Name: 지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 학습하세요 인간 만능줄기세포 유래 척수 성상세포와 뉴런의 공배양 및 전기생리학 기록 기법을 활용한 ALS 질병 모델링 방법입니다. 이 기술은 신경퇴행성 질환의 세포 상호작용 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 원고는 2019 MSCRFF 5119 (AT)에 의해 지원되었습니다. K08NS102526 NIH / NINDS (CWH), 2020 도리스 듀크 자선 재단 임상 과학자 경력 개발 상 (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). 설명된 전기생리학적 플랫폼을 검증하는 데 활용한 MEA 플랫폼 및 데이터 분석 소프트웨어를 제공한 Raha Dastgheyb 박사와 Norman Haughey 박사에게 감사드립니다. 프로토콜 시연 및 촬영에 도움을 주신 Khalil Rust에게 감사드립니다.

<ol><li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911(2021).</li>
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<li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li>
<li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li>
<li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li>
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<li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416(2018).</li>
<li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li>
<li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li>
<li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).</li>
<li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li>
<li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li>
<li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li>
<li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1%2FS+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

현재까지, 성상 세포-뉴런 공동 배양의 전기생리학적 기록을 위한 hiPSC- 및 MEA-기반 방법은 간질9의 시험관 내 모델링에 대한 보다 광범위한 사용과 대조적으로, ALS6 분야에서 제한적인 적용을 발견하였으며, 여전히 완전한 인간 플랫폼에서는 그렇지 않다. 그러나 이 플랫폼은 신경 과흥분성의 메커니즘, 신경독성에 대한 성상세포의 기여 또는 질병 진행에서 네트워크 활동의 역할과 같은 ALS 연구에서 병태생리학적으로 관련된 질문을 해결할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 또한, 이 플랫폼은 시험관 내에서 9개월 이상 전향적인 전기생리학적 데이터의 수집을 허용하고, 따라서치료 잠재력2을 갖는 화합물을 시험하기 위한 접근법을 제공한다.
문헌에서 발견되는 hiPSC-N 및 hiPSC-A의 생성을 위한 프로토콜은 다른 요인들...

