Name: 만성 및 급성 생체 내 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전하 배열의 구성 및 구현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 배우세요 탄소 섬유 미세 전극 배열 제작 방법으로 생쥐와 페럿 뇌에서 만성 및 급성 생체 내 전기생리학 기록을 수행하는 기술입니다. 이 방법은 안정적이고 장기적인 신경 활동 기록을 가능하게 합니다.

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우리는 전극 설계 및 건설과 팀 가드너와 함께 지도에 대한 그렉 Guitchounts감사하고 싶습니다 우리에게 자신의 실험실과 시설을 열어. 우리는 바이오 인터페이스 및 기술 핵심 시설에서 PDS 사용에 대한 그의 도움 크리스토스 미하스와 닐 리터, 존 스파이레아스, 데이비드 랜데스만에게 16 채널 지그의 초기 버전을 설계하는 데 도움을 주셔서 감사합니다. 하버드 나노스케일 시스템 센터의 SEM 이미징에 대한 팀 카바나우의 도움을 주신 것에 감사드립니다.

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저자는 이해 관계의 재정적 충돌을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 급성 및 만성 사용에 대한 기능적 CFEA를 구성하는 데 필요한 각 단계를 설명합니다. 설명 된 과정은 연구원의 요구에 사용자 정의 할 수 있습니다, 그것은 개월 동안 단일 뉴런을 모니터링하기위한 접근하고 저렴한 옵션을 만들기. 이 프로토콜은 마취된 동물에서 이식 후 몇 분 이내에 강력한 단일 단위 활성을 모두 기록할 수 있는 타당성을 보여주고, 깨어 있는 4개월 동안 동물을 행동하며, 신경 반응의 단기 및 장기 변화를 연구할 수 있는 이러한 CFEA의 잠재력을 보여줍니다.
설명된 프로토콜의 단계는 시간이 지남에 따라 철저하게 테스트되고 개선되어 몇 달 동안 눈에 띄지 않는 단일 유닛을 조밀하고 안정적으로 기록하는 능력으로 낮은 한계 비용(<$100.00)으로 신속하게 완료할 수 있는 효율적인 절차를 산출했습니다. 시공 단계는 하루 이내에 완료 할 수 있으며 모든 주요 상용 어레이에 필적하는 전기 생리학적 신호를 생성합니다. CFEA는 또한 유사한 상용 어레이보다 훨씬 작은 발자국(16채널 섬유 번들 직경 ~26 μm)을 가지며, 생체 적합성은 장기사용(13)에적합합니다. 중요한 것은 비슷한 성능을 갖춘 기능 CFEA를 생성하기 위해 따라야 하는 몇 가지 중요한 단계와 지침이 있다는 것입니다.
탄소 섬유의 취약성으로 인해 최대한 주의를 기울여 처리해야합니다. 날카로운 집게 또는 다른 도구로 처리하면 섬유가 파손될 수 있습니다. 또한, 섬유가 날아가지 않도록 공기 움직임이 제한된 공간에서 CFEA를 구성하는 것이 중요합니다. 섬유의 뒤쪽 부분을 불태우면 라이터는 약 1s의 앞뒤로 움직여야 합니다. 절연의이 제거 다음 단계는 작업 채널전극을 구성하는 데 중요합니다. 화염 팁은 추가 접촉없이 지그로 공급해야합니다. 그런 다음, 치과 시멘트로 분지를 채울 때, 시멘트가 조심스럽게 적용되고 채널과 깔때기 분지를 완전히 채우고, 이를 채우지 않고 개구부를 닫는 것이 중요합니다. 치과 시멘트는 진행하기 전에 UV 빛으로 완전히 경화되어야합니다. 이 작업이 완료되면, 실버 페인트는 완전히 채워질 때까지 각 채널에 주입해야하지만 유출되지 않아야합니다. 이 단계는 프로세스에서 가장 가변적인 단계입니다. 오버 필링하면 채널 간에 상호 토크가 발생할 수 있으며 충전이 부족하면 연결 오류가 발생할 수 있습니다. 25G 바늘을 사용하여 은페인트를 주입할 수 없는 경우 용액이 너무 점성이 있고, 이 경우 소량의 페인트 희석제를 첨가하여 보다 유동적인 용액을 생성할 수 있다. 모든 채널이 채워지고 헤드 스테이지 커넥터가 삽입되면 치과 시멘트로 커넥터를 확보하기 전에 배열이 24 시간 동안 치료할 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 그렇게 하지 않으면 연결된 채널 수가 감소하는 것으로 나타났습니다. 충분한 양의 치과 시멘트를 적용하는 것도 중요하며 신호 획득 시스템과 상호 작용할 때 커넥터가 연결이 끊어지지 않도록 합니다. 분리될 경우 은페인트로 반복되는 채널 채우기로 다시 연결을 시도할 수 있지만 사용자는 CFEA의 임피던스 값을 테스트하여 연결된 채널 수를 평가해야 합니다. 치과 시멘트가 하룻밤 동안 치료하도록 허용하는 것은 잠재적 인 분리를 방지하는 역할을합니다.
전극의 임피던스를 측정하면 연결된 채널의 정확한 추정을 제공합니다. 이것은 PBS에서 지상 및 기준 전선 및 탄소 섬유 팁을 침수 한 후 수행 할 수 있습니다. 우리는 높은 임피던스 (>15 MΩ)가 개방형 연결되지 않은 채널을 나타내는 것을 관찰했습니다. 전류 및 전기 도금을 주입하기 전에 연결된 채널은 이 프로세스를 통해 크게 감소해야 하는 임피던스 값의 범위를 가질 수 있습니다. 16채널 전극당 커넥티드 채널(임피던스 < 4MΩ)의 평균 수는 12.96± 2.74(평균 ± SD; N = 48 전극). 다수의 전도 횟수를 테스트하였고, 30s는 기록 사이트 들 사이에서 우수한 신호 절연을 생산하였다(도5). PEDOT-pTS12,24,25, 26및 PEDOT-TFB21이 탄소 섬유 녹음 사이트를 준비하기위한 신뢰할 수있는 옵션을 제공한다는 것이 잘 확립되었지만, 만성 이식용 전극을 전자도금으로 검증되고 신뢰할 수있는 방법인 금으로 도금하는 것을발견했습니다(27,28) , 이식의 용이성을 증가하고 전극 팁이 함께 뭉쳐방지. 평균 0.2MΩ 미만의 최종 임피던스 값을 생성할 때 이 방법은 PEDOT-TFB21 및 PEDOT-pTS26을사용하여 달성된 값과 비교할 수 있음을 증명합니다.
마이크로 전극 어레이를 이식할 때 현미경으로 탄소 섬유 팁의 삽입을 시각적으로 따르는 것이 중요합니다. 성공적인 삽입은 섬유의 구부러지지 않고 명백해야 합니다. 섬유가 좌굴처럼 보이면 뇌에 성공적으로 들어갈 가능성은 거의 없습니다. 이 경우 두 번째 시도를 위해 프로브각도를 조정해야 합니다. 이 프로세스는 프로브 삽입이 성공할 때까지 계속될 수 있습니다. 전극이 원하는 깊이에 도달하면, 우리는 적어도 30 분 기다리는 것이 프로브가 최적의 신호 수집 (급성 기록)에 정착 할 수 있음을 발견했습니다.
CFEA는 작은 발자국과 생체 적합성 외에도 건설용성과 저렴한 비용으로 인해 상업용 어레이에 대한 강력하고 사용자 정의 가능한 대안을 제공합니다. 이 프로토콜에 자세히 설명된 CFEA에 대한 가장 큰 제한은 확장성입니다. 구조의 수동 특성으로 인해 수백 개의 녹음 사이트로 설계를 확장하는 것이 실용적이지 않을 수 있습니다. 또한 나노 기술을 이용한 미세 전기 전하 배열 제조의 발전은 여기에 설명된 방법보다 대규모 인구 기록을 가능하게 합니다. 그러나 이 프로토콜은 탄소 섬유 전극의 벤치탑 제작에 관심이 있는 실험실에 CFEA 접근성을 제공합니다. 우리는 120 일 만성 실험의 기간 동안 스파이크 진폭의 안정성 또는 감소 견고성의 손실을 관찰하지, 그 시간 규모에 우리의 관측의 전형적인 대표 단일 채널에 의해 표시(그림 6A-E). 또한, CFEA는 4개의 단일 단위가 마우스에 이식된 후 11개월 동안 식별가능한 상태로 남아 있기 때문에 지속적인 단일 단위 활성에 대한 용량을 보여준다(그림 6G,H). 또한 짧은 기간 동안 단일 뉴런연구를 위해 다른 많은 상용 전극에 비해 이점을 제공하는 안정적인 단일 단위기록(도 7)을얻을 수도 있다. 미래에는 직경이 최소한의 유연한 생체 적합성 프로브를 개발하면 복잡한 공정을 연구할 수 있습니다. 이러한 도구는 뇌-기계 인터페이스(BMI)의 응용 을 포함하여 신경 기술의 발전에 상당한 유용성을 제공 할 것이며, 이는 연속적이고 장기적인안정성(29)을필요로 한다.

