Name: 호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 배우세요 장 내 장관 장기 배양 시스템을 이용한 호스트-미생물군유병 상호 분석 방법을. PDMS 기반 장치 제작과 콜론 조직 연결 기술을 통해 장 생리학을 보존하면서 정밀한 실험 제어가 가능합니다.

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우리는 창자 기관 문화 시스템 프로토콜을 최적화에 그들의 귀중 한 기여에 대 한 Yissachar 실험실의 과거와 현재 회원 감사. 원고의 비판적 편집에 대한 야엘 로어에게 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단 (3114831 보조금 없음), 이스라엘 과학 재단 - 브로드 연구소 공동 프로그램 (8165162 보조금) 및 의료 연구를위한 가스너 기금, 이스라엘에 의해 지원되었다.

이 프로토콜은 동물 복지 윤리위원회가 승인한 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. 실험 준비
<ol><li>창자 장기 배양 장치의 제조 (3 일)<ol>
<li>3D 프린터를 사용하여 장기 배양 장치에 재사용 가능한 플라스틱 금형을 인쇄합니다(장치에는 24개의 크고 큰 구멍이 있는 6개의 우물이 있고, 장치 커버 뚜껑의 경우)(3D 파일이 부착됨). 참고: 이러한 플라스틱 금형은 수많은 장치의 제조에 사용될 수 있습니다.</li>
		<li>무딘 말단 바늘(22 G & 18G)을 장치 몰드 내의 적절한 위치에 삽입하고 1세트의 장치 및 뚜껑에 대해 폴리디메틸실록산(PDMS) 믹스(1:10 중량 비, 베이스 대 촉매)를 약 20g캐스팅한다.</li>
		<li>금형을 진공 챔버에 30분 동안 놓고 PDMS 믹스에서 기포를 제거합니다.</li>
		<li>PDMS 중합을 완료하기 위해 하룻밤 동안 55 °C에서 금형을 배양합니다.</li>
		<li>PDMS가 설정되면 금형에서 바늘을 꺼내 서 조심스럽게 플라스틱 금형에서 배양 장치 와 뚜껑을 해제합니다.</li>
		<li>수술 용 블레이드를 사용하여 우물 윤곽선에서 PDMS 잔류물을 제거합니다. 비독성 실리콘 접착제를 사용하여 PDMS 장치 와 장치 커버를 커버 유리 (75mm x 50mm 마이크로 슬라이드)에 부착하고 부품을 하룻밤 도록 둡니다 (장치의 매끄러운 면에 접착제를 적용).</li>
		<li>루멘에 12 G 바늘을 삽입하고 12 18 G 바늘을 잘 넣습니다. 실리콘을 사용하여 모든 바늘을 제자리에 고정하고 하룻밤 도록 하십시오. 창자 장기 배양 장치의 적절한 공기 흐름을 위해 커버 뚜껑에 18 G 바늘 두 개를 삽입합니다.</li>
		<li>물로 채워진 주사기를 사용하여 모든 바늘이 누출된 지검을 확인합니다. 우물을 물로 채우면 우물에서 누출이 없는지 확인하십시오.</li>
		<li>결장과 연결되는 각 22 G 바늘에 두 개의 수술 매듭을 놓습니다. 장치와 뚜껑을 오토클레이브 종이 봉투에 넣고 오토클레이브로 살균합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배양 매체 (0.5h)<ol>
<li>생물학적 후드에서, 다음을 혼합 (50 mL 튜브): 37 mL 의 이스코브의 수정 된 덜벡코의 매체 (IMDM), KSR 혈청 교체의 10 mL, B27 보충의 1 mL, N2 보충의 0.5 mL, 0.5 ML 의 1 M HEPES 버퍼, 및 0.5 mL 의 필수 아미노산.</li>
		<li>전체 매체를 4°C로 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>튜빙 및 수술 도구 준비<ol>
<li>입력 루멘, 입력 우물, 출력 루멘 및 출력 웰 (12 짧은 튜브 및 12 긴 튜브)에 대한 튜브의 적절한 길이를 잘라. 튜브의 각 측면에 적절한 어댑터를 연결합니다.</li>
		<li>스트레이트 가위, 4배 얇은 집게, 2배 날카로운 집게 등 수술 도구를 준비합니다.</li>
		<li>튜브와 수술 도구를 오토클레이브 종이 봉투에 넣고 오토클레이브를 사용하여 소독합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발광 입력 (원하는 자극 - 박테리아, 대변, 약물 등)을 준비합니다.<ol>
