Name: 메탄겐성 순수 문화 및 환경 샘플에서 폴리글루타메이트 꼬리 길이 분석을 위한 보조 자F420 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: 배우세요 메탄겐 순수 배양 및 환경 샘플에서 F420 보조 인자 추출 및 꼬리 길이 분석 방법을. 액체 크로마토그래피 기술로 원핵생물 대사 작용 연구에 필수적인 분자를 정량 분석합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 감사하게 정제 된 공동 요소 F420와 지원에 대한 교수 콜린 잭슨 감사합니다. 이 연구는 티롤리안 과학 기금 (TWF)과 유니버시테트 인스 브루크 (Publikationsfonds)에 의해 지원되었다. 우리는 GPS, 홍콩, SB, GG 및 HB의 지원을 크게 인정합니다.

참고: 보조 자인 F420 의 추출 및 분석은 형광 검출을 통한 이온 페어링 RP-HPLC(IP-RP-HPLC)를 통한 샘플 리시스, 고체 상 추출(SPE)을 통한 공동 재정화, 공동 요인 검출을 포함하는 3단계 공정이다. 시작하기 전에 표 1에 명시된 바와 같이 재료와 시약을 준비합니다.
1. 샘플 리시스
<ol><li>적절한 튜브(예: 50mL 원문 튜브)에 최대 5g의 샘플을 추가합니다.</li>
	<li>샘플에 용해 버퍼(2배 재고 용액, 표 1)의 5mL를 추가합니다.</li>
	<li>증류수로 10mL의 최종 부피를 가져와 최종 농도0.5g·mL-1에 도달하십시오.</li>
	<li>20 초 동안 희석 된 샘플을 소용돌이.</li>
	<li>121 °C에서 30 분 동안 오토 클레이브.</li>
	<li>삼림 토양과 같은 건조 한 샘플의 경우, 희석 된 샘플을 autoclaving 후 증류수와 20 mL의 최종 부피를 가져. 주의: 오토클레이브 중 온도 상승으로 인해 튜브가 파열될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 고체위상 추출(SPE)을 통한 공동요소 F 420 의 사전 정제
참고: SPE의 모든 단계는 실온에서 수행됩니다.
<ol><li>샘플을 실온으로 식힙니다.</li>
	<li>11,000 x g에서 5 분 동안 자동 식 시료를 원심 분리 합니다.</li>
	<li>약한 음이온 혼합 모드 폴리머릭 소벤트 100 mg으로 채워진 5mL SPE 컬럼을 준비합니다.</li>
	<li>메탄올3mL로 이온 교환기(조건 용액, 표 1)를 조건부로 조건부.</li>
	<li>증류수 3mL(평형 용액, 표 1)으로 음이온 교환기를 평형화합니다.</li>
	<li>원심분리된 리세이트에서 SPE 열에 최대 9.0mL의 화물을 로드합니다.</li>
	<li>25m 암모늄 아세테이트(SPE 워시 용액 1, 표 1)의 5mL로 불순물을 씻어내다.</li>
	<li>메탄올 5mL(SPE 워시 용액 2, 표 1)로 불순물을 씻어내라.</li>
	<li>1.0mL의 용출 버퍼(표 1)에서 공동 요소 F420을 엘테. 참고: 신선한 용출 버퍼를 준비합니다. 용출 버퍼의 적용 된 진공 및 높은 증기 압력으로 인해 용출 볼륨은 샘플마다 다를 수 있습니다. 모든 샘플에서 동일한 최종 부피를 확보하기 위해 용출 전후의 수집 용기의 무게를 측정하고 효과적인 용출 량을 계산하는 것이 좋습니다. 용출 버퍼를 추가하여 차이를 균형 조정합니다.</li>
</ol>3. 보조 자F420의 검출
<ol><li>오븐을 40°C로 설정하고 형광 검출기를 420nm 소멸 파장 및 470 nm 방출 파장에 설정합니다. 이동단계 A와 B(표 1)를 사용하여 그라데이션 모드를 통한 분리 달성: 0-3분: 26% B; 3-24 분: 26%-50% B; 24-25 분 : 50 % B; 25-27 분 : 50 %-26 % B; 27-35 분 : 0.75 mL의 유량으로 26 % B, 분 -1. 참고: 적어도 3개의 열 볼륨으로 컬럼을 플러시하여 컬럼을 주입하기 전에 컬럼 조건의 평형을 보장합니다.<ol>
<li>0.22 μm의 모공 크기가 있는 PTFE 필터를 사용하여 SPE에서 HPLC 바이알로 용출된 샘플을 필터링합니다. 참고: 0.22 μm크기의 PTFE 필터를 권장합니다.</li>
		<li>EPLC 시스템에 용출된 시료의 50 μL을 주입하여 보조 자인 F420 조성 및 농도를 분석합니다. 참고: 이 프로토콜에 정량적 표준이 사용되지 않는 경우 샘플과 변형을 피크 영역별로 비교해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451(2019).</li>
<li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+F420%3A+an+expanded+view+of+its+distribution%2C+biosynthesis%2C+and+roles+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li>
<li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li>
<li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li>
<li>Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li>
<li>Lin, X. -L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li>
<li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis%3A+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li>
<li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea%2C+in+particular+the+genus+Methanosarcina%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li>
<li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li>
<li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species%2C+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li>
<li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li>
<li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li>
<li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+production%2C+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li>
<li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F%28420%29+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), Cambridge, England. 11208-11211 (2018).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).</li>
<li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li>
<li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li>
<li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed%5BTitle%5D)+AND+%22BioFactors%22%5BJournal%5D)">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), Oxford, England. 139-145 (1994).</li>
<li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coenzyme+F%28420%29+in+Mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li>
<li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic%2Fanoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).</li>
<li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li>
<li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+acetate%3A+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%2C+preservation%2C+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li>
<li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803(2010).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