전극 및 전극 배열은 뇌가 신경 수준에서 정보를 처리하는 방법을 이해하는 데 중요한 도구입니다. 전기 생리학적 기록은 2세기 이상 달성되었지만1년이상 달성되었지만, 개별 뉴런의 급증을 포착하는 데 필요한 공간 및 측두해상도에서 전체 신경 회로의 활성을 동시에 측정하는 것은 여전히 불가능합니다. 뇌전도2,양전자 방출 지형3,기능성 자기 공명 영상4와 같은 비침습적 방법은 뇌 의 전뇌 측정을 허용하지만, 신경 회로 의활성을해결하는 데 필요한 공간 및 측두적인 해상도를 달성할 수 없다2,5. 대조적으로, 전압에 민감한 염료 또는 유전자 인코딩된 칼슘 지표를 이용한 광학 이미징 과 같은 이미징 방법은 단일 단위 공간 해상도를 달성할 수 있지만, 낮은 시간적 해상도 및 가난한 선택성3,4,5,6과같은 문제를 제기한다. 전기 기록은 이러한 방법에 대한 강력한 대안입니다. 전극을 기록하면 비교할 수 없는 시간 적 해상도를 제공하며, 사용자는 뇌7의모든 영역에서 스파이크 타임 정밀도로 측정할 수 있습니다. 또한, 만성 이식된 다중 전극 어레이(MEA)는 수일에서 달8,9까지동물에서 극대형(수십~수백 개의 세포), 단일 세포 기록을 가능하게 한다. 그러나, 더 높은 밀도에서 기록하는 실리콘 프로브는 큰 발자국을 가지고 있고 매우 침습적이며, 만성 이식 배열은 종종 염증 반응, 조직 캡슐화 및 신경 사10,11,12,13을생성한다.
기존 전극의 한계는 안정적이고 고해상도의 장기 기록을 허용하는 최근의 혁신을 초래했습니다. 전형적인 전극은 텅스텐 또는 백금 이리듐과 같은 금속 도체로 구성되거나 실리콘 또는 폴리머 기반입니다. 금속 기반 마이크로와이어 어레이는 장기적이고 안정적인 레코딩을 유지할 수 있지만, 단일 와이어의 직경은 10-200 μm14에이르는 훨씬 더 큰 설치 공간을 갖는다. 대조적으로, 실리콘 기반 전극 어레이는 높은 공간 해상도로 기록을 산출하지만, 상대적으로 경직된 설계로 인해 일반적으로 수개월 동안 동일한 뉴런에서 신호및 기록을 유지할 수 없다15. 실리콘 기반 어레이의 최근 개발은 안정적으로 만성 기록을 수행 할 수있는 전극의 결과, 그러나 이러한 배열은 큰 동물의 깊은 뇌 영역에서 기록하는 데 사용할 수 없으며 선형 기록9을위한것입니다. 폴리머 어레이의 발전으로 단일 유닛의 유연성과 레코딩 안정성이 향상되고 가까운 장래에 고밀도 레코딩의 잠재력을 제공하지만 현재8,16,17에서제한된 가용성을 제공합니다. 탄소 섬유는 여기에 설명된 기성품 재료로 고밀도 레코딩을 허용합니다.
탄소 섬유 기록 마이크로 전극은 수십 년 동안 사용되어 왔으며, 단일 탄소 섬유로 구성된 최초의 탄소 섬유 전극이 유리 마이크로 파이프에 삽입되었습니다. 이러한 미세 전극은 단일 단위 세포 외 기록에 사용되었으며 신호 대 잡음 비율이 최고의 텅스텐 인 유리 마이크로 전극과 비교할 수 있었지만 유연성, 낮은 임피던스 값 및18,19을제조하는 단순성으로 인해 유리했습니다. 탄소 섬유 전극 어레이 를 개발하기 위한 노력은 최근 탄소 섬유의 바이오 센싱 기능으로 인해 가속화되었습니다. 생체 적합성 증가 및 뛰어난 전기 전도도 외에도 고온 저항, 낮은 상대밀도, 높은 인장 강도, 낮은 굴곡 강성, 높은 검출 감도 및 작은 단면 영역10,12를포함한 독특한 특성 세트를 특징으로 합니다. 이러한 모든 특성은 단일 뉴런의 만성, 안정적이고 고수량 기록을 용이하게 하는 탄소 섬유 미세 전기 전체 어레이 (CFEA)의 개발에 동기를 부여했습니다. 이러한 CFEA는 이제 수개월 동안 단일 뉴런을 보유할 수 있는 마이크로 전극 어레이를 산출하는손 20,21(그림 1)으로제작될 수 있다. 여기에 설명된 CFEA에 대한 접근 가능한 건설 과정은 두 종에서 개별 뉴런의 급성 및 만성 기록을 위한 두 가지 방법으로 적응되었습니다.