인간 만능줄기세포 유래 성상교세포(hiPSC-A) 및 뉴런(hiPSC-N)은 시험관 내에서 근위축성 측삭 경화증(ALS) 병태생리학을 모델링하기 위한 강력한 도구이며 약물발견 전략을 위한 번역 패러다임을 제공합니다1. 연구자들은 hiPSC-A와 hiPSC-N의 공동 배양이 두 세포 유형의 형태학적, 분자적, 전기생리학적 및 약리학적 성숙을 향상시켜 복잡한 뉴런 네트워크와 생체 내 대응물과 유사한 성상세포-뉴런 상호작용을 생성한다는 것을 입증했습니다2,3. 유사한 공동 배양 실험은 성상 세포 매개 신경 독성 4,5 및 신경 과흥분성6과 같은 ALS 병리학의 특징을 요약할 수 있습니다. 또한 분화 프로토콜의 발전으로 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)는 피질 및 척수 hiPSC-A 및 hiPSC-N 7,8을 포함한 지역 별 신경 아형으로 분화 될 수 있습니다. 이러한 전략은 ALS에서 피질 및 척추 운동 뉴런 병리를 모델링 할 수있는 잠재력을 제공 할뿐만 아니라 성상 세포 영향 모두에 대한 성상 세포 영향을 제공합니다. 그러나 이를 위해서는 이러한 효과를 결정하기 위한 재현 가능한 기능 분석이 필요합니다.
최근에는 다중 전극 어레이 (MEA) 기록이 뉴런-성상 세포 공동 배양의 전기 생리 학적 특성화에 특히 적합하다는 것이 밝혀졌습니다2. 단일 세포 전기생리학적 분석과 달리 이러한 고밀도 전극 어레이는 배양 조건을 방해하고 세포막의 무결성을 보존하지 않고 대규모 뉴런 집단의 세포외 전위를 수동적으로 기록합니다. 이러한 플랫폼은 시간이 지남에 따라 그리고 약리학적 조작에 대한 반응으로 배양물의 세포 및 네트워크 활동을 기록하는 데 특히 유용합니다. 마지막으로, 성상 세포의 존재가 배양 변수 인 경우 MEA 기록은 성상 세포-뉴런 양방향 상호 작용에 대한 기능적 통찰력을 제공 할 수 있습니다 2,9.
여기에 제시된 것은 hiPSC를 척수 hiPSC-A 및 hiPSC- 운동 뉴런 (MN)으로 분화하기위한 최적화 된 프로토콜입니다 이전에 검증 된2. 척수 hiPSC-A 분화 프로토콜은 각각 세포의 최대 80%, 50% 및 90%에서 S100 칼슘 결합 단백질 B(S100β), 신경교섬유소 산성 단백질(GFAP) 및 호메오박스 B4(HOXB4)에 대해 양성인 성상세포 배양을 일관되게 초래하여 성숙 신경교 및 척수 사양 2,10을 나타냅니다. . hiPSC-MN 분화 프로토콜은 콜린 아세틸 트랜스퍼 라제 (ChAT)에 대해 >90 % 양성인 뉴런을 생성하며, 이는 성숙한 알파 운동 뉴런 정체성2을 암시합니다. 또한, 이 프로토콜은 성상세포가 없거나 설치류 성상세포2가 있는 뉴런 배양과 비교할 때 Scholl 분석 및 면역형광 현미경에 의해 향상된 형태학적 복잡성을 갖는 뉴런을 생성하는 것으로 이전에 입증된 hiPSC-A/MN 공동 배양의 생성 기술을설명합니다. 이러한 설명은 척수 hiPSC-A 및 hiPSC-N에 특이적이지만, 독특한 이점은 성상 세포와 뉴런의 초기 독립 배양에 이어 이후 시점에서 공동 배양하는 단계가 다른 특정 영역뿐만 아니라 질병 특이 적 세포로부터의 뉴런-성상 세포 상호 작용의 효과를 연구하도록 번역 될 수 있다는 것입니다 7,8 . 마지막으로, 프로토콜은 MEA 플레이트에서 이러한 배양을 성장시키는 방법을 설명하여 공동 배양 조성물의 인자로서의 기능적 활성이 세포 조성 및 배양 조건을 조작하는 능력으로 시간이 지남에 따라 연구될 수 있도록 합니다.
이러한 프로토콜의 목표는 성상 세포-뉴런 상호 작용을 조사하고, 질병 특이적 변화를 조사하고, ALS 분야에서 치료 가능성이 있는 약물을 테스트하기 위한 기능 분석을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜의 가장 어려운 단계에 대한 비디오 지침이 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>10cm 멸균 배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 멸균 배양 플라스크</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (&beta;-ME)</td><td>Thermofisher</td><td>21985023</td><td>Working concentration 110 &micro; M</td></tr><tr><td>500 mL 0.2 &마이크로; m CA 필터 시스템</td><td>Corning</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 피펫</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 멸균 배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>3046</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericine B</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>작업 농도 2.0 &mu; 프로</td></tr><tr><td>테아제 효소가 함유된 g/mL 음이온 세제 - Terg-A-Zyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>작업 농도 1% m/v</td></tr><tr><td>아스코르브산(ASAC)</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>100mg을 250mL의 dH2O에 용해하면 0.4mg/ml 스톡을 얻을 수 있습니다. 0.22 &micro를 통한 멸균 필터; m 필터, 부분 표본 및 -80에서 동결 &ordm;C. 사용을 위해 1:1000에서 희석합니다. (작업 농도 0.4 & micro; g/mL)입니다.