Name: 연골 내의 마이그레이션 및 섭취 모니터링을 위한 세포외 소포 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 학습하세요 연골 조직에서 세포외 소포의 마이그레이션과 섭취를 공초점 현미경으로 관찰하는 방법을. 혈소판 라이세이트 유래 EV 라벨링 기술은 골관절염 연구와 치료 적용에 활용됩니다.

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이 연구는 INstituto 드 살루드 카를로스 III, 장관 드 Economía y Competitividad에 의해 투자되었다, ESF 유럽 사회 기금과 ERDF 유럽 지역 개발 기금에 의해 공동 투자 (MS16/00124; CP16/00124); PROGRAMA 주니어 델 프로이토 탤런트 플러스, construyendo SALUD, 제네란도 VALOR (JUNIOR01/18), 발레 아레스 제도의 지속 가능한 관광 세금에 의해 자금; 디레치오 장군 디Investigació, 콘셀러디아 d'Investigació, 지배 발레아 (FPI/2046/2017); FUTURMed 내에서 FOLIUM 박사 후 프로그램 (FOLIUM 17/01)에 의해, 발레 아레스 제도의 지속 가능한 관광 세금에 의해 50 %와 ESF에 의해 50 %로 자금; 그리고 코미시오 데 도센시아 i Investigacio 데 라 Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

참고: 이디스바 바이오뱅크(IB 1995/12 BIO)로부터 CEI-IB(IB 3656118 PI)의 프로젝트의 윤리적 승인 후 제도적 가이드라인에 따라 연골 이출을 획득했습니다.
1. 열 준비
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 또는 다음과 같이 열을 평형화합니다.<ol>
<li>열 캡을 제거하고 열을 상위화합니다. 용출하여 저장소 버퍼를 제거합니다.</li>
		<li>인산염 완충식식염(PBS)의 2.5mL로 컬럼을 3회 세척한다. 각 세척 하는 동안, 전체 볼륨을 흡수 하는 열에 대 한 기다립니다. 참고: 열을 건조시키지 마십시오.</li>
		<li>마지막 세척 후 와 샘플 준비까지 캡으로 컬럼을 덮습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. EV 라벨링
참고: 이 EV 라벨링 프로토콜은 이전에 설명된조건(21,22)을가진 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 이전에 격리된 PL-EV 샘플을 사용합니다. 그러나 모든 소스의 모든 EV 샘플은 이 프로토콜과 함께 사용될 수 있습니다.
<ol><li>집중 튜브를 사용하여 EV 샘플 및 제어(PBS)를 농축합니다.<ol>
<li>EV 샘플 시작의 시작 부피에 따라 샘플을 15mL 또는 500 μL 집중 튜브에 배치합니다. 거의 건조한 시료를 얻을 때까지 제조업체의 지시에 따라 튜브를 원심 분리합니다. 참고: 제어 샘플은 염료 배경을 확인하는 데 필요합니다. 이 방법은 특정 초기 부피를 필요로하지 않지만, 정제 단계에서 입자의 약 10 %가 손실되는 것으로 간주되어야한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>희석 C. 200 μL및 100 μL의 대조군으로 EV 샘플을 다시 중단하고 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.</li>
	<li>EV 샘플을 100 μL의 두 개의 알리쿼트로 분리하여 염료로 표시하고 치료(PKH-PL-EV)로 사용하십시오. 다른 표시되지 않은 상태로 두고 EV 샘플과 같이 (NTA-PL-EV)를 처리하고 NTA에 의해 EV 농도를 정량화하는 데 사용합니다.</li>
	<li>2배 염료 용액을 준비하여 희석 C로 8μM PKH26 용액을 생성합니다.</li>
	<li>샘플에 희석 C의 125 μL 당 1 mM PKH26 링커의 1 μL을 혼합합니다. 1:1 비율로 샘플에 추가하는 데 필요한 볼륨을 준비합니다.</li>
	<li>PKH-PL-EV에 2x 염료 용액을 추가하고 1:1 비율로 시료를 제어하여 1x 염료 농도와 4 μM PKH26 농도를 달성합니다. NTA-PL-EV 샘플에 동일한 양의 PBS를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>1:1 비율로 시료에 5% 소 세럼 알부민-PBS 용액을 추가하고 최종 부피가 ~400 μL인지 확인합니다. 참고: 이 단계를 사용하면 비특이적 염료 상호 작용 또는 무한염료를 제거할 수 있습니다.</li>