<li>실험 전에, 세균 배양의 세균적 부하를 결정, 직렬희석에 의해(12)및 유산소 조건 하에서 배양.</li>
		<li>세균 부하를 계산한 후, 세균성 배양을 멸균 조직 배양 배지에서 희석하여 필요한 세균 농도를 얻습니다. 배설물 샘플의 경우 100 μm 여과기를 사용하여 필터링합니다. 참고: 비균 자극(약물, 대사산물 등)의 경우, 장 배양 배지를 사용하여 필요한 농도로 물질을 희석시다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 실험 설정 준비
<ol><li>장기 배양 배양 내부, 히터 유닛을 켜고 37°C로 설정한다.</li>
	<li>펌프와 입력 및 출력 주사기를 설정합니다.</li>
	<li>조직 배양 배지 입력<ol>
<li>생물학적 또는 라미나르 플로우 후드에서 입력 우물 주사기를 완전한 배양 배지로 채웁니다. 최종 볼륨은 실험의 지속 시간과 유량에 따라 달라집니다. 일반적으로 1 mL / h 플러스 제거를위한 추가 매체.</li>
		<li>Luer 잠금 어댑터를 사용하여 튜브를 주사기에 연결합니다. 채워진 주사기를 주사기 펌프에 놓습니다.</li>
		<li>입력 주사기를 제거합니다. 모든 튜브에서 폐기물 유리로 우물 매체가 흘러나오는지 확인하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발광 입력<ol>
<li>발광 입력 주사기를 자극 치료(박테리아, 약물 등)로 채웁니다. 볼륨은 실험 기간과 유량(일반적으로 30 μL/h+ 제거를 위한 추가 배지)에 따라 달라집니다.</li>
		<li>Luer 잠금 어댑터를 사용하여 튜브를 주사기에 연결합니다. 채워진 주사기를 주사기 펌프에 놓습니다.</li>
		<li>입력 주사기를 제거합니다. 자극이 모든 튜브에서 폐 유리로 흘러 나오는지 확인합니다. 다른 자극을 오염시키지 않도록 주의하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>출력<ol>
<li>출력 주사기 펌프에 빈 주사기를 놓습니다(펌프 모드를 '철수'로 설정).</li>
	</ol>
</li>
	<li>장치 설정<ol>
<li>부드럽고 최소한의 흐름에 대한 가스 혼합물(95% O2 + 5%CO2)을제어하는 레귤레이터를 설정합니다.</li>
		<li>라미나르 후드에서 장치를 검사합니다.</li>
		<li>멸균 IMDM으로 장치의 바늘을 플러시하여 바늘을 씻으시다.</li>
		<li>장치의 각 웰에 멸균 배양 배지 의 500 μL을 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 해부에 대한 준비<ol>
<li>라미나르 후드 내부에 멸균 수술 도구를 넣습니다.</li>
		<li>멸균 IMDM으로 10mL 주사기를 채우고 결장의 플러싱을 위해 멸균(autoclaved) 22 G 무딘 엔드 바늘을 연결합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 장기 문화
<ol><li>마우스 희생 및 조직 해부<ol>
<li>라미나르 후드에서 12-14일 된 쥐를 참수하여 희생하십시오. 70%의 에탄올로 마우스를 분사하고 마우스를 플라스틱 접시에 놓습니다.</li>
		<li>날카로운 가위와 집게를 사용하여 마우스를 해부하고 모든 지방과 결합 조직을 절단하여 위장에서 항문까지 소화관을 꺼내십시오. 결장절단을 잘라 새 접시에 놓습니다. 참고: 결장 조직과의 접촉을 최소화합니다. 결장 조직의 중간 부분을 만지지 마십시오. 조직을 부드럽게 잡고 조직의 가장자리에서만 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>결장 세척 및 세척<ol>
<li>해부 현미경하에서, 준비된 10mL 주사기(단계 2.7.2)로 멸균 IMDM(근위면으로)으로 결장 함량을 부드럽게 플러시한다. 장 조직에서 대변을 제거 한 후, 멸균 IMDM의 0.5 mL로 채워진 새로운 6 웰 플레이트에 결장배치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>결장 과 장치 연결<ol>