</td></tr><tr><td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td><td>Axion</td><td>OPT-24</td><td></td></tr><tr><td>Axion Edge MEA 플랫폼</td><td>Axion</td><td>Maestro Edge</td><td></td></tr><tr><td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>프로토콜 내 상세</td></tr><tr><td>정보 탁상용 현미경(멸균 세포 배양 후드)</td><td>Zeiss</td><td>415510-1100-000</td><td>Primo Vert</td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14340</td><td>작업집중10 &mu; M</td></tr><tr><td>섬모 neurotrophic factor (CNTF)</td> <td>Peprotech</td><td>450-13</td><td>100 &micro를 용해하십시오; g를 멸균 PBS 1mL에 넣은 다음 멸균 0.1% BSA-PBS 9mL를 10 &마이크로에 첨가합니다. g/mL입니다. -80에서 부분 표본 및 동결 &ordm;C. 1:1000에서 희석하여 사용합니다. (작업 농도 10ng/mL).</td></tr><tr>Axion Edge <td>AirGas/Harris</td><td>9296NC</td><td></td>Compound E Abcam ab142164<td>용 CO2 탱크 및 레귤레이터</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>디졸브 250 &마이크로; 2.0387 mL의 DMSO에서 g를 사용하여 250 &micro를 얻습니다. M 재고. -80에서 분취 및 동결 &ordm;C. 사용을 위해 1:2000을 희석합니다. (작업 농도 125 nM).</td></tr><tr><td>시안키살린&nbsp; (CNQX)</td><td>시그마 알드리치</td><td>C239</td><td>작업 집중도 50 &mu; M</td></tr><tr><td>Dihydrokainic acid (DHK)</td><td>Tocris</td><td>111</td><td>작업 농도 50 &mu; M 및 300 &mu; M</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>113300</td><td>작업 농도 1x</td></tr><tr><td>필수 8 중간 + 필수 8 보충제</td><td>Thermofisher</td><td>A1517001</td><td>필수 8 (10x) &nbsp 보충제 10 mL와 필수 8 성장 배지 (1x)를 결합합니다</td></tr>. <tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermofisher</td><td>16140071</td><td>작업 농도 1x</td></tr><tr><td>Glial 세포주 유래 신경 영양 (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>100 &마이크로를 용해하십시오; g를 PBS 1mL에서 100 &마이크로로; g/mL를 선택한 다음 9mL의 멸균 0.1% BSA-PBS를 10 &micro에 첨가합니다. g/mL입니다. -80에서 부분 표본 및 동결 &ordm;C. 1:1000에서 희석하여 사용합니다. (작업 농도 10ng/mL).</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Election Microscopy Sciences</td><td>63510-20</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Millipore-sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>PBS 100mL에 200mg을 용해하면 2mg/mL의 원액을 얻을 수 있습니다. 15 mL 및 500 &micro로 스톡을 분주합니다. L 튜브. 사용을 위해 1:1000으로 희석하십시오. (작업 농도 2 & 마이크로; g/mL)입니다.</td></tr><tr><td>습도 조절식 세포 배양 인큐베이터</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td>을 <td>37로 설정 &ordm; C, 5 % CO2</td></tr><tr><td>인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)</td> <td>R & D 시스템</td><td>291-G1-200</td><td>디졸브 200 & 마이크로; g를 PBS 2 mL에서 100 &마이크로로; g/mL, 그런 다음 10 &마이크로를 만들기 위해 0.1%BSA-PBS의 18mL를 추가합니다. g/mL 재고 및 -80 &ordm;C. -80에서 부분 표본 및 동결 &ordm;C. 10 &micro 희석; 1의 g/mL 재고: 1000 사용. (작업 농도 10ng/mL).</td></tr><tr><td>Kainc acid</td><td>Abcam</td><td>ab144490</td><td>작업 농도 5 &mu; M</td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 대체품(KSR)</td><td>Thermofisher</td><td>10828</td><td>작업 농도 1x</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher</td><td>23017-015</td><td>원액 1 mg/mL, 작업 농도 10 &마이크로; g/mL (코팅), 1 & 마이크로; g/mL (세포 매체)</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>LDN 2mg을 500 마이크로로 용해합니다. 10mM 스톡을 얻기 위한 클로로포름의 L. 이것을 분취하고 -80 &ordm;C에서 동결합니다. 