Name: 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 단일 입자 극저온 전자 현미경을 위한 수동 블롯 및 플런지 동결 기법. 생물학적 표본을 준비하는 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 익히고, 최적의 온도와 습도 조건에서 고품질 결과를 얻는 절차를 습득하세요.

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Herzik 랩 회원들에게 이 원고와 비디오 콘텐츠에 대해 비판적으로 생각하고 피드백을 제공해 주신 것에 감사드립니다. M.A.H.주니어는 NIH R35 GM138206과 시얼 학자의 지원을 받고 있습니다. H.P.M.N은 분자 생물물리학 훈련 보조금(NIH T32 GM008326)에 의해 지원됩니다. 또한 스크립스 연구소의 빌 앤더슨, 찰스 보우먼, 가브리엘 랜더 박사에게 비디오에 표시된 수동 플런저를 설계, 조립 및 테스트하는 데 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다.

우리는 공개 할 것이 없습니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)에 의한 이미징을 위한 생물학적 표본의 진동은 성공적인 구조 결정에 매우 중요한 단계로 남아 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 수동 블롯 앤 플런지 방법은 극저온 이미징을 위한 유리체 얼음 의 박막에서 생물학적 샘플을 신속하게 동결하는 비용 효율적이고 신뢰할 수 있으며 견고한 방법을 나타냅니다. 원고에 설명된 방법을 사용하여, 연구원은 수동 플런저를 조립및 작동시키고, 플래시 동결 생물학적 샘플에 적합한 극저온을 준비하고, 생물학적 표본을 포함하는 수동으로 얼룩 및 플런지 EM 그리드를 블롯 및 플런지 할 수 있습니다. 이 방법은 매우 견고하지만, 고해상도 이미징을 위한 최적의 얼음 두께와 품질을 얻기 위해 이 절차에서 중요한 단계에서 주의를 기울여야 합니다. 아래에서 이러한 몇 가지 중요한 단계를 설명하고 이러한 단계를 해결하는 방법에 대한 권장 사항을 제공합니다.
플런징 암은 플런지 후 황동 용기 내의 액체 에탄의 중앙에 그리드...

