작고 큰 눈의 망막 기능을 연구하기 위해 생체 외 망막 전도의 설정 및 조건 최적화
2022년 6월 27일
기존 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 장비를 수정하면 생체 외 망막전전도에 더 널리 접근할 수 있습니다. 생체 외 광 반응을 기록하고 유지하는 개선된 방법은 건강한 망막, 안과 질환의 동물 모델 및 인간 기증자 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 연구를 용이하게 합니다.
이 프로토콜은 생체 외 ERG, 특히 ON- 양극성 세포에 의해 생성 된 극도로 민감한 B 파에서 망막 기능을 유지하는 데 필요한 조건을 보여줍니다. ex vivo ERG를 사용하면 높은 신호 대 잡음비로 다양한 유형의 망막 뉴런의 기능을 측정할 수 있으며 약리학적 제제를 쉽게 도입할 수 있습니다. 이 방법은 특히 망막 기능 및 질환에 대한 약리학적 제제의 효능을 정량화하는 데 적합합니다.
시작하려면 헤드스테이지를 통해 ex vivo ERG 시편 홀더를 차동 증폭기에 연결하여 다중 전극 어레이 설정을 변환합니다. 증폭기는 다중 전극 어레이 시스템의 인터페이스 보드의 아날로그 입력에 연결해야 합니다. 다중 전극 어레이용 기록 소프트웨어를 사용하여 ex vivo ERG의 입력 데이터를 기록하고 저장합니다.
차동 증폭기의 게인을 100으로 설정하고 디지타이저 사양에 따라 10X 전압 증폭을 추가합니다. 저역 통과 필터를 100Hz로 설정합니다. 또는 패치 클램프 설정을 변환하려면 헤드스테이지를 통해 ex vivo ERG 시편 홀더를 패치 클램프 증폭기의 헤드스테이지에 연결해야 하는 차동 증폭기에 연결합니다.
패치 클램프 시스템 소프트웨어와 디지타이저를 사용하여 생체 외 ERG의 입력 데이터를 기록하고 저장합니다. 앞에서 설명한 대로 매개 변수를 설정합니다. 적절한 파장의 LED를 현미경에 연결합니다.
광 자극을 제어하려면 디지타이저의 아날로그 출력으로 제어되는 LED 드라이버를 사용하십시오. 빛 자극의 트리거링을 가능하게 하는 녹음 소프트웨어로 LED를 제어하십시오. 그런 다음 포토 다이오드를 사용하여 시편 홀더의 망막 위치에서 LED의 광 출력을 보정합니다.
필요한 경우 중성 밀도 필터를 삽입하여 광 경로의 광도를 어둡게 합니다. 전극을 준비하려면 염화은 펠릿 전극을 나사산 루어 커넥터에 삽입합니다. 루어 커넥터 내부를 뜨거운 접착제로 채우고 나사산이 없는 쪽에서 뜨거운 접착제에 2mm 소켓을 삽입합니다.
EP-1 전극의 은선을 2mm 소켓에 납땜합니다. 나사산에 O-링이 있는 완성된 전극을 생체 외 ERG 시편 홀더의 전극 포트에 나사로 고정합니다. 인간 기증자 눈을 포함한 큰 눈의 경우 나머지 결합 조직의 지구본을 청소하고 앞쪽 부분과 렌즈를 제거하십시오.
메스를 사용하여 윤부에서 약 3mm 정도 자릅니다. 구부러진 해부 가위를 절개 부위에 삽입하고 윤부를 따라 절단하여 렌즈로 눈의 앞쪽 부분을 제거합니다. 3-6mm 일회용 생검 펀치로 생체 외 전기 망막 조영술을 위한 망막 표본을 얻습니다.
표본 홀더에 조직을 장착하려면 표본 홀더의 아래쪽 절반을 큰 페트리 접시에 넣고 표본 홀더의 돔이 잠기도록 산소가 공급된 Ames'medium으로 채 웁니다. 미세한 집게로 망막의 가장자리를 조심스럽게 잡고 망막을 생체 외 시편 홀더의 돔으로 옮기고 광 수용체 쪽이 위를 향하게합니다. Ames의 용액에서 표본 홀더를 들어 올려 망막이 제자리에 유지되도록 주의하십시오.
소음, 전기 누화 및 신호 션트를 최소화하기 위해 시편 홀더의 플레이트를 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 시편 홀더의 양쪽 절반을 4 개의 나사로 조립하고 관류 라인을 연결하십시오. 시편 홀더의 하반부에서 전극을 구동하고 양극 케이블을 내부 망막 쪽에 연결하고 음극 케이블을 광 수용체 측에 연결합니다.
시편 홀더에 분당 최소 1 밀리리터의 산소가 함유 된 Ames'medium을 10-20 분 동안 관류하여 빛 반응이 안정화되도록합니다. 생체 외 ERG는 마우스 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 광 반응을 기록할 수 있었습니다. 인간 공여자 망막으로부터의 광 수용체 반응의 기록은 핵 제거의 사후 최대 5 시간 지연 및 ON- 양극성 세포 반응의 경우 20 분 미만의 지연으로 가능했다.
이상적인 조건에서, 두 세포 유형 모두에서 반응 진폭 및 동역학은 시간이 지남에 따라 비교적 안정적이었으나, 망막이 표본 홀더에 장착된 후 40 내지 45분 후에 느린 감소를 보였다. 표본 홀더의 온도가 감소하면 광 수용체와 ON- 양극성 세포의 동역학이 크게 느려졌습니다. 그러나 B 파의 진폭은 감소했지만 A 파는 감소하지 않았습니다.
