Name: 세포 없는 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 학습하세요 롤링 서클 증폭을 활용한 세포 없는 단백질 합성을 위한 신속한 DNA 템플릿 생성 방법입니다. 이 기술은 합성 유전자 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다.

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저자는 NIH 1R35GM138265-01 및 NSF 2029532 이 프로젝트의 부분적인 지원을 인정합니다.

1. 유전자 단편 설계
참고: 유전자 단편은 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 시작 코돈, 관심 유전자 및 종기 작성기를 포함하여 전사/번역에 필요한 모든 유전 적 요소를 가져야합니다. 종결자는 선형 식 템플릿(LET)에 필요하지 않지만 사용자가 플라스미드에 시퀀스를 삽입하기로 결정하는 경우 중요합니다. 이러한 시퀀스는 T7 프로모터를 사용하는 pJL1-sfGFP 플라스미드55(마이클 제웨트의 실험실에서 받은 선물)에서 해제되었습니다. 이러한 필수 유전적 원소 외에도, 제한 효소 절단 부위는 발기인(5' 절단 부위) 앞에 6개의 염기 쌍을 추가하고, 다른 6개의 기본 쌍은 종료기(3' cut site) 후에 추가되고, 이 경우 힌드III(다른 제한 효소를 사용할 수 있습니다,하지만 라이브러리에 보관하는 데 필요한 수를 줄이기 위해 하나의 높은 충실도 제한 효소로 서열을 표준화하는 데 도움이 된다). 프라이머 사이트는 5'컷 사이트의 상류 10개의 기본 쌍과 3' 컷 사이트의 하류 10개의 기본 쌍을 추가하며, 이 경우 표준화된 M13 프라이머 시퀀스(프라이머는 저렴한 재고 항목)를 사용합니다. 사용되는 제한 효소 사이트및 프라이머는 사용자의 재량에 따라 사용됩니다. 그러나 사용자는 서열이 템플릿의 다른 곳에 존재하지 않는지 확인해야 합니다(원치 않는 컷 또는 증폭 개시 사이트를 만들고 싶지 않음). 이 작업에 사용되는 템플릿의 시퀀스는 보충 자료에 자세히 설명되어 있습니다. 이러한 단계는 이 기본 템플릿에서 수정하는 데 사용됩니다.
<ol><li>대장균에서 발현된 경우 아미노산 서열 또는 유전서열을 발현하고 얻을 수 있는 원하는 유전자를 결정한다.</li>
	<li>아미노산 서열인 경우, 많은 표준 공급 업체도구(56)중 하나를 사용하여 대장균에 대한 코돈 최적화를 수행한다. 보충에 제공된 템플릿을 사용하는 경우 최적화된 시퀀스에 힌드III 제한 사이트(AAGCTT)가 없는지 확인합니다. 이 경우 더 이상 HindIII 사이트가 없을 때까지 시퀀스를 계속 최적화합니다.</li>
	<li>서열을 복사하여 관심 유전자가 표시된 보충 서열 #1에 대한 제공된 템플릿에 붙여 넣습니다. sfGFP를 표현하는 경우 보조 시퀀스 #1을 있는 것처럼 사용하십시오. 서브틸리신을 표현하는 경우, 보충 시퀀스 #2를 사용하십시오.</li>
	<li>바람직한 DNA 합성 서비스에서 최소한의 템플릿과 필요한 프라이머를 주문한다.</li>
</ol>2. 유전자 단편및 프라이머 를 다시 일시 중단
참고: 유전자 단편을 수령하면 제조업체의 프로토콜을 따라 재발 을 방지하거나 이 간단한 가이드를 사용하여 DNA 스톡을 만듭니다.
<ol><li>원심 분리 튜브 (300 x g for 5 s) 하단에 DNA 펠릿을 수집합니다.</li>
	<li>이중 증류수(ddH2O)를 추가하여 DNA 템플릿의 10 ng/μL의 최종 농도를 만듭니다.</li>
	<li>5-10 초의 중간 설정에 대한 용액을 소용돌이.</li>
	<li>50°C에서 20분 동안 배양하여 전체 펠릿을 녹입니다.</li>
	<li>잠시 소용돌이 다시</li>
	<li>300 x g의 원심분리기는 튜브 의 하단에 있는 용액을 수집합니다.</li>