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)은 동적 생물학적 표본의 구조를 거의 원자 분해능1,2,3,4로 해결하는 데 사용할 수 있는 강력한 구조 기술입니다. 실제로, 최근 직전자 검출기 기술의 발전4,5,6,7,8,9,10, 전자 소스의 개선4,11,12,13,14, 전자기 렌즈 안정성15, 데이터 수집의 지속적인 개발과 함께 16,17 및 분석 소프트웨어 패키지18,19, 연구원은 지금 정기적으로 3 Å 해상도 또는 더 나은 에 잘 행동 표본의 구조를 결정할 수 있습니다4,11,13,14,20,21,22,23 . 이러한 향상된 이미징 및 데이터 처리 기능에도 불구하고 cryoEM 그리드 준비는 성공적인 고해상도 구조 측정을 위한 가장 큰 장애물로 남아 있으며 EM 워크플로224,25,26,27에서 상당한 병목 현상역할을 합니다.
CryoEM은 기본 생화학 상태를 보존하는 "유리와 같은" 얼음의 박막을 형성하기 위해 동결된 수성 용액에서 생물학적 시료의 이미징에 의존합니다. 극저온에 대한 생물학적 시료의 진동은 40년 이상 거슬러 올라가며, 이 공정을 위해 개발된 많은 기술과 장비는 원래 상세한 블롯 및 플런지 방법에 의존하여 31,32,33,34,35에 의존합니다. , 이에 의하면 소량의 샘플(예를 들어, 1-5 μL)이 전문화된 EM 그리드에 적용되어 초과 용액이 블로팅 페이퍼와 그리드의 물리적 상호 작용을 이용하여 제거된다. 이 과정의 타이밍은 일반적으로 각 시편에 대해 실증적으로 결정되며, 동결 시료의 중요한 성분은 유리체 얼음 필름의 두께입니다 - 얼음이 너무 두꺼워지면 너무 얇은 얼음이 너무 얇아단백질 배향을 제한하고/또는 그리드 호일 홀의 중심에서 입자를 배제할 수 있는 동안 이미징 품질이 급격히 저하됩니다36 . 단일 입자 극저온에 대한 완벽한 얼음 두께에 대한 이러한 의존은 로봇 공학 37,38, 미세 유체 42, 초음파 또는 살 포 장치 27,39,40,41,42,43,44 를 포함하여 샘플을 동결 할 수있는 다양한 기술과 장비를 주도하고있다 . 최근 몇 년 동안 가장 인기있는 샘플 준비 장치 중 일부는 블롯 및 플런지 기술을 사용하여 샘플의 자동 동결을 위한 로봇 공학의 사용에 의존합니다45. 이러한 장치는 이미징에 적합한 얼음 두께를 재현적으로 생성하도록 설계되었지만 개별 실험실에서 구매 및 작동하기에는 비용이 너무 많이 들며 일반적으로 사용량을 위해 시간당 가격으로 극저온EM 시설에서 발견됩니다. 최근 몇 년 동안, 원래 수동 블롯 및 플런지 기술은 증가 사용으로 돌아왔다3,47,48,49,50,51,52. 실제로 수동으로 작동하는 블롯 앤 플런지 장치는 로봇 대응 비용의 일부만으로 고품질 극저온엠 그리드를 달성할 수 있습니다. 또한 수동 블로팅은 연구원이 블로팅 유형(즉, 그리드의 백 블로팅, 그리드의 전면 블로팅 등)을 조정할 수 있으며 각 개별 샘플 및 연구 질문에 따라 시간을 낭비할 수 있기 때문에 더 많은 사용자가 블로팅에 대한 제어력을 제공합니다.
이 문서에서는 맞춤형 드워 플랫폼53과 결합된 기존의 수동 블롯 및 플런지 진동 장치를 사용하여 생물학적 샘플을 효과적으로 동결하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 극저온, 그리드 처리, 샘플 응용 프로그램 및 블로팅 을 포함한 모범 사례뿐만 아니라 이러한 장애물을 극복하는 방법에 대한 일반적인 함정 및 권장 사항이 제공됩니다. 그리드 제제 간의 얼음 두께 재현성을 높이는 방법과 생물학적 표본 유형에 따라 샘플 블로팅을 수정하는 방법에 대한 조언이 논의됩니다. 이 원고에 설명된 수동 플런저의 구매 및 작동과 관련된 저렴한 비용을 감안할 때, 전 세계 실험실은 비용 효율적이고 재현 가능한 방식으로 극저온에 대한 생물학적 표본을 준비할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>4 슬롯 그리드 스토리지 박스</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>14 게이지 플랫 메탈 디스펜싱 팁</td><td>아마존</td><td>B07M7YWWLT</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm 스퀘어 유리 커버 슬립</td><td>시그마</td><td>C9802-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>그리드 보관용 60mm 유리 페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>08-747A</td><td></td></tr><tr><td>100mm 유리 페트리 접시 Whatman 종이</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>150mm 유리 페트리 접시 저장 Whatman 종이</td><td>Fisher</td><td>08-747F</td><td></td></tr><tr><td>250mL 비커</td><td>Fisher</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>블루 스티로폼 듀어</td><td>스피어 랩</td><td>FD-500</td><td></td></tr><tr><td>황동 