ol>
<li>LiCl 침전액의 30 μL을 추가하고 튜브를 가볍게 섞은 다음 -20 °C에서 ≥ 30 분 동안 유지하십시오.</li>
		<li>최대 속도로 15분 동안 4°C의 원심분리기는 상체를 조심스럽게 제거합니다.</li>
		<li>펠릿을 70% 에탄올 1mL로 한 번 씻고, 재원심분리기를 조심스럽게 제거합니다.</li>
		<li>실온에서 펠릿을 1-2분 동안 건조한 다음, 20-40 μL의 뉴클레아제 없는 물로 펠릿을 다시 분리한다.</li>
		<li>핵이 없는 물의 9μL로 mRNA 용액 1μL을 희석시하십시오. 2 μL을 사용하여 mRNA 농도를 결정하고 8 μL을 사용하여 신선한 TAE 버퍼에서 100 V에서 1% 아가로즈 젤에서 mRNA 품질을 확인하십시오.</li>
		<li>mRNA 용액을 알리쿼트하고 최대 1년 동안 -70°C에서 냉동 보관하십시오. 참고 : mRNA 펠릿을 완전히 건조시키지 마십시오. 물에 녹는 것이 더 어려울 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 미세 주입
<ol><li>계란 컬렉션<ol>
<li>15cm x 15cm x 10cm 상자에 12개의 수컷 강아지와 12개의 암컷 강아지를 놓습니다. 종이 타월로 상자를 덮습니다. 성인에게 먹이를 주기 위해 10% 자당 용액을 상자에 놓습니다.</li>
		<li>2일째에 포스트 백과사전, 하룻밤 강렬한 빛에 성인을 노출.</li>
		<li>3일째에는 성인을 2.1.2단계에서 어두운 곳으로 옮기는다. 배반 후 2 시간 이내에 배아를 수집합니다.</li>
		<li>신선한 달걀을 얼음 위에 보관한 종이 타월 조각에 물 방울을 넣습니다. 계란을 미세한 브러시로 유리 슬라이드에 부드럽게 옮기고 유리 슬라이드에 하나씩 정렬합니다. 마이크로 주입하기 전에 유리 슬라이드를 얼음 위에 정렬 된 계란과 함께 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미세 주입 설정<ol>
<li>형질 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)-표현 플라스미드 (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL), 및 멸균 증류수를 계란에 주입하여 자동화 된 미세 주입기의 보상 압력을 사용하여 (재료의 표참조).</li>
		<li>주입된 계란을 27± 1°C, 60± 10% 상대 습도에서 부화할 때까지 보관하십시오.</li>
		<li>부화유를 인공 식단에 먹이고, 각 애벌레를3rd instar 초반에 작은 컵 한 잔으로 옮기고(길이가 6mm, 바디 컬러는 검게 변합니다).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 형광 검사 및 유전 횡단
<ol><li>35cm x 35cm x 35cm 케이지에 새끼를 모으고 ~ 150 개의 암컷 강아지와 ~ 150 개의 수컷 강아지를 배치하십시오. 계란을 수집하기 위해 케이지에 종이 타월 (~ 30cm x 15cm)의 여러 조각을 걸어.</li>
	<li>매일 달걀로 종이 타월을 수집하고, 27 ± 1 °C, 60 ± 10 % 상대 습도에서 부화 될 때까지 보관하십시오.</li>
	<li>신산 유충을 4°C에서 5분 동안 보관한 다음 얼음 냉판으로 옮긴다.</li>
	<li>형광 스테레오 현미경으로 고정 된 신생아 애벌레를 검사하십시오. EGFP 양성 신생아를 선택하고, 27± 1°C에서 ~2주 만에 푸팔 단계로 올리고, 복부 세그먼트의 표현형 차이에 따라 성별에 따라 분리한다. 참고 : 여성 강아지는 여덟 번째 복부 세그먼트에 슬릿 같은 생식기 개구부와 생식기 개구부를 향해 휘어진 아홉 번째 및 열 번째 세그먼트의 세팔릭 마진을 가지고 있습니다. 남성 강아지의 생식기 개구부는 아홉 번째 복부 세그먼트에 약간의 고도가 있습니다.</li>
	<li>EGFP 양성 강아지와 이성의 야생 형 강아지를 남성에 놓습니다 : 케이지에 1:1의 여성 비율. 다음 세대를 생산하기 위해 EGFP 를 표현하는 성인을 Sib-cross.</li>