<table><tbody><tr><td># 10 메스 블레이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-840-15</td><td>건축 도구</td></tr><tr><td>16 채널 CFEA 지그</td><td>Realize Inc.</td><td></td><td>CFMA 구성 요소</td></tr><tr><td>16-채널 옴네틱스 커넥터</td><td>옴네틱스</td><td>A79014-001</td><td>CFMA 구성</td></tr><tr><td>요소 25G 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-840-84</td><td>건축 도구 - 끝이 뾰족한</td></tr><tr><td>30G 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-03</td><td>건축 도구</td></tr><tr><td>31G 스테인리스강 304 피하 원형 튜브</td><td>Small Parts Inc</td><td>B000FMYN38</td><td>가이드 튜브용</td></tr><tr><td>32 채널 CFEA 지그</td><td>실현 Inc.</td><td></td><td>CFMA 구성 요소</td></tr><tr><td>32채널 Omnetics 커넥터</td><td>Omnetics</td><td>A79022-001</td><td>CFMA 구성</td></tr><tr><td>요소 6 in 면 팁 애플리케이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-156</td><td>건축 도구</td></tr><tr><td></td><td>Acetone Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td>건축 도구</td></tr><tr><td>AutoCad 3D 프린팅 소프트웨어</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Computer-aided Design Tool/ 3D 모델링 소프트웨어</td></tr><tr><td>Autodesk Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Computer-aided design tool/ 3D 모델링 소프트웨어</td></tr><tr><td>BD 일회용 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-30</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>탄소 섬유</td><td>Good Fellow, USA</td><td>C 005725</td><td>7 &mu; m 에폭시 크기의</td></tr><tr><td>카세트 및 카세트 홀더</td><td></td><td></td><td>섬유 코팅용</td></tr><tr><td>투명 테이프</td><td>스카치</td><td></td><td>원료 섬유 코팅용</td></tr> 탈<tr><td>이온수</td><td></td><td></td><td>전기도금 구성 요소</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>스카치</td><td></td><td>원료 섬유 코팅용</td></tr><tr><td>유동성 치과 복합재</td><td>Pentron</td><td>Flow-It ALC</td><td>CFMA 구성 요소/UV 경화된 치과 시멘트</td></tr><tr><td>금 도금 용액</td><td>Sifco ASC</td><td>5355</td><td>10.0-20.0% 글리세롤, 1.0-5.0% 에틸렌디아민, 1.0-5.0% 아세트산 (에틸렌디니트릴로)테트라-, 디칼륨 염, 5.0-10.0% 부탄산, 메르캅토-모노골드(1+) 나트륨 염, 1.0&ndash; 5.0 % 메타 중아 황산칼륨, 55.0-82.0 %</td></tr><tr><td>물 보석 클램프</td><td>아마존</td><td>B00GRABH9K</td><td>건축 도구</td></tr><tr><td>JRClust</td><td></td><td></td><td>흰 족제비 스파이크 분류 소프트웨어</td></tr><tr><td>라이터</td><td>BIC</td><td>LCP62DC</td><td>건축 도구</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PS-7000C</td><td>가이드 튜브</td></tr><tr><td>용 마이크로 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-953-1B</td><td>건축 도구</td></tr><tr><td>MountainSort</td><td></td><td></td><td>마우스 스파이크 분류 소프트웨어</td></tr><tr><td>NanoZ 16 채널 어댑터</td><td>다중 채널 시스템</td><td>ADPT-nanoZ-NN-16</td><td>전기 도금 부품</td></tr><tr><td>NanoZ 32 채널 어댑터</td><td>백질</td><td>NZA-OMN-32 rev A</td><td>전기 도금 부품</td></tr><tr><td>NanoZ 다중 전극 임피던스 테스터</td><td>백질</td><td></td><td>전기 도금 부품</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Stockroom</td><td>13-374-10</td><td>접착 특성을 가진 반투명, 유연한 필름</td></tr><tr><td>Parylene 'C' Dimer</td><td>특수 코팅 시스템</td><td>980130-C-01LBE</td><td>원료 섬유 코팅용</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>25322-68-3</td><td>전기 도금 구성 요소</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td></td><td></td><td>전기 도금 구성 요소</td></tr><tr><td>폴리이 미드 튜빙</td><td>MicroLumen</td><td>BRAUNI001</td><td>가이드 튜브 용</td></tr><tr><td>로터리 도구</td><td>Dremel</td><td>300124</td><td>가이드 튜브 용</td></tr><tr><td>메스 핸들</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>건축 도구</td></tr><tr><td>실버 전도성 코팅</td><td>MG Chemicals</td><td>842AR Super Shield</td><td>CFMA 구성 요소</td></tr><tr><td>스테레오 현미경 범위 6.7 : 1</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Building 도구</td></tr><tr><td>, 스티커 메모</td>, <td>포스트잇</td><td></td>, <td>건축 도구</td></tr><tr><td>, 티슈 물티</td>슈, <td>Kimtech, 과학</td>, <td>34155,</td><td>건축 도구</td></tr><tr><td>, 텅스텐 와이어</td>, <td>A-M 시스템</td>, <td>797550</td>, <td>CFMA, 구성 요소</td></tr><tr><td>, UV 경화 지팡이</td>, <td>딱따구리</td><td></td>, <td>건축 도구</td></tr>, <tr><td>진공 증착 챔버</td>, <td>특수 코팅 시스템</td><td></td>, <td>Labcoter 2 (PDS, 2010)</td></tr></tbody></table>