사용을 위해 먼저 스톡 1-10을 DMSO [1mM]로 희석한 다음 1mM의 1:5000을 원하는 매체에 희석하여 0.2 &micro를 얻습니다. M 작업 용액</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermofisher</td><td>25030</td><td>작업 농도 100x</td></tr><tr><td>MEA 유리판</td><td>다중 채널 시스템</td><td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td><td></td></tr><tr><td>다중 채널 Pipet P200</td><td>Gilson</td><td>PJ22224</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>작업 농도 1x</td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA)</td><td>Thermofisher</td><td>11140050</td><td>작업 농도 100x</td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>작업 농도 100x</td></tr><tr><td>폴리오르니틴(PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td>100mg을 ddW 1mL에 용해시켜 100mg/mL 원액을 얻습니다. 주식을 100 &micro로 분취하십시오. L 튜브. (작업농도 100 &Micro; g/mL)</td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>NA</td><td></td><td>작업 농도100mM</td></tr><tr><td>푸르모르파민(PMN)</td><td>밀리포어-시그마</td><td>540223</td><td>9.6mL의 DMSO에 5mg을 용해하여 1mM 용액을 얻습니다. -80에서 부분 표본 및 동결 &ordm;C. 사용을 위해 1:1000으로 희석합니다. (작업 농도 1 &Micro; M)을 사용합니다.</td></tr><tr><td>재조합 인간-뇌 유래 신경영양인자(BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>원심분리기 재구성 전 잠깐. 100 & 마이크로를 용해하십시오. g를 1 mL의 PBS에서 100 &마이크로로; g/mL를 선택한 다음 9mL의 멸균 0.1% BSA-PBS를 10 &micro에 첨가합니다. g/mL입니다. -80에서 부분 표본 및 동결 &ordm;C. 1:1000에서 희석하여 사용합니다. (작업 농도 10ng/mL).</td></tr><tr><td>레티노산(RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>100mg을 DMSO 3.3mL에 용해시켜 100mM의 원액을 얻습니다. 주식 부분 표본 100 &micro; L/튜브 및 -80 &ordm;C에서 동결. 200 & 마이크로를 취하십시오. 100mM 스톡을 L로 만들고 10배(DMSO 1.8mL 추가)를 희석하여 10mM 스톡을 만듭니다. 부분 표본 50 &마이크로; L/튜브&nbsp; -80 &ordm;C에 보관하십시오. 사용을 위해 1:10000에 희석합니다. (작업 농도 2 & 마이크로; M)을 사용합니다.</td></tr><tr><td>ROCK-I는</td><td>Peprotech</td><td>1293823</td><td>1480 &micro에 5mg을 용해시킵니다. 10mM 스톡을 얻기 위해 dH2O의 L, -80 &ordm;C에서 분취 및 동결. 사용을 위해 1:500에서 희석합니다. (작업농도 20 &마이크로; M)을 사용합니다.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>5mg을 1.3mL의 DMSO에 용해시켜 10mM의 원액을 얻습니다. -80에서 분취 및 동결 &ordm;C. 사용을 위해 1:1000에서 희석합니다. (작동 con 10 & micro; M)</td></tr> <tr><td>멸균 세포 배양 후드</td><td>Baker Company</td><td>SG-600</td><td></td></tr><tr><td>보충제 B - B27 보충제</td><td>Thermofisher</td><td>21985023</td><td>작업 농도 50x</td></tr><tr><td>보충제 N - N2 보충제</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>작업 농도 100x</td></tr><tr><td>탁상용 세포 배양 원심 분리기</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>75004261 Sorvall Legend X1R</td></tr><tr><td>열가소성&nbsp; 필름 - Parafilm</td><td></td><td>PARAFILM P7793</td><td></td></tr><tr><td>조직 해리 프로테아제 - Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td>작업 농도 1x</td></tr><tr><td>트립신 억제제</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>100mL ddH2O에 1g을 용해하여 10mg/mL 스톡을 얻습니다. 분취량으로 4 &ordm;C에 보관하십시오. 사용을 위해 트립신 부피를 1:10으로 희석합니다. (작동 농도 1 mg/mL).</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.05 %)</td> <td>써모 피셔</td><td>2530054</td><td>작업 농도 1x</td></tr><tr><td>수조</td><td>ThermoFisher</td><td>2332</td><td>Isotemp</td></tr></tbody></table>