</ol>4. 형질 전환 삽입의 PCR 검출
<ol><li>제조 업체의 지시에 따라 모든 상업적게놈 DNA 추출 키트를 사용 하 여 야생 형 및 EGFP 양성 개별 애벌레에서 게놈 DNA를 추출.</li>
	<li>유전체 DNA를 템플릿으로 사용하여 PCR 반응을 수행; ie1 프로모터 지역에 위치한 5'-acgtacgctcctccgttccgttc-3' 전방 프라이머; 및 역프라이머, 5'-aagcactgcacgccgtaggtcag-3' 변환 벡터의 EGFP 영역에 위치.</li>
	<li>각 PCR 반응(40 μL의 최종 부피)을 설정하여 폴리머라제 혼합물의 20 μL, 게놈 DNA 1.0 μL(40 μg/μL), 10μM 의 전방 및 역프라이머 각각 1.0 μL, 뉴클레아제 없는 물의 17μL을 포함한다. 다음 설정을 사용하십시오: 3분 동안 95°C의 초기 인큐베이션, 20s용 95°C의 35사이클, 20s용 56°C, 40s 설정의 경우 68°C가 뒤따릅니다.</li>
	<li>PCR 제품을 1% 아가로즈 젤120 V에서 30분 동안 확인하십시오.</li>
</ol>5. 형질전환 삽입 부위의 결정
<ol><li>EGFP 양성 곤충에서 트랜스진 삽입의 통합 부위를 결정하기 위해 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하여 고효율 TAIL-PCR을 수행한다.<ol>
<li>다른 곳에서 설명된 단계9다음에PCR 반응을 수행한다.<ol>
<li>P1: 5'-atcagtgacactctaccgcattgaagcacgcc-3', P2: 5'tcacgggagctccagcggcgactg-3', 및 P3: 5'atgttaatgcgcgcgacggacgcgct-3', p3: 5'-atgttaatgcgcgacggacgcgct-3'를 사용 하 여, p1, p1의 반응에 특정, 3'.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>최종 PCR 제품을 시퀀스하여 통합 사이트를 결정합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li>
<li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).</li>
<li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+%28Diptera%3A+Tephritidae%29+based+on+female-specific+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li>
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<li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect%2C+the+fall+armyworm%2C+in+a+tissue-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li>
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<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori%2C+a+model+Lepidopteran+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).</li>
<li>Wu, S. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty%2C+Tol2%2C+and+Mos1+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li>
<li>Dreyfus, M., Régnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28A%29+tail+of+mRNAs%3A+bodyguard+in+eukaryotes%2C+scavenger+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