	<li>-20°C에 보관하거나 PCR에 사용하십시오.</li>
	<li>뉴클레아제없는 물에 프라이머를 다시 분리하여 100 μM 프라이머 재고를 준비합니다. 첨가물의 양을 결정하기 위해, lyophilized 프라이머의 나노몰수를 10배곱한다. 예를 들어, 튜브에 45nM의 리오필화된 프라이머가 포함되어 있는 경우 ddH2O의 450 μL을 추가하고 용액을 소용돌이시다.</li>
	<li>프라이머 스톡 용액을 -20°C에 저장하거나 증폭을 계속 수행합니다.</li>
</ol>3. PCR을 통해 유전자 단편 증폭
참고: 관심 유전자에 적합한 PCR 키트를 결정합니다. 더 작은 유전자 (<1,000 kb)는 더 싼 Taq 폴리머라아제에 더 순종적 일 수 있으며, 더 큰 유전자 (≥1,000 kb)는 오류를 줄이기 위해 높은 충실도 폴리머라제의 혜택을 누릴 수 있습니다. 사용자가 초기 유전자 단편 보존에 관심이 없는 경우 이 초기 PCR 증폭이 필요하지 않다는 점에 유의하는 것이 중요합니다(순환화에 여러 번 의한 시도를 제공하고 LET 대 RCA 제품의 비교 연구를 허용). 또한 이 PCR 증폭 LET이 반응에 직접 사용할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나, 소개에서 언급 한 바와 같이, 그것은 단지 추가 증폭 단계를 무시하는 경우에만 반응의 제한된 수를 허용 할 것이다. 소화 및 결찰은 직접 재중단 된 유전자 단편(57)에서 수행 될 수 있습니다 (확실한 경우, 추가 순환 스톡을 수행하기 위해 더 많은 LET이 필요하지 않습니다). 이 경우 섹션 3을 건너뛰고 섹션 4를 계속합니다. PCR을 수행하면 다음 단계를 따르십시오.
<ol><li>2.8 단계에서 100 μM 스톡을 사용하여 10 μM 작업 솔루션을 만듭니다. 많은 PCR 키트 프로토콜은 프라이머의 10 μM 솔루션을 요구합니다.</li>
	<li>키트 제조업체의 프로토콜에 따라 반응을 수행하도록 열 사이클러를 프로그래밍합니다. 다른 키트는 약간 다양한 사이클링 매개 변수를 요구합니다. 재료의 표에나열된 키트의 경우, 조건은 초기 변성 30 s에 대한 94 °C입니다; 30초동안 94°C의 30사이클, 30초의 프라이머 어닐링, 68°C의 연장; 5 분 동안 68 °C에서 최종 연장; 그리고 마지막으로, 10 °C 무기한 홀드.<ol>
<li>올바른 신장 시간을 선택해야 합니다(증폭되는 유전자의 길이에 따라 변수). 1,000 bp마다 신장 시간이 1분입니다.</li>
		<li>프라이머에 대한 올바른 어닐링 온도를 입력해야 합니다. 두 프라이머를 입력으로 사용하여 최고의 어닐링 온도58을결정하는 온라인 TM 계산기를 사용합니다. M13 프라이머를 사용할 때 45°C의 어닐링 온도가 충분합니다.</li>
		<li>사이클 수를 결정할 때 제조업체의 프로토콜을 참조하지만 30사이클은 대부분 충분한 증폭을 초래합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR을 수행하는 경우 dNTP를 해동하고 소용돌이시다. 키트에 제공된 PCR 버퍼를 사용합니다.</li>
	<li>단일 PCR 튜브에서 제조업체의 프로토콜에 지시된 대로 모든 키트 구성 요소를 결합합니다. 성공적인 증폭을 위해, 1 μL의 암페어 DNA 스톡(2.6단계)을 추가합니다.</li>
	<li>5-10s의 중간 설정에 대한 소용돌이를 통해 혼합물을 부드럽게 균질화합니다. 또는 피펫의 부피를 10-20배 위아래로 소용돌이로 반쪽.</li>
	<li>PCR 반응을 수행합니다.</li>
	<li>PCR 프로토콜에 최종 냉각 단계가 포함되지 않은 경우, 튜브의 바닥으로 응축을 구동하기 위해 제거하기 전에 10 °C에서 5 분 동안 반응을 냉각 할 수 있습니다.</li>
	<li>공급업체의 지시에 따라 PCR 정리 키트를 사용하여 반응을 정화합니다.<ol>