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 als 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

인간 만능 줄기세포 유래 성상세포(hiPSC-A) 및 뉴런(hiPSC-N)은 시험관 내에서 근위축성 측삭 경화증(ALS) 병태생리학을 모델링하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 다중 전극 어레이(MEA) 기록은 대규모 뉴런 집단의 전기장 전위를 기록하고 시간 경과에 따른 네트워크 활동을 분석하는 수단입니다. 척수 성상 세포 표현형을 촉진하는 기술을 사용하여 분화되는 hiPSC-A의 존재가 hiPSC-A없이 배양되거나 설치류 성상 세포가있는 상태에서 배양 된 것과 비교할 때 국소 특이 적 척수 hiPSC- 운동 뉴런 (MN)의 성숙 및 전기 생리 학적 활성을 향상 시킨다는 것이 이전에 입증되었습니다. 여기에 설명된 것은 척수 hiPSC-A를 hiPSC-MN과 공동 배양하고 MEA 기록을 사용하여 전기생리학적 활성을 기록하는 방법입니다. 여기에 설명된 분화 프로토콜은 척수에 지역적으로 특이적인 성상세포 및 뉴런에 특화된 반면, 공동 배양 플랫폼은 피질 hiPSC-A 및 hiPSC-N을 포함한 다른 운명에 특정한 기술로 분화된 성상세포 및 뉴런에 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 신경교-뉴런 상호 작용에 대해 알리고 ALS에서 치료 가능성이 있는 약물을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공하기 위한 전기생리학적 분석을 제공하는 것을 목표로 합니다.