만성 및 급성 생체 내 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전하 배열의 구성 및 구현

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

다중 채널 전극 배열은 작동 뇌에 대한 통찰력을 제공하고 단일 세포 및 회로 수준에서 신경 과정을 해명하는 역할을합니다. 이러한 도구의 개발은 복잡한 행동과 인식을 이해하고 임상 응용 프로그램을 발전시키는 데 매우 중요합니다. 그러나, 그것은 오래 된 기간 동안 지속 적으로 안정적으로 지속적으로 세포 인구에서 조밀 하 게 기록 하는 도전 남아. 테트로데 및 실리콘 어레이와 같은 많은 인기 있는 전극은 삽입 시 손상을 생성하고 신경 죽음과 관련된 만성 반응성 조직 반응을 유도하는 큰 교차 직경을 특징으로하며 안정적이고 지속적인 신경 활동의 기록을 방해합니다. 또한, 대부분의 와이어 번들은 작은 영역에 클러스터된 많은 수의 세포로부터 동시 레코딩을 배제하면서 채널 간의 광범위한 간격을 나타낸다. 이 프로토콜에 설명된 탄소 섬유 마이크로 전기 전지 배열은 이러한 문제에 대한 접근 가능한 솔루션을 제공합니다. 이 연구는 생체내 급성 및 만성 기록 모두에 사용할 수 있는 탄소 섬유 미세 전조 배열을 제작하는 상세한 방법을 제공한다. 이 전극의 물리적 특성은 높은 세포 밀도에서 안정적이고 지속적인 장기 기록에 이상적하므로 연구원은 수개월에 걸쳐 단일 단위에서 견고하고 모호한 기록을 만들 수 있습니다.