<li>1.5 mL 튜브에서 DNA 결합 버퍼 및 PCR 샘플을 각각 5:1의 비율로 추가합니다.</li>
		<li>이 혼합물을 스핀 컬럼과 원심분리기로 1분 간 16,000 x g로 옮긴다. 흐름을 삭제합니다.</li>
		<li>200 μL의 DNA 세척 버퍼를 컬럼에 넣고 실온에서 1분 동안 배양합니다.</li>
		<li>원심분리기는 16,000 x g에서 1분 동안 원심분리기를 제거하고 흐름을 폐기합니다.</li>
		<li>1분 배양 단계 없이 2.8.3 및 2.8.4 단계를 반복합니다.</li>
		<li>16,000 x g에서 1-2분 추가로 원심분리기를 사용하여 남은 버퍼를 제거합니다.</li>
		<li>ddH2O의 46 μL에서 DNA를 엘테.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분광광계를 사용하여 정제된 DNA를 정량화합니다.</li>
	<li>정제된 DNA를 -20°C에 저장하거나 다음 단계로 진행한다.</li>
</ol>4. 소화 및 순환화
참고: RCA 다음에 DNA를 순환시킴으로써 추가 증폭을 달성할 수 있다. DNA를 소화하여 순환화를 위한 템플릿을 준비합니다. 이렇게 하면 프라이머 시퀀스가 제거되고 템플릿의 5'와 3'끝에 끈적끈적한 끝이 생성됩니다. 결찰 반응을 통해 이러한 끝을 다시 부착합니다.
<ol><li>PCR 튜브에서 필요한 완충제의 5 μL, 힌드III 20U, 정제된 DNA45를 3.8단계에서 결합한다.</li>
	<li>이 혼합물을 파이펫과 부드럽게 균질화합니다.</li>
	<li>37°C에서 15분 동안 열 사이클러에 혼합물을 배양합니다.</li>
	<li>열은 80 °C에서 20 분 동안 배양하여 힌드III를 비활성화합니다.</li>
	<li>튜브의 바닥으로 응축을 구동하기 위해 제거하기 전에 10 °C로 반응을 냉각 할 수 있습니다.</li>
	<li>새로 소화된 DNA에 T4 리구아제 완충제 5μL과 T4 리개세 800 U를 추가합니다.<ol>
<li>원하는 경우 T7 리개세사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이 혼합물을 파이펫과 부드럽게 균질화합니다.</li>
	<li>순환화 반응을 수행하기 위해 25°C에서 1시간 동안 혼합물을 배양한다.</li>
	<li>공급업체의 지시에 따라 PCR 정리 키트를 사용하여 반응을 정화합니다. 3.8 단계에서 자세히 설명된 동일한 프로토콜을 사용합니다.</li>
	<li>분광계를 사용하여 DNA를 정량화합니다. 예상 값은 ~20 ng/μL입니다.</li>
	<li>-20°C에 보관하거나 다음 단계로 진행하십시오.</li>
</ol>5. 이더말 롤링 서클 증폭
참고: 롤링 서클 증폭(RCA)은 상용 키트 또는 개별적으로 구입한 구성 요소를 사용하여 수행할 수 있습니다. 제조업체의 프로토콜을 따라 성공적인 증폭을 보장합니다. 키트는 전형적으로 φ29 폴리머라제와 같은 시료 완충, 반응 버퍼 및 가닥 변위 폴리머라제를 함유하고 있다. 다중 반응 튜브는 세포 없는 발현을 위해 다량의 DNA를 생성하기 위해 결합될 수 있다(시작 물질의 20 pg로부터 4 μg). 다음 프로토콜은 효율적으로 작동합니다.
<ol><li>단일 튜브에서, 샘플 버퍼의 20 μL, 반응 버퍼의 20 μL, 효소의 0.8 μL, 및 4.9 단계에서 원형 발현 템플릿(CET)의 1 μL을 결합한다. 참고: 이것은 ~20 ng의 총 DNA 질량을 가질 것이지만, RCA는 picogram 양으로 작동할 수 있으므로 높은 처리량 스크리닝에서 물질에 대한 상당한 필요성이 있는 경우 CET 및 극단적 인 효소 증폭의 희석을 허용합니다.</li>
	<li>혼합물의 피펫과 알리쿼트 10 μL을 4개의 개별 튜브로 균질화한다.</li>
	<li>4-18 h에 대한 30 °C에서 배양.</li>