에탄 용기</td><td>Lasco</td><td>17-4075</td><td></td></tr><tr><td>클램핑 핀셋</td><td>Ted Pella</td><td>38825</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 작업 와이프</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>제어 밸브가 있는 2단 조절기</td><td>Airgas</td><td>Y12N245D580-AG</td><td></td></tr><tr><td>이슬 그리드 베이스</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄 플랫폼</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄 프로판 탱크</td><td>Praxair</td><td>ET PR50ZU-G</td><td>에탄(50%) : 고압 탱크의 프로판(50%)</td></tr><tr><td>에탄 탱크</td><td>Praxair</td><td>UN1035</td><td>에탄(100%)</td></tr><tr><td>유연한 암 작업 조명</td><td>Amscope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>그리드 (UltrAufoil R 1.2 / 1.3 300 mesh)</td> <td>전자 현미경 과학</td><td>Q325AR1.3</td><td></td></tr><tr><td>가습기</td><td>대상</td><td>719438</td><td></td></tr><tr><td>습도계</td><td>ThermoPro</td><td>B01H1R0K68</td><td></td></tr><tr><td>실험실 코트</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 듀어</td><td>워딩턴</td><td>LD4</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 장갑</td><td>Fisher</td><td>19-059-925</td><td></td></tr><tr><td>수동 플런저 스탠드(검은색 스탠드 + 풋 페달)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mark 5(플런징 플랫폼)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td>VWR</td><td>82026-424</td><td></td></tr><tr><td>P20 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-029</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>E0030124286</tr><tr><td>피펫 팁</td><td>이비스 사이언티픽</td><td>63300005</td><td></td></tr><tr><td>링 램프</td><td>아마존</td><td>B07HMR4H8G</td><td></td></tr><tr><td>안전 안경</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>아마존</td><td>Fiskars 01-004761J</td><td></td></tr><tr><td>스크류 드라이버</td><td>아이언사이드</td><td>354711</td><td></td></tr><tr><td>테이프</td><td>피셔</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>그리드 박스를 전송하는 핀셋</td><td>Amazon</td><td>LTS-3</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td><td>Fisher</td><td>14-171-130</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 블로팅 페이</td>퍼 <td>Fisher</td><td>1001-090</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)에 의한 고해상도 구조 측정을 위해 전자를 사용한 이미징 생물학적 표본은 관심있는 생체 분자를 포함하는 유리체 얼음의 얇은 층을 필요로한다. 구조 생물학의 최전선에 단일 입자 극저온을 추진 한 최근 몇 년 동안 수많은 기술 진보에도 불구하고, 표본이 고해상도 이미징을 위해 유리화되는 방법은 종종 속도 제한 단계로 남아 있습니다. 최근 수많은 노력이 새로운 샘플 지원 및 혁신적인 유리화 계측의 개발을 포함하여 표본 병보 시 자주 발생하는 장애물을 극복하는 수단을 제공했지만, 기존의 수동으로 작동하는 플런서는 구매 비용과 운영 편의성으로 인해 냉동 EM 커뮤니티의 필수품으로 남아 있습니다. 여기서, 우리는 단일 입자 극저온에 의한 고해상도 이미징을 위한 생물학적 표본의 진동을 위해 표준, 기로틴 스타일의 수동으로 작동하는 블롯 및 플런지 장치를 사용하기위한 상세한 방법을 제공합니다. 또한 표준 준비가 적합한 시편을 산출하지 못하는 경우 일반적으로 발생하는 문제와 문제 해결 권장 사항도 설명되어 있습니다.