트랜스제닉 성분을 신선한 배아로 전달하는 낮은 비율과 트랜스제너란을 신선한 배아로 전달하는 어려움은 많은 비모델 곤충, 특히 질서, Lepidoptera의 생식선 변환의 성공을 제한합니다. 세균선 변환 속도를 높이기 위해 가장 널리 사용되는 피기박 트랜스포사아제(hyPBase)의 활동적인 버전이7,10을개발하였다. 현재까지, lepidopteran 곤충의 성공적인 생식선 변환은 주로 모델 곤충 누에, 봄비스 모리(11)에보고된다. 그러나 일부 주요 농업 해충을 포함한 다른 lepidopteran 곤충에서 과기 전위 작업을 수행하는 것은 여전히 도전적입니다.
이 프로토콜을 사용하여 형질 전환 FAW 라인을 확립하는 주요 제한 및 주요 단계는 고품질 hyPBase mRNA를 합성하고 초기 배아에 피...

가을 군벌레 (FAW), Spodoptera 검소한다,미국의 열대 및 아열대 지역 출신이다. 현재, 이것은 전 세계 100 개 이상의 국가에서 파괴적인 곤충 초식동물입니다 1. FAW 애벌레는 몇 가지 중요한 주식 작물 을 포함하여 350 개 이상의 호스트 식물에 사료2. FAW 성인의 강력한 이주 능력은 최근 미대륙에서 다른 장소로 급속한 확산에 기여1,2. 그 결과, 이 곤충은 현재 국제적으로 식량 안보를 위협하고 있습니다. 새로운 기술을 적용하면 FAW의 고급 연구를 용이하게하고이 해충을 관리하는 새로운 전략을 제공 할 수 있습니다.
곤충 생식선 변환유전자 기능을 연구하고 유전자 제어3,4에사용하기 위해 형질전환 곤충을 생성하는 데 사용되어 왔다. 곤충의 유전적 변화를 달성하는 데 사용되는 다양한 방법 중, 돼지박 원소 기반 방법은 가장 많이 사용되는 방법5이다. 그러나, 전치의 낮은 비율로 인해, 비 모델 곤충에서 전염을 수행하는 것은 여전히 도전이다. 최근에는 피기박 트랜스포사아제(hyPBase)의 활동적인 버전이6,7로개발되었다. Germline 변환은 최근 FAW에서 달성되었다8,이는 lepidopteran 곤충에 hyPBase를 사용하는 첫 번째 보고서입니다. 본 보고서에서, 형질전환 FAW 생성에 hyPBase mRNA를 채용에 대한 자세한 정보가 설명된다. 여기에 설명된 방법은 다른 lepidopteran 곤충의 변환을 달성하기 위해 적용될 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>1.5" 치과 면 롤</td><td>PlastCare USA</td><td>8542025591</td><td>REARING</td></tr><tr><td>1 oz 수플레 컵 뚜껑</td><td>DART</td><td>PL1N</td><td></td></tr><tr><td>1 oz 수플레 컵</td><td>DART</td><td>P100N</td><td>REARING</td></tr><tr><td>48 oz 플라스틱 델리 용기</td><td>Genpack</td><td>AD48</td><td>REARING</td></tr><tr><td>애드온 필터 세트 (녹색)</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-BLFS-GR</td><td>스크리닝</td></tr><tr><td>붕규산 유리</td><td>셔터 기기</td><td>BF100-50-10</td><td>주입</td></tr><tr><td>붕규산 유리</td><td>셔터 기기</td><td>BF-100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>해부 범위</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td>스크리닝</td></tr><tr><td>깃털급 집게</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>REARING</td></tr><tr><td>거터 가드</td><td>ThermWell 제품</td><td>VX620</td><td></td></tr><tr><td>REARING 거티드 현미경</td><td>올림푸스</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>주입 마이크로 인젝터</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>주입</td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 악기</td><td>P-1000</td><td>주입</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>16004-22</td><td>주입</td></tr><tr><td>NightSea 전체 시스템</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-RB-DIM</td><td>스크리닝</td></tr><tr><td>질소 가스</td><td>AWG / Scott-Gross</td><td>NI 225</td><td>주입</td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>바운티</td><td>&nbsp; 43217-45074</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Spodoptera frugiperda Artificial Diet</td><td>Southland Products, Inc</td><td>N/A [요청 종/수량]</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Spodoptera frugiperda Eggs</td><td>Benzon Research, Inc</td><td>N/A [요청 종/수량]</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Taq MasterMix</td><td></td><td></td><td>폴리메라제 혼합물</td></tr></tbody></table>