	<li>열은 10 분 동안 65 °C에서 배양하여 효소를 비활성화합니다. 튜브 의 바닥에 응축을 장려하기 위해 5 분 동안 온도를 12 °C로 줄입니다. 참고: 열 사이클러의 자동화된 프로토콜의 모든 온도 단계를 결합하는 것이 가장 쉽습니다.</li>
	<li>각 튜브에 ddH2O의 15 μL을 추가하여 결과 용액을 희석시 희석시.</li>
	<li>모든 튜브를 결합하고 세포없는 반응에 직접 추가하십시오.</li>
	<li>원하는 경우 PCR 정리 키트를 사용하여 제품을 정화하고 ddH2O의 36 μL로 정량화하십시오. 템플릿 농도가 ~100 ng/μL인지 확인합니다.</li>
</ol>6. 세포 없는 반응
참고: 에너지 버퍼, 추출 및 RCA 템플릿을 결합하여 셀 프리 식을 수행합니다. PANOx-SP 에너지 버퍼를 이용한 전형적인 세포 없는 반응은 각각 1.2mM ATP, 0.85mMMM로 구성되어 있으며, GMP, UMP, 및 CMP, 30 mM 인포에놀피루바테, 130mM 칼륨 글루타민트, 10mM 암모늄 글루타메이트, 12m 마그네슘 글루타민, 1.5 mM 스미디딘, 1mM 퍼프레슈민, 34 μg/mL 의 폴리닉 산, 171 μg/mL 2mMM 각각 20개의 라벨이 없는 아미노산, 0.33m NAD, 0.27 mM 코엔자임 A(CoA), 4m 화소칼륨, 57m HEPES-KOH 버퍼(pH 7.5), 대장균 추출물의 0.24% 부피, 및 가변량 DNA23,49. 반응의 부피는 다를 수 있지만 15 μL 반응은 시약 사용에 저장할 수 있으며 384 개의 검은 벽 마이크로 플레이트49,50에사용하기에 충분히 작습니다.
<ol><li>sfGFP와 같은 형광 단백질을 표현하는 경우, 플레이트 판독기를 준비하여 원하는 흥분/방출, 온도 및 동요에서 읽을 수 있습니다.</li>
	<li>384웰 플레이트를 사용하는 경우, 습도를 유지하고 가장자리 효과를 줄이기 위해 빈 샘플에 잘 접한 우물에 H2O의 알리쿼트 60 μL을 제공합니다.</li>
	<li>각 샘플에 대해 다양한 필수 구성 요소를 튜브에 추가합니다. 삼중을 수행 하기에 충분히 추가 합니다. 플레이트 내에서 복제하면 가변성의 원인을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.<ol>
<li>추출물, 에너지 버퍼 및 DNA를 추가합니다.</li>
		<li>ddH2O로 최종 원하는 볼륨에 희석합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>솔루션 볼륨의 절반을 10-20배 위아래로 파이프팅하여 이 솔루션을 완전히 혼합합니다.</li>
	<li>15 μL 알리쿼트에서 반응 혼합물을 마이크로티터 플레이트의 원하는 우물로 옮기.</li>
	<li>습도를 유지하고 증발을 방지하기 위해 무색 밀봉 필름으로 접시를 밀봉하십시오.</li>
	<li>밀봉된 플레이트를 플레이트 판독기에 놓고 반응을 완료할 수 있습니다.<ol>
<li>라이브 모니터링 능력이 없는 단백질을 발현하는 경우, 열막과 같은 다른 온도 조절 장치를 사용하여 플레이트를 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 수틸리신 분석
참고: 보충 서열 #2에서서브틸리신 BPN(SBT(n)) 유전자를 발현하는 경우 이 프로토콜을 따라 활성을 분석합니다.
<ol><li>디메틸포르마미드(DMF)에서 N-수치닐-알라-알라-프로-페-니트로아닐드의 10μM 스톡 솔루션을 준비한다.</li>
	<li>플레이트 판독기를 설정하여 25°C의 온도를 유지하면서 20초마다 410nm에서 흡광도를 측정합니다.</li>
	<li>평평한 바닥, 무색 96 웰 플레이트, ddH2O의 알리쿼트 94 μL 및 N-수치닐-알라-알라-프로-페-프로-니트로아닐드의 7.1 단계.</li>
	<li>6.7 단계에서 완성된 세포 없는 반응의 5μL을 추가하고 7.2 단계에서 설명된 프로토콜로 설정된 플레이트 판독기를 사용하여 읽는다.</li>
</ol>