이 프로토콜이 완료되면 단일 단위 스파이크 활동의 안정적인 기록이 가능합니다. 이러한 마이크로 전극 어레이는 연구원의 요구에 따라 재료, 채널 수 및 헤드 스테이지 어댑터에서 사용자 정의할 수 있습니다. 금의 전도 섬유는 기록에 적합한 임피던드감소(도 4 및 도 5)를초래한다. 사용자가 만성적으로 기록하려는 경우 동물이 외과 수술에서 회복 된 후에 측정할 수 있습니다. 만성 시술은 적어도 120 일 동안 안정적인 단일 단위 녹음을 초래했습니다. 대표적인 레코딩은 도 6에나타내며, 자유로운 행동, 성인 남성 마우스의 레트로플피질에서 안정적인 64채널 전기생리활성을 보여준다. 급성 준비를 위한 경우 이식 직후(~30분)부터 녹음이 시작될 수 있습니다. 이것은 전극이 뇌에 정착하는 시간을 허용할 것입니다. 도 7은 성인 여성 페렛의 1차 시각 피질로부터 획득한 급성 16채널 CFEA 기록의 대표적인 예를 제공한다. 마우스와 페렛의 스파이크 정렬은 스파이크 정렬 소프트웨어(재료 표참조)로 수행되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig01.jpg"> 그림 1: 16- 및 32 채널 탄소 섬유 마이크로 전기 전지 배열 (CFEA)의 해부학. (A)32 채널 (상단) 및 16 채널 (하단) CFEA의 세 가지 보기에서. 16채널 CFEA는 취급을 위한 확장된 설계를 갖추고 있습니다. 32채널 디자인은 64채널 CFEA에 2개의 지그를 결합할 수 있는 플랫 페이스를 특징으로 합니다. 두 다이어그램 모두 차원으로 레이블이 지정된 구조를 식별합니다. 커넥터 끝은 커넥터 삽입위치를 나타내고 GND/REF 채널은 접지 와이어가 삽입되는 위치를 나타냅니다. 깔때기 분지는 섬유가 UV 광 경화 치과 시멘트로 오버레이되도록 통과하는 위치를 말하며 깔때기 팁은 섬유가 지그를 빠져 나가는 곳에서 사이트를 나타냅니다. 깔때기 팁은 함께 집착하고 손상을 만드는 섬유를 최소화하기 위해 사분면으로 나뉩니다. 섬유는 나중에 치과 시멘트를 사용하여 단일 번들로 당겨지며. 지그는 SLA 수지 프린터를 사용하여 3D 인쇄됩니다. 다이어그램은 세부 정보를 표시하도록 확대됩니다. (B)CFEA 를 건설. 다이어그램에는 레이블이 지정된 구조를 식별합니다. 파란색 번들 팁은 기록 측정을 획득하는 탄소 섬유의 세그먼트를 나타냅니다. 깔때기 분지 내와 커넥터 주변의 회색은 깔때기 분지에 탄소 섬유를 고정하고 지그에 커넥터를 고정하는 UV 빛 경화 치과 시멘트를 나타냅니다. 보라색 와이어는 접지 와이어를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig02.jpg"> 그림 2: 원탄소 섬유를 카세트에 적재하여 parylene C 코팅을 위해 적재합니다. (A)탄소 섬유는 양면 테이프(파란색)의 두 스트립으로 오버레이된 카트리지에 적재됩니다. 각 카세트에는 ~25개의 섬유가 장착되어 있습니다. (B)카세트는 파라렌 C 코팅을 준비하기 위해 레이저 컷 홀더(gray)에 적재된다. 각각 10개의 카세트를 보유하고 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig03.jpg"> 그림 3: 탄소 섬유 미세 전기 전체 배열 (CFEA) 번들 시공 회로도. (A)16 개인, 코팅 된 탄소 섬유 (블랙)는 32 채널 3D 인쇄 지그 (회색)를 통해 나사된다. (B)탄소 섬유 팁은 마이크로 가위로 절단되어 지그 베이스의 높이와 동일한 과잉 섬유를 남기고 지그 베이스에서 확장됩니다. (C)표준 플라스틱 스파크 휠 라이터는 파라렌 C 절연을 제거하기 위해 과잉 섬유를 통해 신속하게 전달된다. 오른쪽 상단 회로도는 12섬유 중 9개에서 파릴렌을 제거하는 것을 보여줍니다. (D)섬유단은 섬유 단이 베이스와 함께 플러시될 때까지 지그안으로 다시 삽입된다. 오른쪽 상단 의 회로도는 지그 베이스 내부에 보관 절연 (회색) 섬유 팁9 섬유의 재삽입을 보여줍니다. 그런 다음 지그가 뒤집힌 다음 A-D 단계는 반대 16개 채널을 스레드하기 위해 반복됩니다. (E)지그는 섬유를 확보하기 위해 치과 시멘트로 채워져 있습니다. 실버 프린트는 지그 베이스의 각 우물에 주입됩니다. (F)수컷 커넥터가 지그베이스에 삽입된다. (G)CFEA 및 메스는 -20°C 냉동고에서 동결된다. 어레이 팁은 원하는 길이로 절단되어 섬유32개도 남깁니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig04.jpg"> 그림 4: 팁 처리 및 전도. (A)전극 팁은 먼저 0.1 M PBS로 배치되며, 여기서 전류는 각 전극을 통과합니다. 