여기에 설명된 블롯 및 플런지 프로토콜의 성공적인 실행은 전자 현미경하에서 관찰될 수 있는 어떤 육각형 얼음, 오염 물질 및 큰 그라데이션이 없는 얇고 균일한 유리체 얼음층을 초래할 것이다(그림 3). 그리드 표면과 블로팅 용지의 일관되지 않은 접촉, 블로팅 용지를 조기에 제거하거나 그리드 접촉 중에 블로팅 용지를 이동하면 유리체 얼음의 품질을 저하시키고 EM 그리드 전체의 일관되지 않은 얼음 두께로 이어질 수 있습니다(그림 4)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62765/62765fig01.jpg"> 그림 1: 표본 급락 실 및 필수 장비. A) 이 문서...

이 원고는 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위해 생물학적 표본을 수동으로 동결하는 블롯 앤 플런지 방법을 설명합니다.

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

여기에 설명된 수동 플런징 방법은 전송 전자 현미경 검사법을 위한 시료를 준비하기 위한 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 비디오에서는 수동 플런저를 설정하고 극저온을 준비하고 EM 그리드의 수동 블로팅 및 급락을 수행하는 방법을 시연합니다. 수동 급락 환경을 준비합니다.이 절차는 습도가 섭씨 40도 이상으로 유지되는 차가운 방에서 수행해야하며 여기에 표시된 재료를 사용하는 것이 좋습니다. 저온 드워와 수동 플런저를 준비합니다. 저온 드와르를 조립하려면 먼저 파란색 스티로폼 드와르 의 바닥에 플랫폼 베이스를 설치하여 평평하고 평평한 지 확인합니다.그런 다음 에탄 용기 홀더를 플랫폼 베이스 위에 놓고 황동 에탄 용기를 삽입합니다. 마지막으로 회전 그리드 스토리지 플랫폼을 배치합니다. 다음으로, 급락 하는 데와르 수동 플런저의 기지에 찾을 수 있습니다.에탄 선박을 급락팔 아래에 중앙으로 고정하고 급락하는 드와르를 기지로 고정시한다. 수동 플런징 높이를 설정하려면 먼저 급락 하는 팔의 베이스에 신선한 테이프를 연결 합니다. 다음으로, 플런징 암과 트위저 베이스 주위에 테이프를 단단히 감싸서 클램핑 핀셋 을 고정합니다.핀셋을 가볍게 눌러 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 급락하는 팔을 잡고 발 페달을 우울하게 하여 핀셋을 황동 에탄 용기로 천천히 낮춥니다. 핀셋이 황동 에탄 용기의 중간에 위치하도록 급락 데와르의 위치를 조정합니다.핀셋의 끝은 핀셋과 수동 플런저의 손상을 피하기 위해 황동 에탄 용기의 크기 또는 바닥에 접촉해서는 안됩니다. 위치가 설정되면 수동 플런징 암을 재설정합니다. 극저온을 준비합니다.극저온 제제는 통풍이 잘 되는 방에서 수행해야 하며 적절한 개인 보호 장비는 항상 착용해야 합니다. 먼저 액체 질소가 급락하는 데와르로 직접 들어가면 액체 질소 수준이 황동 에탄 용기의 상단에 도달하면 멈춥니다. 액체 질소가 격렬하게 버블링중지 한 후 진행할 만큼 시스템이 차가워야 합니다.이 경우 약 5분이 소요됩니다. 에단은 압축 가스로 제공되며 응축될 필요가 있습니다. 최적의 에탄 응축을 위해 가스 흐름을 설정하려면 에탄 가스 라인의 끝을 250 마일 의 물 비커에 삽입하고 버블링을 관찰하십시오.가스 흐름은 물의 표면을 격렬하게 방해하지 않는 기포의 꾸준한 흐름을 생성해야합니다. 에탄 응축을 시작하려면 황동 에탄 용기의 바닥에 에탄 가스 라인의 끝을 놓습니다. 금속 끝을 천천히 저어서 에탄을 액화하기 시작합니다.에탄이 식히기 시작하자마자 들리는 소리가 납니다. 황동 에탄 용기는 액체 에탄으로 가득 찬 3 쿼터로 채웁니다. 액체 질소로 급락하는 데와르를 위로 얹어 황동 에탄 용기에 닿지만 그 안에 흘러들어가지 않도록 합니다.균일 한 에탄 동결에 액체 질소의 첨가가 필요합니다. 거품 뚜껑을 파란색 으로 떨어지면 데와르가 완전히 굳어지도록 합니다. 에탄 가스 흐름을 다시 시작하고 가스 라인의 끝을 고체 에탄에 조심스럽게 놓습니다.팁을 용기에 수직으로 배치하고 바닥에 에탄을 분배하는 것이 중요합니다. 금속 끝을 천천히 저어 에탄을 녹이고 액체 에탄의 수준을 용기 의 상단까지 가져옵니다. 뚜껑을 약 1분간 닫고 에탄이 황동 용기의 가장자리 주위에 고화되어 2~3밀리미터의 고체 에탄이 보일 때까지 응고할 수 있습니다.에탄은 이제 생물학적 샘플을 동결하는 데 이상적인 온도에 있습니다. 급락하는 데와르를 수동 플런저 의 베이스에 조심스럽게 부착합니다. 플런징 암과 트위저 베이스 주위에 테이프를 단단히 감싸서 클램핑 핀셋 을 고정합니다.