Nigel Reuel은 항체 설계를 위해 세포없는 시스템을 사용하는 회사인 BigHat Biosciences Inc.의 과학 자문 위원회에서 근무하고 있습니다.

관심의 유전자는 원하는 단백질이 될 수 있지만, 이 방법의 새로운 채택자를위한 웰 플레이트 판독기에서 실시간 또는 엔드 포인트 판독을위한 편리한 리포터로서 형광 단백질로 시작하는 것이 가장 좋습니다. 새로운 단백질 서열의 경우 원하는 단백질의 아미노산 서열을 복사하여 원하는 코돈 최적화도구(61,62)에붙여 넣습니다. 코돈 최적화 도구에는 일반적으로 많은 사용 가능한 유기체와 대장균균균이 있지만 일반 대장균 옵션을 선택하는 것이 적합합니다. 최적화 후, 이전에 선택된 절단 부위및 프라이머 서열이 존재하지 않도록 유전자를 다시 확인한다. 그렇다면 시퀀스가 더 이상 존재하지 않을 때까지 시퀀스를 최적화할 수 있습니다. 경우에 따라 반복 최적화가 지속적으로 내부 HindIII 절단 사이트를 초래하는 경우 HindIII 절단 사이트를 다른 제한 사이트로 교체해야 할 수 있습니다. 공정을 표준화하고 여...