메탄원성 순수 배양으로부터의 공동인자 F420의 평가를 위해, 관련 미생물의 성장 및 활성(형광 현미경 검사법)을 시각화하기 위해 현미경 평가를 수행할 수 있다(도 1). 자연 환경에서 파생되는 시료의 경우, F420을 감지하거나 정량화하기 위해 현미경을 사용하는 것은 다른 형광 미생물, 유기 및 무기 입자와의 간섭으로 인해 제한됩니다. 이러한 맥락에서, 이전에 설명된 바와 같이 HPLC를 이용한 F420 및 후속 형광 분석의 추출은 보조인 F420의 전반적인 농도뿐만 아니라 다과상 꼬리 길이 분포에 대한 정보를 제공할 수 있다.
보조자 F420의 추출을 위해, 압력 온도 처리는 매우 효과적인 것으로 나타났다 (도 2) 이전 연구 결과...

F420은 광범위하지만 종종 무시된 공동 인자이며, 이는 Archaea와 Bacteria1,2의 1 차 및 이차 대사 과정에서 의무적인 두 전자 수화물 운반체역할을 합니다. F420은 5-deazaflavin이며 구조적으로 플라빈스와 유사하며, 이에 따라 화학 적 및 생물학적 특성은 NAD + 또는 NADP +와 더 비슷합니다. 이소알록사진 링의 위치 5에서 탄소를 가진 질소의 대체로 인해, 강력한 환원제이므로 -340 mV1,3의 낮은 표준 레독스 전위를 나타낸다. F420은 5-deazaflavin 링과 2-인산 L-락테이트 링커(F420-0)로 구성됩니다. n+1 글루타민산단모머를 함유한 올리고글루타메이트 꼬리를 분자(F420-n+1)4에 부착할 수 있다.
오랜 시간 동안, 공동 요소 F420은 전적으로 고고학과 액티노박테리아와 관련이 있다. 이것은 대체로 전복되었습니다. 최근 분석에 따르면 F420은 필라 프로테오박테리아, 클로로플렉시 및 잠재적으로 토양, 호수 및 인간 용기1,5와 같은 수많은 서식지에 거주하는 다양한 혐기성 및 호기성 유기체 사이에 분포되어 있음을 밝혔다. 2019년, Braga et al.6은, 프로테오박테리움 파라부르피테리아 리조시니카가 2인성 꼬리 대신 3인산화를 함유한 독특한 F420 유도체를 생산하는 것으로 나타났으며, 이는 다양한 서식지에서 널리 퍼질 수 있다. 도메인 Archaea 내에서, F420은 메탄오제닉7, 메탄트로피치8,9, 황산염 감소 주문10을 포함한 여러 혈통에서 발견되었으며, 타우마르마치오타11에서 생산될 예정이다. F420은 수중 영양및 메틸로트로피아제 메탄발생에 필수적인 레독스 코엔자로 가장 잘 알려져 있습니다. 감소된 형태의 F420(F420H2)은 메틸레네트라하이드로메타노페린(메틸렌-H4MPT, 메르) 및 메테닐-H4MPT12,13의 감소를 위한 전자 기증자로서 기능한다. 또한 세포크롬12,14를 함유하는 메탄오겐의 H2 독립적인 전자 수송 경로에서 전자 운반체로 사용할 수 있다. 더욱이, F420의 산화형태는 420nm에서 특이성 청록색 형광을 가지며, 이는 메탄오겐의 검출을 용이하게 한다(도 1). 