플런징 팔을 잡고 발 페달을 우울하게 하여 핀셋을 액체 에탄으로 천천히 낮춥니다. 핀셋이 액체 에탄의 중간으로 위치하도록 급락 데와르의 위치를 조정하여 고체 에탄 링과의 접촉을 피하십시오. 급락 재료 및 액세서리를 준비합니다.각 원형 필터 용지를 약 1센티미터 너비의 스트립으로 절단하여 얼룩질 용지를 준비합니다. 얼룩진 용지의 중앙을 만지지 말고 작은 끝 조각을 버리십시오. 얼룩진 종이 스트립이 건조하고 깨끗하며 오염 물질이 없는지 확인하는 것이 중요합니다.급락하기 전에 그리드 박스를 급락하는 데와르에 배치하여 적절한 슬롯에 넣습니다. 그리드가 자유롭게 회전할 수 있도록 보장합니다. 급락 동결에 의해 CryoEM 표본을 준비합니다.그리드 및 그리드 준비의 다양성으로 인해 그리드 친수성 렌더링을 위한 권장 프로토콜을 따릅니다. 그리드를 제대로 처리하려면 깨끗하고 건조한 클램핑 핀셋을 사용하여 외부 링에서 친수성 그리드를 선택합니다. 플라스틱 클램프를 밀어 그리드를 고정하고 핀셋을 부드럽게 눌러 그리드가 제대로 고정되도록 합니다.클램핑 핀셋에 보관된 그리드 의 전면에 3개의 마이크로리터 샘플을 적용합니다. 핀셋을 핀셋을 핀셋 베이스 주위에 테이프를 감싸서 수동 플런징 암에 단단히 부착합니다. 샘플은 이제 블롭고 얼어 붙을 준비가 되었습니다.검지 손가락과 엄지 손가락 사이에 깨끗한 얼룩장의 깨끗한 스트립의 각 끝을 누십시오. 안정된 위치를 확립하기 위해 급락 데와르의 가장자리에 손을 휴식. 블로팅 용지는 그리드 표면에서 약 1cm여야 합니다.중심이 그리드에 닿을 때까지 블로팅 용지를 구부립니다. 블로팅 용지는 그리드 표면과 평행하여 접촉도 허용하고 그리드 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 이동식 액체 전면이 확산을 멈추면 계산을 시작합니다.그리드를 5초 동안 블롯합니다. 손가락을 떼어 내고, 얼룩지는 용지를 긴장시키고, 격자 표면에서 빠르게 제거합니다. 동시에, 발 페달을 눌러 수동 급락 팔을 해제하여 그리드를 액체 에탄으로 잡고 있는 핀셋을 떨어놓습니다.액체 에탄에 갓 냉동 그리드를 유지, 조심스럽게 수동 급락 팔에서 핀셋을 분리. 핀셋을 조심스럽게 고정 해제하여 그리드를 분리할 수 있습니다. 에탄에서 액체 질소로 의 한 번의 신속한 움직임으로 황동 에탄 용기 아래액체 질소 저장소로 그리드를 이동합니다.그리드 상자에 그리드를 배치합니다. 대표적인 결과. 이 비디오에서 연구원들은 고해상도 이미징을 위해 유리체 얼음의 박막을 포함하는 많은 사각형으로 CryoEM 그리드를 준비할 수 있어야 합니다.샘플 농도 및 블로팅 시간을 조정하여 입자 밀도를 최적화할 수 있습니다. 여기서는 블롯 및 플런지 방법을 사용하여 CryoEM 샘플을 동결하기 위한 전체 워크플로우를 시연합니다. 깨끗한 클램핑 트위저를 사용하여 신선한 그리드를 선택하고 그리드를 제자리에 고정하십시오.그리드의 친수성 측에 3개의 마이크로리터를 적용하고 트위저 손잡이 주위에 테이프를 감싸서 수동 플런징 암에 핀셋을 고정합니다. 블로팅 용지를 그리드 표면에 평행하게 배치하고 블로팅 용지를 그리드쪽으로 부드럽게 구부려 블로팅을 시작합니다. 원하는 시간 후, 블로팅 용지를 그리드 표면에서 멀리 스냅 모션으로 이동하면서 발 페달을 누르고 뛰어내리는 팔을 방출하고 그리드를 액체 에탄으로 떨어뜨림부합니다.핀셋 주위와 수동 플런징 팔 주위에서 테이프를 조심스럽게 풀어. 하나의 신속한 움직임으로 에탄 용기에서 액체 질소 저장소로 그리드를 신속하게 전송합니다. 그리드 저장 상자에 그리드를 놓고 핀셋을 김지우에 싸서 건조시로 감싸십시오.

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연구

JoVE Journal

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필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법

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배우세요 단일 입자 극저온 전자 현미경을 위한 수동 블롯 및 플런지 동결 기법. 생물학적 표본을 준비하는 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 익히고, 최적의 온도와 습도 조건에서 고품질 결과를 얻는 절차를 습득하세요.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

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