<li>조직을 가지고 조심스럽게 22 G 바늘에 연결하고 두 스레드와 꽉 넥타이를 만들 수 있습니다. 이 시점에서, 루멘 흐름에 결장의 올바른 방향을 유지하는 것이 필수적이다 (근위 = 입력, 탈구 = 출력). 6개의 조직에 대해 3.2-3.3 단계를 반복합니다.</li>
		<li>입력 바늘 Luer 잠금이 매체에서 비어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 그들을 비우게. 입력 바늘 Luer 잠금에 자극을 추가 (루멘에 기포의 입력을 피하기 위해). 적절한 자극으로 각 결장에 대해 이 단계를 반복합니다.</li>
		<li>모든 조직이 연결되어 있는지 확인하고 장치 위에 덮개 뚜껑을 배치합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장기 배양 장치를 펌프에 연결<ol>
<li>장치를 예열 된 온도 제어 챔버 (37 °C)에 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가스 흐름 연결<ol>
<li>적절한 입력 바늘을 사용하여 가스 어댑터를 커버 뚜껑에 연결합니다.</li>
		<li>입력 및 출력 튜브를 장치에 연결합니다. 참고: 근접 결장 면을 입력 욕조에 연결합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>자극 입력으로 루멘을 제거합니다.<ol>
<li>용기를 통해 발광 자극을 부드럽게 흐르고 출력 튜브의 중간 흐름을 확인합니다.</li>
		<li>외부 매체를 세척합니다.</li>
		<li>외부 매체를 3번 세척합니다(펌프를 입력 및 출력 모두에 대해 600 μL/min의 속도로 설정하십시오). 각 세척은 1 분 정도 걸립니다 (우물을 비우는 것으로 시작).</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험을 시작합니다.<ol>
<li>펌프를 다음 속도로 시작합니다. 유량: 루멘: 입력- 30 μL/h, 출력- 35 μL/h 외부 매체: 입력- 1000 μL/h, 출력- 950 μL/h 참고: 실험 시간은 30분에서 24시간 사이로 다를 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험 종료(결장 장기 배양을 위한 최대 24시간)<ol>
<li>장치에서 모든 튜브를 분리합니다.</li>
		<li>바늘에서 조직을 분리하고 원하는 판독을 계속합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li>
<li>Hooper, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+commensal+host-microbial+relationships+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.</a> Science. 291 (5505), 881-884 (2001).</li>
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<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).</li>
<li>Gazzaniga, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Colon+Chip+Technology+to+Identify+Commensal+Bacteria+That+Promote+Host+Tolerance+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014(2021).</li>
<li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li>
<li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li>
<li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li>
<li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li>
<li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li>
</ol>