세포 없는 유전자 발현(CFE)은 많은 응용분야와 함께 강력한 도구로 부상하고 있다. 이러한 응용 분야에는질병 검출1, 2,3,4,5,6,미량 영양소 및 소분자 검출7,8,9,10,11,12,바이오 제조13,14,15,16,17 ,18,교육19,20,21,제조 어려운 단백질17,22,23,24,25,26,27,및 변종 스크리닝23,28,29,30, 31,32 ,33. 이는 셀 프리 시스템의 개방적 특성과 그들이 부여하는 유연성 때문입니다. 많은 훌륭한 리뷰 기사는 기술34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44에대한 역사적 교육과 미래의관점을제공합니다.
전형적인 세포 없는 반응은 세포 추출물, 에너지 혼합 및 유전 템플릿의 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 활성 세포 추출물은 전사 및 번역(TXTL)에 필요한 모든 기계를 포함하고 있으며36의다양한 방법으로 처리될 수 있다. 에너지 믹스의 글리코리틱 중급자, 전해질, 아미노산 및 보조인은 TXTL 공정을 지원합니다. 그것은 세포 없는 실험에 있는 가변성의 주요 근원이고45 및 여러 가지 방법으로 제조될 수 있다34,46. 전통적인 복제 방법은 우수한 발현 특성을 가진 플라스미드를 초래하기 때문에 유전 템플릿의 준비는 적은 개선을 보았다. 이러한 전통적인 방법의 단점은 이를 구성하고 전파하는 데 필요한 처리 시간과 생물학적 전문 지식의 양입니다. 최근 최적화 노력으로 인해 에너지 믹스준비49,50과병행하여 수행할 수 있는 세포 추출물준비(47,48)를 위한 간단한 24시간 워크플로우가 발생했습니다. 그러나, 기존의 복제는 CFE 프로토타이핑 타임라인(표1)23에여러 일을 추가한다. 상용 유전자 단편으로부터 PCR 제품을 빠르게 증폭시키는 것은 직접사용할수 있지만, 이는 약 5개의 반응(전통적인 15μL 부피)에 해당하는 DNA의 1μg만 생성되기 때문에 프로토타이핑 실험의 수를 제한한다. 이러한 순환화 및 이더스말 증폭의 추가 단계로, DNA의 밀리그램 수량보다 큰 (~5,000 반응 1 mg). 이것은 극적으로 단백질의 높은 처리량 검열 또는 조합 효소 네트워크 (세포 없는 신진 대사 공학)에서 만들어질 수 있는 시험의 수를 증가시킵니다; 또한 선형 템플릿 라이브러리를 고농도 DNA로 효과적으로 보존할 수 있습니다. 또한 재료 과학 응용 분야(단백질 기반 섬유 및 하이드로겔)에 필요한 대량의 단백질을 시제품화하기 위해 더 많은 양의 템플릿이 필요합니다. 선형 템플릿의 일부 제한은 BL21 DE3 Star에서 추출한 추출을 사용하거나 최근에 발견된 방법을 사용하여 선형 템플릿을 분해52,53,54로부터보호함으로써 극복할 수 있다. 그러나, 이것은 PCR 증폭을 위한 공급 업체 생산 DNA의 제한된 주식을 가진 또는 복제에 필요한 생물학 전문 지식 및 장비의 문제를 다루지 않습니다.
이 작품은 소량의 벤더 생산 유전자 단편(일반적으로 lyophilized 분말의 500-1000 ng ng)에서 얻을 수 있는 발현 템플릿의 양을 증가시키기 위해 명시적으로 설계된 프로토콜을 제시한다. 설명된 방법은 플라스미드에서 전통적인 복제를 수행하거나 살아있는 세포에서 변환 및 전파하는 데 필요한 기술을 필요로하지 않습니다. 메일에서 유전자 단편을 받으면, 사용자는 이더스럽 롤링 원 증폭(RCA)(도 1)23을사용하여 많은 세포 없는 반응에 대한 충분한 템플릿을 생성할 수 있다. 공급 업체로부터 받은 DNA의 양은 제한된 선별 노력에 충분할 수 있지만, 신속하게 고갈되고 유전자 조각을 다시 구입하는 것은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 듭니다. 이 방법은 또한 대장균에서 독성이 있고 복제하기 어려운 유전자에 특히 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>Alaline</td><td>Formedium</td><td>DOC0102</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 글루타메이트</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP21805951</td><td></td></tr><tr><td>아르기닌</td><td>Formedium</td><td>DOC0106</td><td></td></tr><tr><td>아스파라긴</td><td>Formedium</td><td>DOC0114</td><td></td></tr><tr><td>아스파르트산</td><td>Formedium</td><td>DOC0118</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>시그마</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 밀봉 필름</td><td>Corning</td><td>PCR-SP</td><td></td></tr><tr><td>CMP</td><td>Sigma</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>코엔자임 A</td><td>Sigma</td><td>C3144</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>HindIII</td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Formedium</td><td>DOC0122</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean 및 Concentrator Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>DNA 정제에 사용</td></tr><tr><td>dNTP NEB</td><td></td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>대장균 tRNA</td><td>시그마 (Roche)</td> <td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>폴린산</td><td>시그마</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>유전자 단편</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글루탐산</td><td>Formedium</td><td>DOC0134</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Formedium</td><td>DOC0130</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Formedium</td><td></td><td></td>DOC0138</tr><tr><td>GMP</td><td>시그마</td><td>G8377</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td></td></tr><tr><td>히스티딘</td><td>Formedium</td><td>DOC0142</td><td></td></tr><tr><td>이소류신</td><td>Formedium</td><td>DOC0150</td><td></td></tr><tr><td>류신</td><td>Formedium</td><td>DOC0154</td><td></td></tr><tr><td>라이신</td><td>Formedium</td><td>DOC0158</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 글루타메이트</td><td>Sigma</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>메티오닌</td><td>Formedium</td><td>DOC0166</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter 플레이트(384웰)</td><td>Greiner</td><td>781906</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter 플레이트(96웰)</td><td>Greiner</td><td>655809</td><td></td></tr><tr><td>멀티모드 플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td>Synergy Neo2</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td>N8535</td><td></td></tr><tr><td>나노 광도계</td><td>Implen</td><td>NP80</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq DNA 중합 효소</td><td>NEB</td><td>M0480</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>페닐알라닌</td><td>Formedium</td><td>DOC0170</td><td></td></tr><tr><td>포스포에놀피루베이</td><td>트 시그마(Roche)</td><td>10108294</td><td></td></tr><tr><td>글루타민산 칼</td>륨 <td>시그마</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>옥살산 칼</td><td>륨 피셔 사이언티픽</td><td>P273</td><td></td></tr><tr><td>프롤린</td><td>포미디엄</td><td>DOC0174</td><td></td></tr><tr><td>푸트레신</td><td>시그마</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>세린</td><td>포미디엄</td><td>DOC0178</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td>시그마</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 반응 버퍼</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>TempliPhi 증폭 키트</td>와 함께 제공 <td>Cytiva</td><td>25640010</td><td>RCA</td></tr><tr><td>Thermal Cycler에</td> 사용 <td>Biorad</td><td>C1000 터치</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer FP</td><td></td></tr><tr><td>트레오닌</td><td>Formedium</td><td>DOC0182</td><td></td></tr><tr><td>트립토판</td><td>Formedium</td>에 사용<td></td><td></td>DOC0186</tr><tr><td>티로신</td><td>포미디엄</td><td>DOC0190</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>시그마</td><td>U6375</td><td></td></tr><tr><td>발린</td><td>포미디엄</td><td>DOC0194</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 없는 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