	<li>레이블이 지정된 EV를 언바운드 염료및 열과 염료의 비특이적 상호 작용에서 분리합니다.</li>
</ol>3. 라벨이 붙은 EV 격리
<ol><li>컬럼에서 캡을 제거하고 시료의 400 μL(PKH-PL-EV, NTA-PL-EV 또는 제어)을 추가하고 모든 용출된 액체를 폐기합니다.</li>
	<li>다음 단계로 진행하기 전에 샘플이 열을 완전히 입력할 때까지 기다립니다. PBS의 600 μL을 추가하고 모든 용출 된 액체를 폐기합니다.</li>
	<li>다음 단계로 진행하기 전에 PBS가 열을 완전히 입력할 때까지 기다립니다. PBS의 600 μL을 추가하고 1.5에 600 μL의 일부를 수집합니다. mL 원심분리기 튜브(EV 또는 제어). 참고: 샘플에서 과도한 염료를 제거하기 위해 이러한 단계가 필요합니다. 더 순수한 전기 EV를 얻으려면 열별 또 다른 분리가 필요합니다. 따라서, 다음 단계는 초기 세척 단계(4.2단계) 후에 새로운 평형 컬럼(step 4.1.) 또는 동일한 컬럼에서 수행되어야 한다.</li>
	<li>새로운 EV 분리 단계에 대한 열을 준비하여 더 순수한 전기를 얻습니다. 새 열인 경우 2.1단계를 반복합니다. 및 2.2. 동일한 열인 경우 2.5mL의 2.5mL로 열을 세척한 다음 2.1 및 2.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>2.5단계에서 얻은 이전에 용출된 전기 의 600 μL을 열에 넣고 용출된 부피를 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 액체가 열에 완전히 들어갈 때까지 기다립니다.</li>
	<li>PBS 의 400 μL을 추가하고 모든 용출 된 볼륨을 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 액체가 열에 완전히 들어갈 때까지 기다립니다.</li>
	<li>PBS의 600 μL을 추가하고 1.5mL 원심분리기 튜브에 600 μL의 일부를 수집합니다. 추가 분석을 위해 전기 및 제어 샘플을 사용하여 추가 분석을 하거나 4 oC에서 하룻밤 동안 저장합니다.</li>
	<li>나중에 사용할 수 있는 사용 된 열을 저장합니다.<ol>
<li>20% 이소프로판올의 25mL로 컬럼을 세척하고 용출된 부피를 폐기하십시오. PBS의 2.5 mL로 컬럼을 3번 세척합니다.</li>
		<li>1.1.1 단계에서 제거된 저장소 버퍼를 추가하고 버퍼가 열에 들어갈 때까지 기다립니다. 캡으로 열을 덮고 후속 사용까지 4oC에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EV 정량화
<ol><li>다음 두 단계에 의해 설명된 바와 같이 NTA-PL-EV 샘플 및 초기 PL-EV 샘플의 1:1,000 희석을 준비한다.<ol>
<li>0.2 μm 필터를 통해 여과된 PBS를 통해 1:10 희석NTA-PL-EV 와 1:10 희석 초기 PL-EV의 1mL을 준비한다.</li>
		<li>0.2 μm 필터를 통해 여과된 PBS로 이전 희석 시료의 1:100 희석1mL을 준비한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NTA 펌프에 멸균 주사기를 사용하여 1:1,000 희석NTA-PL-EV 샘플 또는 초기 PL-EV 샘플을 주입한다. 입자 농도 및 크기 분포 결정에 대한 제조업체의 지침 및 권장 사항을 따르십시오. 참고: EV 농도는 샘플 스타터 볼륨에 따라 달라지므로 중간 희석을 읽고 올바른 NTA 판정을 얻기 위해 조정해야 할 수도 있습니다.</li>
</ol>5. 염증 중심의 OA에 대한 치료로 사용되는 전기 자동차
<ol><li>PBS로 연골을 두 번 세척하고 멸균 조건하에서 3mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 소비합니다. 참고: 세포 배양 후드에서 5.1단계에서 5.6단계부터 절차를 수행합니다.</li>
	<li>37 oC, 5 % CO2,80 % 습도에서 1 % 페니실린 - 연쇄 절제술로 보충 DMEM-F12 배지와 96 웰 문화 판에 이식을 배치합니다.<ol>
<li>염증 중심OA 모델을 확립하려면 세포 배양 배지를 10 ng/mL 온코스타틴 M 및 2 ng/mL 종양 괴사 인자-알파(TNFα)로 보완한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1× 109 개의 입자 / 라벨이 붙은 전기 자동차 (PKH-PL-EV) 또는 온코사틴 M 및 TNFα로 보충 된 세포 배양 배지에서 제어하여 이물질을 처리합니다. 참고: 1× 109 입자/웰을 포함하는 샘플의 부피를 측정하고 컨트롤에 동일한 부피를 사용합니다.</li>