hiPSC-MN 및 척수 hiPSC-A의 생성을 위한 척수 패터닝 프로토콜은 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 프로토콜에서 hiPSC는 비 합류 콜로니로 유지되고 계대됩니다 (그림 2A). 신경 발생은 LDN193189 및 SB431542의 첨가에 의한 이중 SMAD 억제를 통해 개시 (신경 유도)되며, 각각 골 형태 형성 단백질 (BMP) 및 형질 전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 경로를 비활성화합니다. 이 단계에서는 hiPSC를 부착성 매트릭스, 즉 기저막 매트릭스에 플레이팅하여 신경상피와 유사한 2D 배양을 생성하는 단층 기반 방법이 사용됩니다. 형태 학적으로 신경 유도는 큰 핵과 둥근 모양을 가진 iPSC에서 큰 세포질과 원통형으로 단단히 압축 된 신경 상피 (줄기) 세포로의 전환으로 표시됩니다. 이 세포들은 수평과 수직으로 분열하여 다층 상피를 생성합니다 (그림 2B</str...

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

오늘 우리가 제시하는 기술은 내재적 신경 요인과 주변 성상 세포의 영향으로 인한 척수 뉴런 활동의 분석을 허용합니다. 이 기술은 척수에 특정한 인간 뉴런과 인간 성상 세포를 모두 안정적으로 생성하고 재현성을 위해 확장 할 수있는 기능적 출력 측정을 사용합니다. 우리가 제시하는 기술은 산발적 또는 유전 질환 환자의 뉴런을 사용하여 근 위축성 측삭 경화증과 같은 척수 뉴런 특정 질병을 조사 할 수있게합니다.우선, 콜로니의 중앙에 흩어져있는 흰색 영역이 표시되도록 충분히 조밀 한 콜로니에 대한 인간 iPSC 플레이트를 검사하십시오. 그런 다음 셀 포장을 시작하려면 마커로 플레이트의 하단 외부 표면에 격자 선을 그려 전체 플레이트를 정확하게 덮을 수 있습니다. 배양 후드에서 10배 배율의 위상차 현미경을 사용하여 200마이크로리터 피펫 팁으로 수동으로 긁어 분화된 콜로니를 분리합니다.다음으로 플레이트를 PBS로 두 번 헹굽니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 예열 된 5 밀리리터의 조직 해리 프로테아제를 첨가하십시오. 플레이트에서 콜로니를 들어 올리기 전에 콜로니의 가장자리가 둥글게 시작될 때까지 섭씨 37도에서 4-7 분 동안 세포를 배양합니다.해리 프로테아제를 조심스럽게 흡인하고 콜로니를 제거하지 않고 PBS로 플레이트를 두 번 부드럽게 헹굽니다. 5 밀리리터의 사전 예열 된 인간 iPSC 배지를 배양 플레이트에 첨가하십시오. 그런 다음 위에서 아래로 앞뒤로 움직여 5 밀리리터 피펫 끝으로 전체 플레이트를 긁고 콜로니를 들어 올리면서 더 작은 세포 응집체로 분해합니다.인간 iPSC를 신경 전구 세포로 분화합니다. 인간 iPSC가 단층을 형성하고 90% 합류하면 원고에 설명된 대로 분화를 시작합니다. 12일째, 트립신 처리 후, 세포가 현탁 상태에 있지 않은 경우, 1000 마이크로리터 피펫 팁에서 신경 유도 배지를 세포 전체에 원을 그리며 분출하여 전체 표면을 덮음으로써 기계적으로 세포를 분리합니다.신경 전구 세포 배양 물이 동결되면 해동하십시오. 원고에 기재된 배지 교환 및 PBS 헹굼 후, 배지를 0.02 마이크로몰 시토신 아라비노사이드를 함유하는 운동 뉴런 분화 배지로 변경한 다음, 신경교세포 커밋 전구세포가 유사분열 후 운동 뉴런 전구체 하에서 단일 증식 편평한 세포로 나타날 때 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 48시간 동안 세포를 배양하고, 셀 클러스터에서 집계됩니다. 나중에 원고에 표시된대로 중간 교환을 수행했습니다.도금 당일 또는 그 전, 먼저 PLO를 물 또는 PBS에 희석하여 24웰 MEA 플레이트의 코팅을 시작합니다. 그런 다음 각 웰에 15-20 마이크로 리터의 PLO를 추가하여 웰 중앙에 액적을 형성하고 전극 영역을 덮어 피펫 팁으로 전극이 손상되지 않도록합니다. 우물 주변의 구획에 물을 추가하여 충분한 습도를 확보하십시오.그리고 PLO를 섭씨 37도에서 1 내지 2시간 동안 배양한다. 그런 다음 플라스틱 마이크로 피펫 팁을 사용하여 전극을 만지지 않고 가능한 한 많은 PLO를 흡인합니다. 다음으로 250 마이크로 리터의 물로 우물을 세 번 씻으십시오.피펫 팁을 사용하여 가능한 한 많은 물을 제거하고 뚜껑을 제거한 상태에서 표면을 건조시킵니다. 다음으로, 15 내지 20 마이크로리터의 희석된 라미닌을 첨가하여 각각의 전극 어레이를 덮는다. 습도 구획에 물을 추가하고 뚜껑을 교체 한 후 섭씨 37도에서 최소 2 시간에서 밤새 배양하십시오.도말 당일, 운동뉴런과 성상세포 배양액을 PBS로 한 번 헹군 후 0.05%트립신을 첨가하고 섭씨 37도에서 약 5분간 배양하여 세포를 들어 올립니다. 트립신 억제제가 들어있는 15 밀리리터 원추형 튜브에 세포를 모으십시오. 