그것의 낮은 redox 잠재력으로 인해, F420 용이하게 (i) 그렇지 않으면 반발성 또는 독성 유기 화합물의 넓은 스펙트럼의 외인성 감소, (ii) 연쇄상 구균체(phylum Actinobacteria)에서 테트라사이클린 및 린코사미드 항생제 또는 식물독신의 합성( phylum Actinobacteria), 및 (iii) 내균균의 산화 또는 질산염 스트레스 또는 기타 불리한 조건(phylum Actinobacteria)에 대한 저항성(phylum Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. 따라서 F420의존성 옥시도레덕타스는 산업 및 제약 목적뿐만 아니라 오염된 환경의 생물 학적 개선을 위한 유망한 바이오 촉매입니다1,23. 이러한 최근 연구 결과에도 불구 하 고, 보조 자 F420의 정확한 역할은 여전히 약간 Actinobacteria 또는 다른 세균성 phyla에서 알려져 있다.
F420 생합성2,6,24에 대한 적어도 3개의 경로가 있습니다. 처음에 생합성 경로는 5-deazaflavin 생합성 및 2-인포라산 대사 분기로 나뉩니다. F420 분자의 반응성 부분은 기질 티로신과 5-아미노-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H)-피리미디네디온을 사용하여 FO-synthase를 통해 합성된다. 그 결과 리보플라빈 레벨 크로모포어 FO가 생성됩니다. 현재 허용되는 젖산 대사 분기 내에서 L-젖산은 L-젖산 키나아제(CofB)에 의해 2-인산-L-젖산으로 인산됩니다. 2-인-L-락테이트는 L-l-l-락틸-2-디포스포-5'-구아노신을 2-인산L-락테이트 구닐트랜스퍼라제(CofC)로 구아케한다. 다음 단계에서 L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine은 F420-02를 형성하기 위해 2-인산 L-락테이트 트랜스퍼라아제(CofD)에 의해 FO에 연결됩니다. 마지막으로, 효소 F420-0:ɣ-글루타밀 리구아제(CofE)는 조미료 단량체를 F420-0으로 리펜싱하여 다양한 숫자23,25에서 최종 공동 요소6을 형성합니다. 다른 유기체는 부착 된 글루타민산 염 잔류물의 수에 다른 패턴을 보여, 더 짧은 꼬리는 진균균에서보다 메탄오겐에 대한 발견2,25,26. 일반적으로, 메탄오겐은 2에서 3까지 꼬리 길이를 보여주고, 아세포 세포 메타노겐에서 최대 5개까지, 메타노사르키나 스프., 마이코박테리움 스프에서 발견되는 꼬리 길이는 5~7개의 글루타메이트 잔류물2,25,26,27사이입니다. 그러나, 최근 연구 결과는 긴 사슬 F420이 짧은 사슬 F420보다는 더 높은 친화력을 가진 F420 의존성 oxidoreductases에 결합한다는 것을 보여주었습니다; 더욱이, 바운드 롱체인 F420은 기판 선호도를 증가시킵니다만, 각 효소의 회전율은 감소한다23.
보조 자인 F420의 검출은 종종 형광에 기초한다. 따라서 올리고 글루타민트 파생은 반전 단계(RP)-HPLC27,28을 사용하여 분리되었다. 최근에는 테트라부틸람모늄 수산화를 음전하 글루타민산꼬리에 대한 이온 페어링 시약으로 사용하여 RP-HLPC에 대한 분리를 성공적으로 향상시켰습니다5. 여기서, 우리는 순수한 배양뿐만 아니라 다른 환경 샘플(즉, 토양 및 소화기 슬러지)에서 시료, 후속 용해, 추출, 정제, 분리 및 정량화를 위한 방법을 제시한다.