이 프로토콜은 최소한의 DNA 템플릿의 설계와 효소 증폭을 위한 단계를 설명하며, 세포 없는 발현을 사용하여 24시간 이내에 분석 가능한 단백질의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 합니다. 공급 업체로부터 DNA를 받은 후 유전자 단편은 PCR 증폭, 절단, 원형 및 저온 뱅크입니다. 소량의 뱅크된 DNA는 이더스롤링 원 증폭(RCA)을사용하여 현저하게 희석되고 증폭됩니다(최대 106x). RCA는 시작 물질의 피코그램 수준에서 최소한의 발현 템플릿의 마이크로그램 양을 얻을 수 있습니다 (모든 시작 합성 단편이 사용되는 경우 mg 수준). 이 작품에서 시작량은 20pg로 최종 제품의 4μg을 초래했습니다. 생성된 RCA 제품(최소 템플릿의 컨카퍼)은 정화 단계가 없는 세포 없는 반응에 직접 추가할 수 있다. 이 방법은 전적으로 PCR 기반이기 때문에 자동화된 액체 처리 시스템과 결합될 때 미래의 고처리량 선별 작업을 가능하게 할 수 있습니다.

RCA 템플릿으로부터 sfGFP의 발현은 15 μL반응(도 2A)에서무정제 RCA DNA의 0.30 μL만을 사용할 때 pJL1 플라스미드의 것과 비교할 수 있었다. 사실, 템플릿의 양을 두 배로 늘리고 세 배로 늘리면 BL21 DE3 Star 추출물에 아무런 이점이 없는 것으로 보이며, 이는 반응당 0.30 μL로 템플릿의 이미 포화 수준을 시사합니다. 반대로, SHuffle 균주로부터 공급되는 세포 추출물에 첨가할 때 RCA 템플릿의 양을 증가시켜 주는 이점이 있는 것으로보인다(도 2B)28. 일부 단백질의 경우 결과를 매우 빠르게 관찰할 수 있으며 전체 워크플로우(증폭 및 속담)를 24시간 미만으로 압축합니다. 그러나, 몇몇 단백질은 더 낮은 온도를 요구하거나 더 느린 접이식 시간이 있습니다, 결과가 얻어질 때까지 시간을 증가하되 여기에 제시된 워크플로우에 영향을 미칠 것입니...

연구 결과는 복제하거나 살아있는 세포를 사용하지 않고 합성 유전자 단편에서 단백질 검열 캠페인을 위한 DNA의 큰 (μg-mg) 양을 만들기 위한 프로토콜을 기술합니다. 최소 템플릿은 효소적으로 소화되고 원형화된 다음, 이더스말 롤링 서클 증폭을 사용하여 증폭됩니다. 세포 없는 발현 반응은 불정제 된 제품으로 수행 될 수있다.

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...

이 프로토콜은 합성 시설에서 받은 작은 유전자 단편으로부터 세포 없는 반응에 사용하기 위해 대량의 DNA 템플릿을 신속하게 생성하는 방법을 자세히 설명하기 때문에 중요합니다. 롤링 서클 증폭은 전통적인 복제보다 많은 양의 DNA를 빠르게 생성할 수 있습니다. 따라서 합성 DNA 라이브러리에서 더 높은 처리량 설계 빌드 테스트 학습 주기를 지원합니다.이러한 기술은 필요한 많은 단계와 적은 볼륨으로 인해 새 사용자에게 큰 고유의 가변성을 가질 수 있습니다. 주의 깊게주의를 기울여야하며 연습은 완벽합니다. 시작하려면 단일 PCR 튜브에 PCR 키트의 모든 구성 요소를 추가합니다.그런 다음 다시 중단된 유전자 단편의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 5~10초 동안 중간 설정에서 소용돌이를 통해 혼합물을 부드럽게 균질화합니다. 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 써모사이클러를 프로그래밍한 후 PCR을 실행합니다.PCR이 완료되면 PCR 정리 키트를 사용하여 반응 혼합물에서 DNA를 정화합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 DNA 결합 버퍼와 PCR 샘플을 5 대 1 비율로 추가합니다. 이 혼합물을 스핀 컬럼과 원심분리기로 1분 동안 16, 000회 G로 옮긴다.흐름을 폐기합니다. DNA 세척 버퍼 200마이크로리터를 컬럼에 넣고 실온에서 1분간 배양합니다. 열을 다시 원심분리하고 흐름 통과를 삭제합니다.입증 된 바와 같이 DNA 세척 버퍼로 컬럼을 다시 한 번 씻으시다. 두 번째 세척에서 흐름 스루를 제거한 후 열을 원심분리하여 남은 버퍼를 1~2분 간 추가로 제거합니다. DNA를 엘로우기 위하여는, 새로운 1.5 밀리리터 관으로 컬럼을 전송합니다.그런 다음 46 마이크로리터의 이중 증류수를 열에 넣습니다. 1 분 잠복 후 원심 분리에 의해 튜브로 DNA를 수집합니다. 및 분광계를 사용하여 정제된 DNA를 정량화한다.DNA를 소화하고 순환하기 위해 필요한 반응 완충제 5개 소리터, HindIII 제한 효소 20단위, 정제된 DNA 45마이크로리터를 PCR 튜브에 결합한다. 파이펫을 사용하여 이 혼합물을 부드럽게 균질화합니다. 그런 다음 온도 37도에서 15 분 동안 열순환기에서 배양하십시오.인큐베이션이 완료되면, 열은 섭씨 80도에서 20분 동안 배양하여 힌드III 효소를 비활성화합니다. 그런 다음 새로 소화된 DNA에 T4 Ligase 버퍼 5개와 T4 리구아제 800유닛을 추가합니다. 파이펫과 부드럽게 혼합한 후, 혼합물을

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Wiegand, DJ, et al. 빠르게 성장하는 박테리아 Vibrio natriegens를 이용한 무세포 단백질 발현. J. Vis. Exp. (2019).이 비디오는 Vibrio natriegens 조 용해물을 기반으로 하는 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템을 사용하여 결합된 시험관 내 전사 및 번역을 수행하는 방법을 보여줍니다. 필수 성분이 포함된 마스터 믹스의 준비와 DNA 주형에서 기능성 단백질의 단계별 합성을 강조합니다.