팁은 헹구고 금 도금 용액으로 옮겨져 전류로 전기도금이 공급됩니다. (B)준비된 탄소 섬유의 SEM 이미지는 팁에 농축된 금 도금 용액을 보여준다. 스케일 바는 초기 절단후 168채널로부터 4μm.(C) 임피던스 값을 나타낸다(보라색; 3.11 MΩ ± 0.42 MΩ, 중앙값 ± SE, n = 168 섬유), 양수 전류 주입(핑크; 1.23 MΩ ± 0.36 MΩ, 중앙값 ± SE, n = 168섬유), 및 전기 도금(오렌지; 0.19 MΩ ± 0.15 MΩ, ± SE, n= 168단계) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig05.jpg"> 그림 5: 적당한 금 전기 도금 지속 시간은 탄소 섬유 번들 팁에 작고 둥근 예금을 생성합니다. 사진된 탄소 섬유 팁은 모두 다른 마이크로 전기 전하 어레이에서 나온 것으로, 임피던스 감소 또는 금 도금에 대해 주입된 전류의 다양한 지속 시간을 반영합니다. 이미지는 또한 탄소 섬유를 절연하고 섬유의 팁 이외의 위치에서 신호의 수집을 방지 parylene C 코팅을 묘사한다. (A)냉동 및 면도날로 단일 컷을 한 후 탄소 섬유 팁의 전자 현미경 이미지를 스캔합니다. 스케일 바는 10 μm.(B)A와 동일하지만 10 s.(C)B와 동일하지만 5 s .(D)금으로 전자 도금한 다음 B와 동일하지만 15 s(E)B와 동일하지만 30 s(F)에대한 금으로 전자 도금한 다음 12 0 0 0 으로 전자 판으로 전자 도금했습니다. 우리는 -0.05 μA의 전류에서 30 s에 대한 전기 도금이 전기 생리학적 기록에 최적이라는 것을 발견했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig06.jpg"> 그림 6: 탄소 섬유 미세 전기 전지 배열을 가진 마우스 레트로 플장피질 피질을 자유롭게 행동하는 만성 세포 외 기록은 지속적이고 안정적인 신경 활성을 보여줍니다. (A)일레븐 붕대 전압 흔적이 동시에 기록되었다. 첫 번째 채널(맨 위 행)에서 기록된 후속 추적은 시간 동안 내구성을 표시하기 위해 B로 플롯됩니다. 나머지 10개의 행은 기록 품질의 일관성을 보여 주며 배열 전체에서 강력한 활동을 보여 줍니다. 각 추적의 왼쪽으로 배율 막대는 200 μV 전위를 나타냅니다. (B)A의 상단 트레이서와 동일한 섬유로부터의 붕대 데이터를 120일 연속 기록전반에 걸쳐 견고한 활성을 나타내도록 확장하였다. (C)클러스터링은 수개월 동안 강력한 단일 장치 감지를 보여줍니다. 추적은 각 시점에서 B로 플롯된 섬유에서 추출된 120일 동안 지속적으로 관찰가능한 대표 단일 장치의 평균 파형을 나타냅니다. (D)C에서 비정규화 된 스파이크 파형이 쌓여 시간이 지남에 따라 일관성을 입증합니다. (E)탄소 섬유 레코딩은 수개월 동안 안정적인 소음 바닥을 보여줍니다. B의 노이즈 플로어(추적 +스파이크 활동)의 표준 편차는 소음의 점진적 인 변화를 나타내지 않습니다. 막대는 평균 오염을 나타냅니다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (F)만성 이식 된 CFEA 및 헤드 스테이지와 마우스의 스케일 드로잉. (G)생 전압 트레이스(상단)는 이식 후 11개월 동안 견고한 LFP를 나타낸다. 붕대 전압 추적(아래쪽)은 꾸준한 신경 활성을 나타낸다. (H)C로부터 섬유에 기록된 뉴런의 평균 스파이크 파형, 스파이크 활성의 첫 1,000부각에 의해 밑층된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig07.jpg"> 그림 7: 페렛 1차 시각 피질로부터의 탄소 섬유 미세전하 어레이(CFEA) 기록. (A)16채널 CFEA로부터 기록된 스파이크 정렬 단일 유닛의 파형. 단일 뉴런의 행동 잠재력은 종종 약간 다른 진폭에서 여러 채널에서 분명했다. (B)선택한 뉴런으로부터 의방향 튜닝 곡선. 색상은 A의기록된 단위에 해당합니다. 화살표는 자극 운동의 방향을 나타냅니다. 축척 막대는 응답률을 나타냅니다. 오류 막대는 표준 오류가 있는 평균 응답을 나타냅니다. 수평 파선은 빈 화면에 노출되는 동안 동일한 셀의 자발적인 발사 속도를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 여러 뇌 영역에서마우스(Mus musculus)및 페렛(무스텔라퍼토리우스 후로)의 만성 및 급성 생체 내 전기 생리학적 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전기 전극 어레이를 구성하는 절차를 설명합니다. 미전지어 어레이 이식에 대한 원시 탄소 섬유를 구입한 후 각 단계는 미세 전기 전하 배열 구조에 중점을 두고 자세히 설명됩니다.