<table><tbody>오토<tr><td>클레이브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>생체 적합성 HPLC 시스템, 그래디언트 모듈, 오븐 및 형광 검출기가 장착된</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>HPLC 시스템</td></tr><tr><td>50mL용 원심분리기 및 로터 " 매" 튜브 (11.000 rcf) 및 적절한 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC 컬럼 : 쌍둥이 자리 NX C18, 5 &mu; m, 150 x 3 mm</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>HPLC 란</td></tr><tr><td>PTFE 여과기 (숨구멍 크기 0.22 &micro; m) 사전 HPLC 분석</td><td></td><td></td><td></td>미립자 물질 제거</tr><tr><td>SPE용 수지: Strata-X-AW 33 &mu; m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td></tr><tr><td>SPE 및 적절한 수집 튜브</td><td></td><td></td>용 진공 매니폴드 <td>SPE 장비</td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

메탄겐성 순수 문화 및 환경 샘플에서 폴리글루타메이트 꼬리 길이 분석을 위한 보조 자f420 추출

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

공동 인자 F420 많은 세균 및 고고학 택시의 기본 및 이차 대사에 수화물 캐리어로 중심 역할을한다. 공동 요소는 열역학적으로 어려운 반응을 용이하게 하는 메탄발생에 있는 그것의 역할로 가장 잘 알려져 있습니다. 폴리글루타메이트 꼬리는 서로 다른 유기체 들 사이의 길이가 다르기 때문에 길이 프로파일 분석은 다양한 서식지에서 다른 그룹과 경로를 구별하고 특성화하는 강력한 도구가 될 수 있습니다. 여기서, 프로토콜은 문화적 또는 분자 생물학적 접근법에 관계없이 고성능 액체 크로마토그래피 분석과 결합된 고체 상 추출을 적용하여 공동 인자 F420 검출의 추출 및 최적화를 설명한다. 이 방법은 토양, 혐기성 슬러지 및 순수 배양에서 미생물 공동체로부터 공동 인자 F420 의 발현에 대한 추가 정보를 얻기 위해 적용되었으며, 스파이크 실험에 의해 평가되었다. 이에 의해, 연구는 혐기성 소화기 슬러지 및 토양과 같은 환경 샘플뿐만 아니라 제어 메탄오제 순수 배양에서 수소 로피와 아세포 세포 세포 메탄원에 대한 다른 F420 꼬리 길이 프로파일을 생성하는 데 성공했다.

메탄노사피나 열애와 메탄오쿨레우스 열애의 순수한 배양, 열성성 메탄생성성 고고학모두 이전에 설명된 바와 같이 적합한 배지에서 재배되었다29,30. 메탄노사피나 열애의 경우 메탄올이 에너지원으로 사용되었지만, 메탄모쿨레우스 열애는 H2/CO2에서 재배되었다. 성장은 현미경 평가에 의해 검사되었으며, 활동은 이전에 설명된 바와 같이 가스 크로마토그래피에 의한 메탄(CH4)의 측정을 통해 조사되었다31. 순수한 배양은 제시된 프로토콜에 따라 보조 인자 F420의 추출에 사용되었다. 또한, 중구 바이오가스 원자로 슬러지(폐수 처리장, 지얼, 오스트리아)의 샘플을 포함한 환경 샘플을 포함한 환경 샘플은 슬러지 파라미터에 대한 자세한 내...