반대로, 관류 속도를 늦추면 광 수용체와 ON- 양극성 세포 반응의 진폭이 감소했지만 A 또는 B 파의 암시 적 시간에는 영향을 미치지 않았습니다. 10 분 동안 관류를 중단 한 후 재관류는 보존 된 광 수용체 반응으로 ON- 양극성 세포 기능의 완전한 손실을 초래했습니다. 충분한 관류 속도와 생리학적 온도는 특히 생체 외 ERG의 ON-양극성 세포로부터 안정적인 반응을 얻는 데 중요합니다.
이 프로토콜을 통해 인간 황반과 말초의 광 수용체 기능의 차이를 심층적으로 탐구 할 수 있으며, 이전에는 인간이 아닌 영장류에서만 수행 할 수 있었던 질문에 답할 수 있습니다.
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개요
본 연구는 망막 뉴런 기능을 연구하기 위한 ex vivo 전기망막도(ERG) 기록 방법을 향상시키기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 다양한 설정을 사용하여 ON-양극성 세포와 광수용체 기능에 중점을 두고, 건강 및 질병 상태에서 망막에 대한 약리학적 효과에 대한 통찰력을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 전기생리학
- 신경과학
- 망막 생물학
배경
- ex vivo 환경에서 망막 기능을 효과적으로 기록하는 도전
- 망막 건강 및 질병에서 ON-양극성 세포와 광수용체의 중요성
- 약리학적 개입을 정량화하는 신뢰할 수 있는 방법의 필요성
- 기존 기술은 종종 접근성과 정밀성이 부족합니다.
연구 목적
- 수정된 장비를 사용하여 망막 광 반응 기록을 개선합니다.
- 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능성 분석을 용이하게 합니다.
- 망막 세포의 약리학적 반응을 평가합니다.
사용된 방법
- 프로토콜은 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 시스템을 사용하여 ex vivo ERG를 적용합니다.
- 마우스 망막과 인간 기증자 망막을 생물학적 모델로 활용합니다.
- 각 설정에는 정확한 기록을 보장하기 위한 증폭 및 필터링을 위한 중요 매개변수가 포함됩니다.
- 실험 중 온도 및 관수율 유지의 중요성이 강조됩니다.
- 광 출력의 광다이오드를 사용한 보정은 제어된 자극에 중요합니다.
주요 결과
- 개선된 방법을 통해 광수용체와 ON-양극성 세포 모두에서 안정적인 기록이 가능합니다.
- 반응은 일관성을 유지하며, 장기간 장착 후 약간의 감소가 관찰됩니다.
- 온도와 관수율은 반응의 진폭, 특히 B 파에 중요한 영향을 미칩니다.
- 결과는 인간 망막 영역 간 광수용체 기능의 차이를 명확히 합니다.
결론
- 본 연구는 망막 뉴런 기능을 탐구하는 신뢰할 수 있는 방법을 입증합니다.
- 개선된 접근성을 통해 망막 건강과 관련된 고급 약리학적 연구가 가능합니다.
- 결과는 뉴런 메커니즘 및 망막 질환에 대한 잠재적 개입에 대한 이해를 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Optimizing ex vivo ERG conditions enables stable, high-fidelity recording of retinal neuronal responses, particularly from ON-bipolar cells and photoreceptors, supporting mechanistic de-risking in retinal target validation. The method allows quantitative assessment of pharmacological interventions in isolated tissue, reducing systemic variability and improving predictive confidence in preclinical models. This positions the technique as a translational bridge for evaluating retinal therapeutics across species, including human donor tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of retinal neuronal cell-type-specific contributions to light responses, supporting target hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates pharmacological agent introduction to quantify efficacy on retinal function, improving target de-risking.
- Predictive Value: Stabilized ON-bipolar cell B-wave recordings allow assessment of compound effects over time, supporting lead identification and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Optimized perfusion speed and physiological temperature maximize response amplitude and stability, enabling reliable compound screening.
- Quantitative Output: Provides high signal-to-noise measurements of photoreceptor and ON-bipolar cell responses, supporting dose-response and kinetic analyses.
- Scalability: Adaptable to retina samples from small and large eyes, including human donor tissue, supporting cross-species assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables comparison of photoreceptor function between human macular and peripheral retina, supporting biomarker alignment.
- Disease-Relevant System: Maintains retinal function ex vivo for up to five hours postmortem, allowing evaluation of pathological changes and therapeutic interventions.
- Mechanistic De-risking: Isolates tissue-intrinsic retinal responses, minimizing confounding systemic influences in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The optimized ex vivo ERG method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, supporting data-driven go/no-go decisions in retinal therapeutic development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of retinal neuronal mechanisms and pathway-specific contributions to visual function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative light response readouts enabling reliable compound evaluation in retinal assays.
- Analytics: Generates kinetic and amplitude data (A and B waves) that allow comparison of treatment effects across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects findings from model systems to human donor retina, supporting preclinical-to-clinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for retinal functional assessment across discovery and preclinical teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on retinal cell-type-specific responses, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardized perfusion and temperature controls improve reproducibility and reduce variability in retinal function measurements.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by improving predictive confidence in retinal target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by de-risking mechanistic uncertainty in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal tissue dissection, electrophysiology, and pharmacological agent handling.
- Dependent on specialized equipment including differential amplifiers, LED drivers, photodiodes, and perfusion systems.
- Necessitates standardized protocols for tissue mounting, perfusion speed (at least 1 mL/min), and physiological temperature maintenance.
- Adaptation across model systems requires optimization of biopsy punch size and dissection techniques for varying eye dimensions.
- Practical limitations include gradual decline in response stability after 40–45 minutes post-mounting, necessitating timely experimental execution.