가을 육군벌레, 스포드옵테라 검소한에서 활동적인 피기박 트랜스포사스 중재 된 세균라인 변환

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

유전적 화물을 변형 가능한 원소를 사용하여 곤충 게놈에 안정적으로 삽입하는 것은 기능성 게놈 연구및 유전자 해충 관리 전략을 개발하기 위한 강력한 도구입니다. 곤충 변환에서 가장 많이 사용되는 형질 전환 요소는 돼지 박이며, 돼지 박기반 의 생식선 변환은 성공적으로 모델 곤충에서 수행되었습니다. 그러나, 농업 해충을 포함 하는 비 모델 곤충에이 기술을 채택 하는 여전히 도전. 이 논문은 전 세계 농업 해충, 가을 군벌레 (FAW), 스포드 옵테라 검거르다,활동적인 돼지 박 트랜스포사아제 (hyPBase)를 사용하여 생식선 변환에 보고합니다.
이 작품에서 hyPBase mRNA는 배아 미세 주입에서 도우미 플라스미드 대신 에 생산및 사용되었습니다. 이러한 변화는 트랜스제닉 FAW의 성공적인 세대로 이어졌습니다. 더욱이, 형질전환동물의 선별 방법, PCR 계의 신속한 트랜스진 삽입 및 열 비대칭 인터레이스 PCR(TAIL-PCR) 기반의 통합 부위의 결정도 설명된다. 따라서, 이 논문은 FAW 및 그밖 lepidopteran 곤충에 있는 돼지박기지를 둔 전염을 촉진할 환생 FAW를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

hyPBase 함유 T7 프로모터의 발현을 위한 구조: 폴리히드린-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: 폴리헤드론-3'UTR: 폴리(A) 신호가 생성되었다(도1A)및 hyPBase mRNA 생체외(도 1B)를합성하기 위해 ~2.2kb PCR 단편으로 증폭되었다. 이어서, hyPBase mRNA가 생성되고 아가로즈 겔 전기포광을 하였다. 예상 크기의 mRNA(~1.1kb 대역)는 1% 아가로즈겔(도 1C)에서검출되었다.
이어서, 돼지박계EGFP 발현구조(도 2A)를준비하였다. 이 플라스미드 및 hyPBase mRNA 또는 PBS 용액의 혼합물은 oviposition 후 2 시간 이내에 배아로 주입되었습니다. 주사 후...

가을 군벌레, 스포드옵테라 검거르다에서성공적인 생식선 변환은, 활동적인 돼지박 트랜스포사제의 mRNA를 사용하여 달성되었다.

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

이 프로토콜은 돼지 박 기반 변환 시스템을 사용하여 형질 전환 육군 벌레의 생산을 보여줍니다. 우리는 이러한 방법이 가을 육군 벌레뿐만 아니라 lepidopteran 곤충뿐만 아니라 변환을 개선하는 데 도움이되기를 바랍니다. 여기에 설명된 방법은 lepidopteran 해충 곤충의 생식선 변환을 효율적으로 만듭니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 동료 인 Xien Chen 박사가 될 것입니다. 먼저 12개의 수컷 강아지와 12개의 암컷 강아지를 상자에 넣습니다. 성인에게 먹이를 주기 위해 상자에 10% 자당 용액을 놓습니다.종이 타월로 상자를 덮습니다. 둘째 날, 하룻밤 강렬한 빛에 성인을 노출. 3일째에는 성인을 어두운 곳으로 옮는다.위치를 초과 한 후 2 시간 이내에 배아를 수집합니다. 신선한 달걀을 얼음 위에 넣은 신선한 달걀과 함께 종이 타월 조각에 물 방울을 넣습니다. 계란을 미세한 브러시로 유리 슬라이드에 부드럽게 옮기고 유리 슬라이드에 하나씩 정렬합니다.유리 슬라이드를 미세 주입 하기 전에 얼음에 정렬 하는 계란으로 유지 합니다. 마이크로리터 피기박 계 EGFP 발현 마이크로리터 피기박 계 EGFP당 200 나노그램의 혼합물을 마이크로리터 활동적인 피기박 트랜스포사아제 mRNA당 200 나노그램, 자동 마이크로인젝터의 보상 압력을 사용하여 알에 멸균 증류수를 주입한다. 주입된 계란을 섭씨 27도 이상 또는 마이너스 1도, 부화할 때까지 60플러스 또는 마이너스 10%의 상대 습도로 유지하십시오.부화한 애벌레를 인공 식단에 먹이고 각 유충을 초기 커드와 스타 스테이지에서 작은 컵 한 잔으로 옮기습니다. 강아지를 수집하고 케이지에 약 150 여성과 150 수컷 강아지를 배치합니다. 계란을 수집하기 위해 케이지에 크기 15 센티미터 에 의해 30 센티미터 30 센티미터의 종이 타월의 여러 조각을 걸어.매일 달걀로 종이 타월을 수집하고 부화 할 때까지 적절한 조건에서 계란을 유지하십시오. 신난 유충을 섭씨 4도에서 5분간 유지하여 고정한 다음 얼음 냉판에 옮긴다. 형광 스테레오 현미경으로 고정 된 신생아 애벌레를 검사하십시오.EGFP 양성 신생아를 선택하고, 27플러스 또는 섭씨 1도를 뺀 후 약 2주 만에 푸팔 단계로 올리세요. 시험관내에서 합성된 활동적인 피기박 트랜스포사제 mRNA는 1%아가로즈 젤을 사용하여 검출되었다. PDS 주입 배아는 EGFP 신호를 보여주지 않았고, EGFP 표현 플라스미드 및 활동적인 피기박 트랜스포사제 mRNA 주입 배아는 PGP 형광을 보였으며, 이는 돼지박 건설이 성공적이었음을 나타냅니다.G0 성인의 자기 십자가에서 유래 하는 계란에서 얻은 G1 애벌레 강한 EGFP 신호를 보였다. 프로모터 및 EGFP 단편을 함유한 단편은 EGFP 양성 애벌레로부터 분리된 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 성공적으로 증폭되었다. 그러나, 동일한 단편은 유전체 DNA가 야생형 애벌레로부터 템플릿으로 분리되었을 때 검출되지 않았다.미세 주입을 위한 계란은 가능한 한 신선해야 하며, 개발을 늦추기 위해서는 미세 주입 전에 얼음에 보관해야 합니다. 이 기술은 해충 곤충 기능적인 유전체학에 있는 질문에 대답하고 이 글로벌 해충을 위한 유전 통제 방법을 개발하는 연구원을 위한 쪽을 포장합니다.