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이 문서는 Yissachar 등최근 개발 한 ex vivo 창자 장기 문화에 대한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다 (게시된 9 및 게시되지 않은 데이터). 창자 기관 배양 시스템은 발광 흐름을 유지하면서 온전한 장 조각의 멀티플렉스 배양을 지원합니다. 그것은 내- 및 초광도 환경 (자극 복용량, 노출 시간 및 유량을 포함)에 대한 완전한 제어를 제공하고 순진한 장 조직 구조와 세포 복잡성9을보존한다.
프로토콜의 중요한 단계에는 다음이 포함됩니다. (1) 조직 해부는 최소한의 시간에 수행되어야하며, 매우 부드럽게 조직 손상을 최소화해야합니다 (손상된 사이트를 통해 세포 사멸 및 발광 함량의 누출로 이어질 수 있음). (2) 입력 포트를 근위 결장과 연결하고, 출력 포트를 결장의 단부 끝에 연결하여 장치에서 조직 방향을 유지한다. (3) 용기를 장치에 연결한 후 조직이 손상되지 않았...

소장은 세포가 상호 작용하고 발광 함량 (microbiota, 음식 등)과 상호 작용하고 통신 할 수있는 특정 구조로 조직 된 광범위한 세포 유형 (상피 세포, 면역 계통 세포, 뉴런 등을 포함하는 매우 복잡한 기관)입니다. 1. 현재, 숙주 -microbiota 상호 작용을 분석할 수 있는 연구 툴박스에는 체외 세포 배양 및 생체 내 동물 모델2를포함한다. 생체 내 동물 모델은 생리조직 구조3을 제공하지만 실험 조절이 불량하고 실험 조건을 조작할 수 있는 능력이 제한적이다. 시험관 내 배양 시스템은, 다른 한편으로는, 미생물4로 보충될 수 있는 1차 세포 또는 세포주를 사용하여실험파라미터를 단단히 통제하지만 세포 복잡성 및 조직 아키텍처가 결여된다. 현대 체외 학적 제는 마우스 또는 인간소스에서파생 된 상피 오르가노이드와 같은 건강하고 병리학적인 인간 조직 샘플의 고급 사용을허용5,6,점막 미세 환경을 모방 샘플7. 또 다른 예는 인간 대장 상피 세포주 (Caco2), 세포외 매트릭스 및 미세 유체 채널을 포함하는 '칩에 내장'분석8. 그러나, 시험관 내 샘플처럼 고급적이고 혁신적인 바와 같이, 그들은 정상적인 조직 아키텍처 또는 순진한 세포 조성을 유지하지 않습니다.
이를 해결하기 위해 Yissachar 외는 최근 생체 내 및 체외 모델 모두의 장점을 활용하여 온전한 장 부각 을유지하는 전 생체 오르간 배양 시스템9(그림 1)을 개발했다. 이 전 생체 내 창자 장기 배양 시스템은 6개의 결장 조직의 멀티플렉스 배양을 지원하는 맞춤형 배양 장치를 기반으로 하며, 시스템의 입력 및 출력을 제어하면서 유사한 조건에서 실험 입력을 검토할 수 있도록 합니다. 최근 연구는 이 시스템이 개별 장내 세균9,전체 인간 미생물대사산물 10 및 미생물 대사산물(11)에 대한장 내 반응을 분석하는 데 유용하다는 것을 입증하였다. 이 시스템은 처음으로 숙주, 미생물 및 환경 구성 요소에 대한 높은 수준의 제어와 이러한 초기 숙주 - 미생물 상호 작용의 연구를 할 수 있습니다. 또한 실험 전반에 걸쳐 실시간으로 시스템을 모니터링하고 조작할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg"> 그림 1: 창자 배양 장치의 회로도. 전체 장 조직 단편은 챔버(top)의 출력 및 입력 포트에 부착되며, 펌프는 루멘 내부와 외부 중간 챔버에서 중간 흐름을 조절한다. 전체 장치(아래쪽)에는 6개의 챔버가 포함되어 있습니다. 이 수치는 Yissachar 외 2017에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 게이지 블런트 니들</td><td>Mcmaster</td><td>75165a754</td><td></td></tr><tr><td>22 게이지 블런트 니들</td><td>Mcmaster</td><td>75165a758</td><td></td></tr><tr><td>다목적 접착제 셀란트 100% 실리콘</td><td>DAP</td><td>688</td><td></td></tr><tr><td>큐빅 진공 탈착기 VDC-21+ 2 선반</td><td></td><td>AAAD4021</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드 1 mm 두께의</td><td>코닝</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>미니 인큐베이터 im-10</td><td></td><td>AAH24315K</td><td></td></tr><tr><td>MPC 301E 진공 펌프</td><td></td><td>VI-412711</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 퀵 턴 튜브 커플 링 플러그</td><td>Mcmaster</td><td>51525k121</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 퀵 턴 튜브 커플 링 소켓</td><td>Mcmaster</td><td>52525k211</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머</td><td>다우</td><td></td><td>폴리디메틸실록산, PDMS</td></tr><tr><td>튜빙</td><td>Mcmaster</td><td>6516t11</td><td></td></tr><tr><td>Zortrax M200</td><td>Zortrax</td><td></td><td>Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360</td></tr><tr><td>Zortrax M200 재료: z-ultrat</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x), 무혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>HEPES 완충액 (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Iscove의 페놀 레드 함유 변형 둘베코 배지 (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>Non 필수 아미노산 (100x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>< 강력>수술 도구< / 강력 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>대형 가위</td><td>Aseltech</td><td>11-00-10</td><td></td></tr><tr><td>날카로운 집게</td><td>FS</td><td>T 11297-10</td><td></td></tr><tr><td>실크 꼰 수술 용 스레드</td><td>SMI</td><td>8010G</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 가위</td><td>FS T</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>얇은 집게</td><td>F.S.T</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Organ System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &micro; m 필터</td><td>생명 유전자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m 필터</td><td>수명 유전자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL 루어 잠금 주사기</td><td>B-D</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>Greenough 스테레오 현미경</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>순환 정밀 에어 히터 "CUBE"CUBE-2-LIS</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>주사기 펌프 뉴</td><td>에라 펌프 시스템 inc</td><td>nep-ne-1600-em</td><td></td></tr></tbody></table>