그리고 모든 세포가 수집되도록 매체 또는 베이스로 플레이트를 세척합니다.중심화에 의해 세포를 펠릿 다운합니다. 그런 다음 1000 마이크로리터 피펫을 사용하여 20마이크로몰의 ROCK 억제제가 포함된 공동 배양 배지로 운동 뉴런과 성상세포를 재현탁하여 1밀리리터의 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 혈구계를 사용하여 운동 뉴런과 성상 세포를 세십시오.그리고 세는 동안, 세포 현탁액을 유지하고 섭씨 4도의 스티로폼 랙에 넣었다. 두 세포 현탁액 1 밀리리터를 300 배 G에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 원하는 부피를 계산하고 펠릿을 다시 현탁하십시오.필요한 양의 뉴런과 성상 세포 현탁액을 같은 비율로 결합하고 피펫팅으로 부드럽게 두 번 혼합하여 완전히 결합합니다. 그런 다음 플레이트의 각 웰에서 라미닌을 제거하고 10 마이크로 리터의 최종 결합 셀 현탁액을 각 웰로 옮겨 전극 어레이를 덮는 작은 액적을 형성합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 방해받지 않은 세포 방울과 함께 20 내지 30분 동안 배양하여 플레이트 상에 초기 부착물을 형성한다.이어서 ROCK 억제제를 함유하는 250 마이크로리터의 따뜻한 공동 배양 배지를 각 웰의 벽에 내려놓고 각 웰의 반대쪽 벽에 동일한 부피를 피펫팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 24 내지 36시간 동안 인큐베이션한다. 다음날, 판에 파편이나 죽은 세포가 있는지 검사하십시오. 필요한 경우, 배지를 ROCK 억제제를 함유하는 새로운 공동 배양 배지로 교환한다.그렇지 않으면 공동 배양 둘째 날부터 ROCK 억제제가 없는 공동 배양 배지를 사용하여 일주일에 두 번 반배지 교환을 수행합니다. 녹음을 수행하려면 공동 배양 첫날 온도를 섭씨 37도, 이산화탄소를 5%로 설정하여 가능한 한 빨리 시작한 다음 플레이트를 녹음기로 옮기고 녹음하기 전에 최소 5분 동안 평형을 이룹니다. 실험 설계에 따라 격일로 또는 매주 1-15분에 걸쳐 기준 활동을 기록합니다.뉴런이나 성상 세포를 표적으로 하는 화합물의 일시적인 전기생리학적 효과를 조사하려면 플레이트 뚜껑을 제거하되 기계 뚜껑을 닫은 상태로 유지하고 최소 1분 동안 기준 활동을 기록하십시오. 전기 생리 학적 기록을 중단하지 않고 수동으로 기계 뚜껑을 열고 25 마이크로 리터의 배지를 적절한 약물 운반체와 교환하십시오. 그런 다음 수동으로 뚜껑을 닫고 필요한 경우 추가 분 동안 녹음하십시오.마찬가지로 관심있는 약물을 테스트하십시오. 이 프로토콜에서 hiPSC는 비 합류 콜로니로 유지되고 계대되었습니다. 신경 발생은 BMP 및 TGF- 베타 경로를 비활성화함으로써 이중 SMAD 억제를 통해 시작되었습니다.그 결과 신경 상피 줄기 세포가 분열되어 다층 상피가 생성되었다. 신경 성장 인자와 신경신성 섬모 신경영양 인자에 대한 조기 노출은 전구 세포의 혼합 집단을 생성했습니다. 뉴런은이 혼합 된 집단에서 자발적으로 나타났습니다.교신성 스위치는 JAK-STAT 경로의 활성화를 통해 성상세포 분화를 유도했습니다. 노치 억제제 처리 및 분화된 운동 뉴런 세포의 척수 동일성은 높은 콜린 아세틸트랜스퍼라제 발현 수준에 의해 뒷받침되었습니다. 시험관 내 배양 후 90일째에 인간 iPSC 성상교세포는 S100 베타 및 GFAP 발현으로 표시된 성숙한 표현형을 나타냈으며, 척수 영역 정체성은 이전에 매의 발현에 의해 뒷받침되었습니다.공동 배양 된 세포는 성상 세포와 함께 자발적으로 재배열되어 하단에 공급 층을 생성하고 상단에 네트워크를 연결하는 뉴런을 만듭니다. 뉴런은 단독으로 배양할 때 큰 세포 클러스터로 응집되는 반면, 인간 iPSC 운동 뉴런과 인간 iPSC 성상세포의 공동 배양은 단층이 고르게 분포된 결과를 낳았습니다. 인간 iPSC 성상 세포는 공동 배양에서 더 높은 수준의 스파이크 및 파열 활동으로 나타난 바와 같이 인간 iPSC 운동 뉴런의 전기 생리 학적 성숙을 향상 시켰습니다.우리의 경험에 따르면 줄기 세포 배양과 초기 NPC 분화는 기술적 오류에 가장 어렵고 민감합니다. 이 단계에서는 문제 해결을 위한 여유가 거의 없이 일관되고 정확하게 기술을 수행해서는 안 됩니다. 여기에 설명된 공동배양 기술은 다른 세포 유형 특이적 모델에서도 사용될 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 인간 만능 줄기 세포의 전구 세포에서 천체권을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 성장 인자와 키나아제 억제제를 포함하는 영양 배지를 가진 줄기 세포의 성장과 증식을 포함합니다. 그런 다음 이 세포는 응집되어 성상세포로 분화하여 천체권을 형성합니다.