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...

여기에 설명 된 벤치 최고 건설은 뉴런의 조밀 한 클러스터에서 기록을 허용하고 시간이 지남에 따라 그 뉴런의 많은 을 따라 몇 현재 사용할 수있는 전극 기술 중 하나입니다. 탄소 섬유 마이크로 전기 전하 배열은 구축하는 것이 저렴합니다. 그들은 작고 생체 적합성이 있으며 건강하고 안정적인 기록을 허용하는 뇌와 함께 움직입니다.탄소 섬유는 매우 얇고 처음에는 보기가 매우 어렵습니다. 그러나, 그들과 함께 작업의 몇 일 후, 그들은 조작하기 쉬워집니다. 우선, 카세트의 두 개의 긴 면에 양면 테이프 조각을 놓고 테이프의 가장자리를 카세트의 내부 가장자리와 정렬합니다.탄소 섬유 조작 도구를 준비하려면 30 게이지 바늘 주위에 작은 접착제 필름을 감싸 필름으로 날카롭지만 유연한 지점을 형성합니다. 다음으로, 개별 섬유를 구운 번들에서 분리하고 카세트의 짧은 면과 평행하게 배치하여 2~3밀리미터 거리를 유지합니다. 각 카세트에 20~30개의 섬유를 장착한 후, 이중 스틱 테이프 위에 투명 테이프를 놓고 섬유를 제자리에 밀봉하고 채워진 카세트를 카세트 홀더에 놓습니다.탄소 섬유 마이크로 전광배열을 조립하려면 지그의 커넥터 끝에 있는 적절한 채널을 통해 각 접지 와이어를 공급하기 시작하고 두 끝이 길이가 같을 때까지 계속한다. 그런 다음 함께 비틀어 지그 위에 고정하십시오. UV 경화 치과 시멘트를 적용하여 와이어를 고정하는 동시에 와이어가 공급되는 곳에서 열린 채널 내에서 치과 시멘트를 얻지 않도록 합니다.UV 경화 지팡이를 사용하여 치과 시멘트를 20초 동안 치료하고 커넥터 끝, 분지 및 깔때기 끝이 보이는 지그 및 부체를 정렬합니다. 다음으로, 깔때기가 사용자로부터 멀어지고 커넥터가 사용자를 향하게 되도록 지그를 방향을 지정합니다. 그런 다음 잠재적인 섬유 제거 부위에서 카세트에 대해 25 게이지 바늘 팁을 밀어 내고 카세트에서 단일 탄소 섬유를 잘라냅니다.카본 섬유 도구를 사용하여 섬유의 갓 자른 자유 끝을 잡고 바늘을 사용하여 카세트에서 섬유의 다른 쪽 끝을 잘라냅니다. 그런 다음 다시 탄소 섬유 도구를 사용하여 한쪽 끝이 공구에서 길이가 약 1센티미터되도록 탄소 섬유를 집어 들수 있습니다. 섬유 부착 탄소 섬유 도구를 사용하여 지그의 중간 분지에서 깔때기 조각을 통해 섬유의 짧은 끝을 공급합니다.섬유의 길이의 대부분이 통과 될 때까지 지그 깔때기를 통해 섬유를 공급 계속합니다. 탄소 섬유 도구를 사용하여 사용 가능한 채널을 통해 섬유의 후면 부분을 공급합니다. 약 5밀리미터의 섬유질이 튀어나오거나 필요한 경우 크기로 절단될 때까지 뒷면을 통해 계속 공급하십시오.커넥터 끝에서 절연을 제거하려면 표준 스파크 휠 라이터를 사용하여 노출된 섬유 위로 불꽃을 통과한 다음, 불꽃 섬유 부분이 이제 채널 내에 있도록 지그를 통해 화염 섬유를 공급하면서 섬유가 지그 뒤쪽에서 튀어나오지 않도록 합니다. UV 경화 치과 시멘트를 지그의 분지 섬유에 적용하여 전체 분지를 채우고 채널과 깔때기의 개구부를 덮습니다. 바이스에서 지그를 제거하고 깔때기가 아래로 가리키되도록 지그를 방향을 지정한 후 커넥터 끝으로 지그를 위로 가리킵니다.바늘을 은색 프린트로 채우고 치과 시멘트에 의해 멈출 때까지 바늘을 한 채널에 조심스럽게 삽입하십시오. 페인트로 채널을 채우기 위해, 천천히 채널에서 바늘을 제거하는 동안 주사기를 우울, 다음 페인트 얇은에 면 팁 어플리케이터를 찍어 어떤 페인트의 지그 표면의 베이스를 청소. 이제 핀을 채널과 정렬하여 헤드 스테이지 커넥터를 적절한 방향으로 삽입합니다.헤드 스테이지 커넥터가 똑바로 고정되어 가능한 한 지그로 플러시되면 헤드 스테이지 커넥터가 지그와 만나는 가장자리를 따라 치과 시멘트를 적용하여 헤드 스테이지 커넥터를 지그에 고정한 다음 UV를 20초 동안 치료합니다. 전극 끝을 원하는 길이로 자르기 위해 전극을 탈이온 또는 증류수의 비커로 낮추면 깔때기 끝이 완전히 침수되고 정상으로 유지됩니다. 이제 물에서 전극을 제거하여 개별 탄소 섬유를 함께 가져옵니다.섬유가 가이드 표면에 플러시를 놓고 롤링 모션으로 메스로 원하는 길이로 섬유를 절단하도록 전극을 놓고 적절한 어댑터를 사용하여 다중 전극 임피던스 테스터에 전극을 부착하고 임피던스를 테스트합니다. 이제 전극 끝을 0.1 어금니 PBS의 미세 원심 분리튜브로 약 2 밀리미터 낮추고 미세 원심 분리기 튜브에 접지 와이어를 삽입합니다. 전극 팁의 임피던스를 줄이려면 선택한 진폭과 지속 시간으로 양전류를 주입한 다음, 분해되거나 증류된 물에 섬유를 헹구어 세척합니다.다음으로, 금 도금 용액에서 전극 번들을 약 2밀리미터 로 낮추고 도금 혼합물의 마이크로센심분리기 튜브에 접지 와이어를 삽입한다. 그런 다음 전기 도금에 적합한 매개 변수를 설정합니다. 전기 도금 후 탈온 또는 증류수로 섬유를 철저히 헹구십시오.제조된 탄소 섬유의 대표적인 SEM 이미지는 끝에 농축된 금 도금 용액을 보였다. 금의 섬유 전기도금은 녹음에 적합한 임피던스를 감소시켰다. 초기 절단 후 300 채널의 임피던스 값, 양수 전류 주입 및 전기 도금은 각 처리 단계 후 임피던스 값이 감소하는 것으로 나타났다.적당한 금 전도 기간은 탄소 섬유 번들 팁에 작고 둥근 예금을 생산했다. 또한, 성인 남성 마우스를 자유롭게 행동하는 레트로플피질에서 안정적인 64채널 전기생리활성을 분석하였다. 그 결과 기록 품질, 견고한 단일 장치 감지, 비정규화 된 스파이크 파형및 안정적인 노이즈 플로어에서 보여 준 바와 같이 시간이 지남에 따라 일관성이 입증되었습니다.또한, 생 전압은 이식 후 11개월 추적되어 견고한 로컬 필드 전위를 보였다. 성인 여성 페렛의 1차 시각 피질로부터 획득한 급성 16채널 탄소섬유 미세전하 어레이 기록의 대표적인 예도 여기에 나와 있다. 탄소 섬유 미세 전기 전하 배열은 신경 회로를 이해하는 데 필수적인 오랜 기간 동안 뇌의 인근 뉴런의 단기 또는 만성 기록을 허용합니다.