호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

창 자 조직의 구조 호스트와 창 자 microbiota 사이 밀접 하 고 상호 상호 상호 작용을 촉진. 이러한 교차 회담은 지역적이고 체계적인 항상성을 유지하는 데 매우 중요합니다. 창자 microbiota 조성에 변경 (dysbiosis) 인간의 질병의 넓은 배열과 연결. 숙주-미생물군유동성 상호작용을 해부하는 방법은 생리조직 구조(생체내 동물 모델에서 사용할 때)와 실험 인자에 대한 제어 수준(간단한 체외 세포 배양 시스템에서와 같이)의 보존 중 내재된 절충을 포함한다. 이 절충을 해결하기 위해 Yissachar 외는 최근에 장 기관 배양 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 순진한 결장 조직 구조 및 세포 메커니즘을 보존하고 또한 엄격한 실험 제어를 허용, 쉽게 생체 내에서수행 할 수없는 실험을 촉진. 발광 성 변류 (혐기성 또는 호기성 미생물, 쥐 또는 인간, 약물 및 대사 산물의 전체 미생물 샘플 포함)에 다양한 창자 구성 요소 (예 : 상피, 면역 학적 및 뉴런 요소)의 단기 반응을 해부하는 것이 최적입니다. 여기에서는 맞춤형 창자 배양 장치를 사용하여 여러 장 조각의 장기 문화에 최적화된 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 발광 성 변투에 대한 숙주 반응은 조직 섹션 또는 전산 조직 단편의 면역 형광 염색, 처투 내 혼성화 (FISH) 또는 시간 경과 이미징에 의해 시각화 될 수 있습니다. 이 시스템은 차세대 시퀀싱, 유동 세포측정, 다양한 세포 및 생화학 적 분석을 포함한 광범위한 판독을 지원합니다. 전반적으로, 이 3차원 기관 배양 시스템은 크고 온전한 장 조직의 배양을 지원하고 현지 창자 환경에서 숙주 미생물 작용의 고해상도 분석 및 시각화를 위한 광범위한 응용을 가지고 있습니다.

창자 기관 배양 시스템은 조직 생존성 ex vivo를 유지합니다. 조직 생존가능성에 대한 평가는 배양 기간 내내 이루어졌다. 결장 조직 단편은 창자 기관 배양 시스템에서 배양되었고 2/12/24 h 배양 에 따라 고정되었습니다. 장 상피 세포 (IEC) 층 무결성은 E-카데린과 사이토케라틴-18 항체를 사용하여 면역 형광 염색에 의해 검증되었다. 마찬가지로, 루멘 내의 대장 상피 및 점액 분비내의 점액이 채워진 잔 세포는 키-67염색(그림 2)에의해 표시된 바와 같이 식민지 토굴에서 IEC를 증식할 뿐만 아니라 검출하였다. 이러한 결과 및 기타9은 장 내 기능 및 구조 전 생체내 기능을 유지한다는 것을 보여준다.
급속한 전사 숙주 반응은 분할된 필라멘트 박테리아를 가진 장 식민지화에 의해 촉발되었다 (SFB). 두 개의 다른 면역 조절 창 자 미생물에...

이 문서는 전 생체 내 실험을 위한 새로운 창자 기관 배양 시스템을 사용하여 호스트-미생물군유전체 상호 작용을 분석하기 위한 독특한 방법을 제시합니다.