인간 만능 줄기 세포를 이용한 천체권 생성 및 유지

이 비디오는 척수 신경 전구 세포(NPC)를 운동 뉴런으로 구별하는 방법을 보여줍니다. NPC가 성숙한 운동 뉴런으로 분화하는 것을 촉진하기 위해 특정 억제제가 풍부한 특수 배지를 사용하여 코팅된 배양 플레이트에서 NPC의 배양 과정을 자세히 설명합니다.

Spinal Cord Neural Progenitor Cells를 Motor Neuron으로 분화

이 비디오는 뉴런 네트워크 활동을 기록하기 위한 뉴런-성상세포 공동 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. MEA(Multi-electrode Array) 플레이트에서 운동 뉴런과 성상세포의 공동 배양을 확립한 후, MEA를 사용하여 뉴런 네트워크의 동기 리듬 전기 활동을 세포 외로 기록했습니다.

Neuron-Astrocyte 공동 배양에서 Neuronal Network의 전기생리학적 활동 기록

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

우리 쇼케이스 경도 정렬된 astrocytic somata 소설 소재 넣음 내 프로세스의 자기 조립, 3 차원 번들의 개발. 이러한 "생활 건설 기계", 아직 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘을 공부 하거나 감독 신경 마이그레이션 및 axonal neuroregeneration를 용이 하 게 하 역할 수 센티미터 길이, 확장 미크론 단위 직경을 전시 설계 길입니다.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

우리는 유도 된 신경 전구 세포 (iNPC)로 인간의 피부 유래 섬유 아세포와 유도 된 천체 세포 (iA)로 후속 분화를 재프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 대량으로 iNPC 및 iA의 빠르고 재현 가능한 생성으로 이어집니다.

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

학습하세요 인간 만능줄기세포 유래 척수 성상세포와 뉴런의 공배양 및 전기생리학 기록 기법을 활용한 ALS 질병 모델링 방법입니다. 이 기술은 신경퇴행성 질환의 세포 상호작용 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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