hyperactive-piggybac-transposase-mediated-germline-transformation

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유전자 변형 벌레는 일반적으로...

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

RNAi는 특정 mRNA의 성적 1-2 최저 수있을 때 모델 생물에서 transgenesis는 유전자 기능을 조작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 necromenic 선충류에 안정적으로 전송 DNA와 과도를 두 번 좌초 RNA를 소개하는 데 필요한 기술을 설명하는 것을...

RNAi는 Necromenic 선충류의 Microinjection에 의해 유전자 최저 및 Transgenesis을 중재 Pristionchus pacificus</em

지중해초파리(medfly) Ceratitis capitata(Diptera: Tephritidae)는 전 세계 농업 해충입니다. 이 식물의 생물학에 대한 깊은 이해는 메드플라이 개체군을 통제하여 경제적 영향을 줄이는 데 중요합니다. 배아 미세주입(embryo microinjection)은 이 종에서 생식세포 형질전환(germ-line transformation)과 역유전학(reverse genetics) 연구를 모두 가능하게 하는 근본적인 도구입니다.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

여기에서 우리는 크리켓 계란을 주입하는 프로토콜을 제시, 크리켓의 많은 실험에서 기초 방법 역할을하는 기술, 포함하되 이에 국한되지 않음, RNA 간섭 및 게놈 조작.

그릴루스 바이마쿨라투스 계란 주입

우리는 사육, 계란의 미세 주입 및 게놈 편집 후 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위해 파이어 브라트 Thermobia 국산의 효율적인 짝짓기를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

기생 선충류 Strongyloides stercoralis 및 Strongyloides ratti 에 대한 기능적 게놈 툴킷에는 트랜스제네시스, CRISPR/Cas9 매개 돌연변이유발 및 RNAi가 포함됩니다. 이 프로토콜은 성선 내 미세주사를 사용하여 전이유전자 및 CRISPR 성분을 S. stercoralis 및 S. ratti에 도입하는 방법을 입증할 것이다.

미세주입에 의한 스트 롱실로이드 종에서 형질전환 및 녹아웃 생성

학습하세요 가을 육군벌레(Spodoptera frugiperda)의 piggyBac 기반 생식계 변환법을 통해 유전자 변형 해충 생산 및 기능 유전체학 연구를 효율적으로 수행하는 방법을.

가을 육군벌레, 스포드옵테라 검소한에서 활동적인 피기박 트랜스포사스 중재 된 세균라인 변환

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