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

창자 장기 배양 시스템은 생체 외와 생체 내 작용의 장점을 결합하여 생체 내 실험에서 복잡한 시험관 내 실험 사이의 중간 실험 단계역할을합니다. 이 기술의 주요 장점은 장 생리학의 보존과 단단한 실험 제어의 조합입니다. 이 방법은 호스트, 미생물 및 환경 구성 요소에 대한 높은 수준의 제어로 특정 자극에 대한 장 반응을 분석하기위한 통찰력을 제공합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 석사 학생인 알론 셰메시와 실험실 매니저인 시반 아미드로 박사가 될 것입니다. 시작하려면, 장치 금형 내에서 적절한 위치에 무딘 말단 바늘을 삽입하고 장치 및 뚜껑의 한 세트에 대한 폴리 디메틸실록산 또는 PDMS 믹스의 약 20 그램을 캐스팅. 금형을 진공 챔버에 30분 동안 배치하여 PDMS 믹스에서 기포를 제거한 다음 밤새 55도의 금형을 배양하여 PDMS 중합을 완료합니다.PDMS가 설정되면 금형에서 바늘을 꺼내 서 조심스럽게 플라스틱 금형에서 배양 장치 와 뚜껑을 해제합니다. 수술 용 블레이드를 사용하여 우물 윤곽선에서 PDMS 잔류물을 제거합니다. 비독성 실리콘 접착제를 사용하여 PDMS 장치와 장치 커버를 75~50mm 마이크로슬라이드의 커버 글래스에 부착하고 부품을 하룻밤 사이에 설정하도록 둡니다.장치의 매끄러운 면에 접착을 적용합니다. 루멘용 12개, 게이지 바늘 12개, 게이지 바늘 12개, 게이지 바늘 18개 실리콘을 사용하여 모든 바늘을 제자리에 고정하고 하룻밤 도록 하십시오.입력 주사기를 제거하고 잘 매체가 모든 튜브에서 폐기물 유리로 흘러 나오는지 확인한 다음 입력 주사기를 제거하고 자극이 모든 튜브에서 폐유리로 흘러 나와 다른 자극을 오염시키지 않도록 주의하십시오. 마우스를 희생 한 후, 날카로운 가위와 집게를 사용하여 해부하고 모든 지방과 결합 조직을 절단하여 위장에서 항문까지 소화관을 꺼낼 수 있습니다. 결장절단을 잘라 새 접시에 놓습니다.조직을 부드럽게 잡고 가장자리에서만 접촉하는 것을 최소화하십시오. 해부 현미경하에서 결장 플러시를 수행합니다. 본문에 설명된 대로 준비된 10 밀리리터 주사기로 멸균 IMDM으로 결장 함량을 부드럽게 플러시합니다.장 조직에서 대변을 제거 한 후, 멸균 IMDM의 0.5 밀리리터로 채워진 새로운 6 개의 우물 접시에 결장배치. 다음으로, 결장 조직을 가지고 조심스럽게 22 게이지 바늘에 연결하여 두 개의 실과 단단히 묶습니다. 근동 및 탈말이 각각 입력 및 출력과 같을 정도로, 루멘 흐름에 대한 결장의 올바른 방향을 유지한다.모든 조직에 대한 결장 홍조와 바늘 묶는 반복. 입력 및 출력 튜브를 장치에 연결한 다음 원하는 속도로 펌프를 시작하여 실험을 시작합니다. 루멘 내의 대장 상피 및 점액 분비에서 점액이 채워진 잔 세포는 KI67 염색에 의해 표시된 바와 같이 식민지 토굴에서 IEC를 증식할 뿐만 아니라 검출되었다.이러한 결과는 창자 배양 시스템이 장 기능 및 구조 전 생체 를 유지한다는 것을 보여주었다. 분할 필라멘트 박테리아, 또는 SFB의 2 시간 후, 소개, 전형적인 SFB 필라멘트는 시투 혼성화에서 형광을 사용하여 소장 빌리와 가까운 연결에서 검출되었다. 추가적으로, 전송 전자 현미경 검사는 소장 상피 브러시 테두리의 몇몇 미크론 안에 SFB를 제시했습니다.전체 조직 샘플의 유전자 발현 프로파일은 SFB를 주입한 후 2시간 후에 삼중에서 생산되었다. 대조군 배양은 세균이 없거나 박테로이드 의 연약한 단원화 마우스의 배설물 현탁액으로 주입되었다. SFB에 의해 설득된 이러한 변화는 주로 세균없는 제어에 비해 작은 진폭이었다.결장의 방향은 매우 중요합니다. 바늘에 결장과 묶을 때 주의하십시오. 적절한 넥타이는 루멘 함량으로 우물의 오염을 방지할 수 있습니다.차세대 시퀀싱, 이미징, 세포 정렬 등과 같은 광범위한 판독 기법이 이 프로토콜을 따를 수 있습니다. 이 판독은 건강과 질병에 있는 호스트 microbiome 상호 작용에 새로운 통찰력을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 칼라타유드 아로요, M. 외. 시험관 내 숙주-미생물 인터페이스에서 합성 박테리아 컨소시엄의 생존 가능성 평가. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 박테리아의 생존 가능성을 연구하기 위한 시험관 내 장 숙주-미생물 모델을 시연합니다. Caco-2와 HT29-MTX 세포의 공동 배양은 모의 소화 조건 하에 사전 처리된 박테리아와 함께 배양됩니다. 상피 장벽의 완전성을 경상피 전기 저항을 이용해 평가하며, 배양지에서 분획, 용해된 점액, 세포 용해액, 세포 잔해물을 수집하여 후속 분석을 수행합니다.