순수한 배양으로부터 보조인 F420 을 추출하는 방법은 순수한 배양 및 환경 샘플에서 F420 꼬리 길이의 액체 크로마토그래피 분리 및 분석에 최적화되었다.

메탄겐성 순수 문화 및 환경 샘플에서 폴리글루타메이트 꼬리 길이 분석을 위한 보조 자F420 추출

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

보조자 F420 많은 prokaryotes의 기본 및 이차 대사에 중요 한 역할을 한다. 환경 샘플에서 이 분자를 측정하면 보급과 기능을 더 깊이 이해할 수 있습니다. 이 기술은 슬러지 및 토양과 같은 어려운 샘플 재료에서 보조 인자의 분석을 가능하게합니다.따라서 분석 전에 재료의 용해 및 사전 정제는 중심 단계입니다. 프로토콜에는 샘플 준비 중에 다른 단계가 포함됩니다. 이러한 단계는 샘플 처리로 시작하기 전에 매우 잘 계획되고 준비되어야 합니다.예를 들어, 신선한 버퍼의 준비가 중요합니다. 샘플 용해를 시작하려면 50 밀리리터 원내 튜브에 5 그램의 샘플을 배치하십시오. 그런 다음 샘플에 2X 리시스 버퍼 5밀리리터를 추가하고 증류수로 10밀리리터에 부피를 가져와 밀리리터당 0.5그램의 최종 농도에 도달합니다.희석된 시료를 20초 동안 소용돌이치며 섭씨 121도에서 30분 동안 오토클레이브를 사용합니다. 삼림 토양과 같은 건조 한 샘플의 경우, 오토클레이브 후 증류수와 20 밀리리터의 최종 볼륨에 가져와, 입증 된 대로 20 초 동안 다시 희석 된 샘플을 소용돌이. 샘플이 식으면 샘플을 11, 000 x g에서 5 분 동안 lysate하고 상체를 수집합니다.5 밀리리터 고형물 추출 또는 100 밀리그램의 약한 음이온 혼합 모드 폴리머 셔벤트로 채워진 SPE 컬럼을 메탄올 3밀리리터로 음이온 교환기를 조절합니다. 그런 다음, 증류수 3밀리리터로 음상 교환기를 평형화합니다. 원심 분리된 lysate에서 최대 9밀리리터의 상체를 SPE 열에 로드합니다.25 밀리머 암모니아 아세테이트의 5 밀리리터와 메탄올의 5 밀리리터로 컬럼에서 불순물을 순차적으로 세척합니다. 세척 후, 응력 자 F420을 용출 버퍼 1 밀리리터로 엘테. 오븐을 섭씨 40도로 미리 설정하고 형광 검출기를 420나노미터 소멸 파장 및 470나노미터 방출 파장을 설정합니다.다음으로, 0.22 미크론의 모공 크기를 가진 PTFE 필터를 사용하여 SPE에서 HPLC 바이알로 용출된 샘플을 필터링합니다. 여과된 샘플 50마이크로리터를 HPLC 시스템에 주입하고 원고에 설명된 바와 같이 이동 단계의 조합을 사용하여 그라데이션 모드를 통해 공동 요소 F420을 분리합니다. 보조 인자 F420 조성 및 농도를 분석합니다.메탄원의 순수한 배양의 성장은 현미경 검사법에 의해 확인되었다. 위상 대비 현미경 검사법에서는, 메타노겐의 응집체가 보입니다, 공동 요소 F420이 자외선으로 흥분할 때 푸른 빛을 방출합니다. 메탄오쿨뢰류 의 상량의 SPE 후 회수 된 공동 요소 F420의 피크 영역을 분석했다.오토클레이브 분해 전략은 가장 높은 피크 영역을 달성하여 압력 온도 처리를 사용하여 최대 추출 효율을 결정했습니다. 꼬리 길이 분포의 분석은 환경 샘플에서 순수 메탄생성 배양의 보조 자인 F420의 전반적인 농도와 F420 꼬리 길이의 분포의 차이를 드러냈다. 이 절차를 적용할 때 용출 버퍼의 총 볼륨을 완전히 수집하거나 정확한 흐름 관통 량을 기록하십시오.이 기술은 토양과 슬러지와 같은 더 복잡한 샘플에서 공동 요소 F420의 탐사를위한 길을 열어이 분자의 생태 적 영향에 대한 깊은 통찰력을 가능하게합니다.