construction-implementation-carbon-fiber-microelectrode-arrays-for

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜에서는 쥐에서 만성 electrophysiological 레코딩을위한 마이크로 드라이브 배열을 조작하는 방법을 보여줍니다.

만성에 대한 마이크로 드라이브 배열 생체내에 녹화 : 드라이브 제작

이 프로토콜에서는 쥐에서 만성 electrophysiological 레코딩을 위해 설계되었습니다 마이크로 드라이브 어레이와 함께 사용하기 위해 조작 및 조건 tetrodes하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 지상 설치 와이어 및 보호 원추형을 포함 마이크로 드라이브 배열 건설의 마지막 단계를 보여줍니다.

만성에 대한 마이크로 드라이브 배열 생체내에 녹화 : Tetrode 조립

이 비디오는 통합 마이크로 드라이브 어레이를 사용하여 쥐의 여러 뇌 영역에서 동시 전기 생리학적 기록을 보여줍니다. 기록 전극은 후각구에, 참조 전극은 전두엽 피질에, 마이크로 드라이브 어레이 전극은 해마에 배치됩니다. 쥐는 자유롭게 먹이를 찾을 수 있으며, 이식된 모든 전극의 동시 기록은 어레이를 사용하여 기록됩니다.

여러 뇌 영역의 전기생리학적 기록을 위한 마이크로 드라이브 어레이 방법

마우스의 뇌 신호의 생체 전기 생리학 기록에 대한 마이크로 드라이브의 설계와 어셈블리가 설명되어 있습니다. 튼튼한 driveable 캐리어 미세 번들을 부착하여,이 기술은 장기적이고 안정적​​인 신경 녹음을 허용합니다. 경량 디자인은 동물 다음과 같은 드라이브 주입에 의한 제한 행위 성능을 할 수 있습니다.

깨어있는 행동을 한 쥐의 만성 신경 녹음을위한 마이크로 드라이브 배열의 건설

우리는 포름알데히드 고정 인간의 시체 신경외과 인간의 뇌의 피 질에 microelectrode 배열에의 이식에 대 한 교육을 지원 하기 위해 사용 되는 절차를 설계.

외과 훈련 Neocortical Microelectrode 배열 포름알데히드 고정 인간 수 색 모델을 사용 하 여 이식에 대 한

이 연구는 두뇌, 심전도, 근, 로컬 필드 전위의 동시 녹음 하 고 자유롭게 움직이는 쥐의 신호를 호흡 하는 방법을 소개 합니다. 이 기법을 실험 비용 절감 및 데이터 분석을 단순화, 뇌 및 말 초 기관 간의 상호 작용의 이해에 기여할 것입니다.

대뇌 피 질의 로컬 필드 전위, 심전도, 치십시오, 그리고 자유롭게 움직이는 쥐에서 리듬 호흡의 동시 녹음

아래에 기재된 것은 자유롭게 움직이는 쥐에서 만성 전기생리학적 기록을 위해 해부학적으로 먼 뇌 영역에 걸쳐 다중 폴리머 전극 어레이를 이식하는 방법이다. 준비 및 외과 이식은 다른 종에서 사용하기 위해 이러한 방법의 적응을 안내하는 디자인 원칙에 중점을 두고 자세히 설명됩니다.

다중 유연한 폴리머 전극 어레이의 만성 이식

여기서 Ti3C2 MXene 마이크로 전극 어레이를 제조하고 생체 내 신경 기록용으로 활용하는 방법을 설명합니다.

생체 내 신경 녹음을 위한 Ti3C2 MXene 마이크로 전극 어레이 의 제조

여기서는 신경과 뇌 에서 생체 내에서 기록하기 위한 맞춤형 탄소 섬유 전극 어레이를 위한 제조 방법론을 설명합니다.

오픈 소스 툴킷: 신경 기록을 위한 벤치탑 탄소 섬유 마이크로전디 어레이

본 프로토콜은 다수의 뇌 구조로부터 생체 내 국소 장 전위를 동시에 기록하기 위해 맞춤 제작된 마이크로전극 어레이의 구축을 기술한다.

여러 뇌 구조에서 동시에 생체 내 녹음을위한 로컬 필드 잠재적 인 미세 전극 구축

여기에서는 설치류의 만성 전기 생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 프로브 임플란트 시스템을 소개하며, 사용 편의성, 프로브 회수율, 실험적 다양성 및 행동과의 호환성에 최적화되어 있습니다.

DREAM Implant: 머리가 고정되고 자유롭게 행동하는 마우스의 만성 전기생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 모듈식 임플란트 시스템

배우세요 탄소 섬유 미세 전극 배열 제작 방법으로 생쥐와 페럿 뇌에서 만성 및 급성 생체 내 전기생리학 기록을 수행하는 기술입니다. 이 방법은 안정적이고 장기적인 신경 활동 기록을 가능하게 합니다.

만성 및 급성 생체 내 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전하 배열의 구성 및 구현

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