박테리아 부착 및 내부 흡수를 평가하기 위한 시험관 내 장 모델

이 비디오에서는 쥐의 장 조직 조각과 특정 장내 세균 간의 상호 작용을 연구하기 위해 생체 외 장 장기 배양 시스템을 설정하는 방법론을 설명합니다. 이 장치는 두 쌍의 입력-출력 포트로 구성되며, 첫 번째는 장 조직 내강을 연결하고 특정 박테리아 현탁액을 공급하고, 두 번째는 생체 외 조직 생존력을 유지하기 위해 장치의 웰에 매체를 지속적으로 공급합니다.

숙주-미생물총(Microbiota) 상호작용을 연구하기 위한 생체 외 장기 배양 시스템

우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

생체 외 장기 배양은 온전한 조직 구조의 맥락에서 생물학적 과정을 조사할 수 있게 해줍니다. 여기에서는 장내 선천면역 및 항균 숙주 방어를 연구하는 데 사용할 수 있는 마우스 결장의 체외 배양 방법을 소개합니다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em항균 호스트 방어 연구에&gt; 콜론 오르간 문화와 그것의 사용

창 자 미생물 호스트 상호 작용은 합성 구두 커뮤니티, 생체 외에서 위장 소화, 그리고 소장 상피의 모델을 결합 하 여 새로운 접근 방식을 사용 하 여 평가 됐다. 우리 세포 침입 병원 체와 다중 종 biofilms의 평가 또는 테스트 probiotic 정립 생존 적응 될 수 있는 방법 제시.

생체 외에서 직감 호스트 미생물 인터페이스에 합성 세균 컨소시엄의 생존 능력을 평가

여기, 선물이 위장 장 관의 생리 조건을 시뮬레이션 bioreactors의 시리즈를 사용 하 여 콜론 생체 외에서, 의 본질적인 microbiota 경작을 위한 프로토콜.

인간의 본질적인 Microbiota 공부 기술을 경작 하는 체 외에서 고급 적용

이 프로토콜은 인체 배설물 미생물의 체외 배치 배양 발효 시스템을 설명하며, 이눌린(잘 알려진 프리바이오틱 및 가장 널리 연구된 미생물 변조기 중 하나)을 사용하여 특정 한 효과의 효과를 추정하는 데 이 시스템의 사용을 입증합니다. 대변 미생물 구성 및 대사 활동에 대한 개입.

인체 배설물 미생물에 대한 중재 식이요법의 효과를 추정하는 시험관 내 배치 배양 모델

여기서 설명된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다.

체외 목욕 발효 시스템을 사용하여 내분비병제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용 분석

이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

이 연구는 조직 줄기세포에서 유래한 장 오가노이드를 이용한 세균 감염의 시험관 내 조사 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 2차원에서 오가노이드를 배양하고 구분하는 방법, 침착성 대장균으로 감염시키는 방법, 그리고 상피 장벽 돌파, 감염 영상, 상피 RNA 반응 등 주요 측정값을 평가하는 방법을 설명합니다.

숙주-박테리아 상호작용을 연구하기 위한 침입 또는 저저막 추출물에 적용한 2차원 오가노이드 배양

배우세요 장 내 장관 장기 배양 시스템을 이용한 호스트-미생물군유병 상호 분석 방법을. PDMS 기반 장치 제작과 콜론 조직 연결 기술을 통해 장 생리학을 보존하면서 정밀한 실험 제어가 가능합니다.

호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템

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