extraction-cofactor-f420-for-analysis-polyglutamate-tail-length-from

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

곰팡이 종의 proteomic 분석을위한 단백질 추출 proteomic 실험 (MIAPE) 지침에 대한 최소한의 정보에 따라 달성하는 표준화의 높은 수준이 필요합니다. 우리는에서 독소 유도와 단백질 추출하는 동안 실험 바이어스를 최소화하는 절차를 포함하는 비디오 프로토콜을...

에서 독소 유도와 단백질 추출 Fusarium 종.</emProteomic 연구> 문화

캡처 화합물 사진 crosslinking 및 정화하여 다음 기능을 가역 작은 분자 - 단백질 상호 작용에 의한 프로테옴의 복잡도를 줄이기 위해 trifunctional 작은 분자 수 있습니다. 여기있는 캡처 컴파 운드를...

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

인지질의 지방산 토양 미생물 커뮤니티의 구조에 대한 정보를 제공한다. 우리는 단상 클로로포름 혼합물을 고체상 추출 칼럼을 사용하여 추출한 지질의 분류 및 모세관 가스 크로마토 그래피로 분석 지방산 메틸 에스테르를 생성하기 위해 메탄과 토양 시료로부터 추출하기위한 방법을 제시한다.

추출 및 토양의 미생물 인지질 지방산의 분석

이 논문은 많은 샘플을 가진 연구에서 토양 미생물 군집 구조를 결정하기 위해 총 지질과 지표 지질의 상대적 양을 특성화하는데 사용하기 위해 미생물의 세포막으로부터 지질 추출을위한 노력과 정확성을 균형있게 유지하면서 처리량을 증가시키는 방법을 기술한다.

많은 샘플을 이용한 실험에서 토양 미생물을 특성화하기위한 지질 추출 및 분석 방법

이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

프로토콜은 동시에 하나의 토양 샘플에서 대사 산물, 단백질과 지질을 추출, 감소 샘플 준비 시간 허용 및 한정 된 수량으로 샘플의 멀티-omic 질량 분석 분석을 활성화에 대 한 제공 됩니다.

멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

fumarylacetotatetate하이드라세아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현 및 정제는 예시(대장균, FPLC에서발현)로 기재된다. 정제된 단백질은 결정화 및 항체 생산에 사용되며 효소 공아에 사용됩니다. 선택된 광측정 분석제는 옥살로아세테이트 데카르박실라제 및 아실피루베테 하이드로라제로서 FAHD1의 다기능성을 표시하기 위해 제시된다.

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

본 프로토콜은 액체 크로마토 그래피-탠덤 질량 분석법을 사용하여 분석하기 전에 트리클로로 아세트산 (TCA) 단백질 침전 및 산 가수 분해 를 통해 생물학적 매트릭스에서 비 단백질 아미노산을 추출하는 것을 설명합니다.

액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석 분석을 위한 시아노박테리아에서 비단백질 아미노산 추출

이 프로토콜은 저투입 마우스 대변 샘플에서 단쇄 지방산을 유도 없이 분리하는 2상 산-용매 추출 방법을 설명합니다.

2상 산-용매 방법을 이용한 쥐 배설물에서 단쇄 지방산 추출

배우세요 메탄겐 순수 배양 및 환경 샘플에서 F420 보조 인자 추출 및 꼬리 길이 분석 방법을. 액체 크로마토그래피 기술로 원핵생물 대사 작용 연구에 필수적인 분자를 정량 분석합니다.

메탄겐성 순수 문화 및 환경 샘플에서 폴리글루타메이트 꼬리 길이 분석을 위한 보조 자_F420 추출

더 많은 동영상 탐색