박테리아 조세포 추출물을 사용한 무세포 단백질 발현

다운스트림 분석을 포함하여 비표준 아미노산 유사체를 단백질에 잔류물 특이적으로 통합하기 위한 사용하기 쉬운 무세포 발현 프로토콜이 의료, 제약, 구조 및 기능 연구를 위해 제시됩니다.

를 사용하여 모델 단백질로 비정규 아미노산의 잔류 특정 법인 설립<em&gt; 대장균</em&gt; 휴대없는 전사 번역 시스템

이 프로토콜 세부 단계, 비용, 그리고 대장균을 생성 하는 데 필요한 장비-셀 추출 물 및 단백질 합성 반응을 시험관에서 4 일 안에 구현. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한이 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 우리는 적응 되 고 최적화 될 수 있는 반응 조건 논의.

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

셀-무료 식 시스템은 높은 처리량 합성과 중요 한 단백질의 심사에 대 한 강력 하 고 비용 효율적인 도구입니다. 여기, 우리는 플라스 미드 DNA, 선형 DNA, mRNA 서식 파일을 사용 하 여 급속 한 단백질 생산에 대 한 비 브리 오 natriegens 를 사용 하 여 셀 무료 단백질 식 시스템의 준비를 설명 합니다.

셀 무료 단백질 식을 사용 하 여 빠르게 성장 박테리아 비 브리 오 natriegens

새로운 서열 특이성을 가진 제한 endonucleases는 부분적으로 퇴화한 서열을 인식하는 효소로부터 개발될 수 있다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 NlaIV 효소의 순서 특이성을 바꾸기 위하여 이용된 상세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 주요 성분은 전사/번역 반응의 생체외 구획화 및 새로운 서열 특이성을 가진 변이체의 선택이다.

더 엄격한 특이성을 가진 제한 endonuclease의 시험관 진화

표준 실험실 장비를 사용하여 재조합 PURE 세포 없는 TX-TL 시스템을 생산하는 빠르고 비용 효율적인 방법을 제시합니다.

원팟 퓨어 셀 프리 시스템

이 프로토콜은 세포 없는 유전자 발현을 위한 세균성 용해를 생성하는 신속하고 간단한 방법을 설명하며, 대장균의 엔지니어링 된 균주를 사용하고 표준 실험실 장비만 필요합니다.

세균 세포 없는 Lysate의 신속하고 저렴하며 단순한 생산

잘 특성화 된 유전 부분은 새로운 유전 회로의 설계에 필요합니다. 여기에서는 유전 부분을 신속하게 특성화하기 위한 비용 효율적이고 처리량이 높은 방법을 설명합니다. 당사의 방법은 무세포 용해물, 복제를 방지하기 위한 선형 DNA, 처리량을 늘리고 반응량을 줄이기 위한 음향 액체 처리를 결합하여 비용과 시간을 줄입니다.

무세포 시스템을 사용한 유전 부분의 신속한 특성 분석

이 연구는 에스케리치아 콜라이 (E. coli )에서 세포 추출물을 제조한 후 24 시간 이내에 무세포 단백질 합성 (CFPS) 반응을 설명합니다. 무세포 자동 유도 (CFAI) 프로토콜에 대한 설명은 연구자의 감독을 줄이고 얻은 세포 추출물의 양을 늘리기 위해 개선 된 내용을 자세히 설명합니다.

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

여기에 제시된 것은 대장 균 BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD 및 ΔrecB)의 엑소 뉴 클레아 제 V 녹아웃 균주로부터 세포 추출물의 제조 및 완충액 교정을위한 프로토콜입니다. 이것은 선형 DNA 주형을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에서 발현을 위한 빠르고 쉽고 직접적인 접근 방식입니다.

선형 DNA 주형을 활용한 엑소뉴클레아제 결핍 세포 추출물의 무세포 단백질 합성

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

학습하세요 롤링 서클 증폭을 활용한 세포 없는 단백질 합성을 위한 신속한 DNA 템플릿 생성 방법입니다. 이 기술은 합성 유전자 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다.

세포 없는 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법

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