	<li>연골 이외에도 함유된 96웰 세포 배양 판에서 배지를 제거한다. 각 웰에 5.3 단계에서 설명된 세포 배양 배지의 200 μL을 추가합니다. 참고: 96웰 플레이트가 태아 소 혈청(FBS)과 접촉한 경우, FBS에서 전기를 제거하기 위해 200μL의 PBS로 각각 세 번 씻으세요.</li>
	<li>0, 1, 2, 3, 4 및 5 h : 다른 시간에 시험관 내 분석기를 중지합니다.</li>
	<li>연골을 함유한 세포 배양 우물을 PBS 200 μL로 두 번 세척합니다.</li>
	<li>4%의 파라포름알데히드(PFA)의 100μL을 조직에 추가하여 4oC에서 3시간 동안 고정합니다. 참고: PFA와 관련된 단계는 안전 데이터 시트 권장 사항에 따라 연기 후드에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>PFA를 제거하고, PBS의 100 μL을 추가하고, 고정 조직을 4°C에 저장하고, 48h 이내에 샘플을 처리한다.</li>
</ol>6. 현미경 검사기 준비 및 시각화
참고: 이 조직학적 절차는 탈수, 파라핀 포함 및 재수화 단계로 구성됩니다. 이러한 단계는 전반적인 염료 형광을 줄일 수 있습니다(PKH26에 대한 데이터 시트에 언급된 제한). 따라서, 냉동 단면과 같은 다른 절차는 공초점 현미경검사법에 의한 EV 시각화에 더 적합할 수 있다.
<ol><li>파라핀 블록에 고정 된 조직을 포함. 조직을 6 μm 두께의 섹션으로 자른다.</li>
	<li>조직 섹션을 분리합니다. 참고: 자일렌을 사용하는 모든 단계는 연기 후드로 수행해야 합니다.<ol>
<li>자일렌에 30분, 에탄올 100% 2분, 에탄올 96% 2분, 에탄올 75% 1분, 마지막으로 30초 증류수에 침수합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 섹션을 과미화합니다.<ol>
<li>조직을 과미화하기 위해 0.1% 트리톤-0.1% 구연산 나트륨 용액을 준비한다. 각 티슈 섹션에 20 μL 드롭을 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. PBS의 20 μL로 각 섹션을 두 번 세척합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경 슬라이드에, 형광을 보존하기 위한 수성 장착 매체와 함께 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 포함하는 장착 매체의 한 방울을 추가합니다. 6.3.1 단계에서 3개의 조직 단면을 포함하는 슬라이드를 덮습니다.</li>
	<li>빛으로부터 보호되는 실온에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.</li>
	<li>4 °C에 저장, 공초점 현미경 검사까지 빛으로부터 보호.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

EV 이미징은 방출 및 섭취 메커니즘과 같은 EV 특성을 이해하는 데 도움이 됩니다. 그들의 화상 진찰은 그들의 생체 분배의 감시 및 약동성 속성의 특성을 약 차량으로 허용합니다. 그러나, EV 이미징 및 추적은 그들의 작은 크기 때문에 어려울 수 있습니다, 많은 이미징 장치 및 라벨링 기술은 연구원이 체외및 생체 내 조건에서 전기를 모니터링하는 데 도움이 개발되었지만23,24,25.
광학 현미경 검사법에 의한 전기 를 추적할 때 두 가지 가능성이 존재합니다: 생체 발광 및 형광 화상 진찰. 둘 다 가시광선 스펙트럼(390-700 nm) 내에서 전기를 감지하는 데 사용됩니다. 생물 발광은 루시파아제 후 생성 된 화학 발광의 일종이다 기판의 산화를 촉매. 이 신호는 감지를 위해 초감도...

골관절염(OA)은 관절 연골1의세포외 매트릭스의 점진적이고 돌이킬 수 없는 염증 및 파괴를 의미하는 관절 퇴행성 질환이다. 관절염의 다양한 형태는 수많은 치료를 가지고 있지만2,3,4,이들은 자신의 부작용과 제한된 효능에 의해 제한됩니다. 자가 연골성 이식을 이용한 조직 공학 기술은 조기 OA 연골 병변4에서부상당한 연골의 재생 치료를 위해 일상적으로 적용된다. 세포 기반 치료법은 주로 연골3을효과적으로 수리할 수 있는 페노전형안정연골세포 또는 연골로겐이터의 수가 제한되어 있기 때문에 제한된다. 따라서 질병 진행을 방지하고 큰 연골 병변을 재생하는 새로운 치료 전략의 개발이 가장 중요합니다.
세포 외 소포 (EV)는 다른저자에의해 OA에 대한 치료로 제안되었습니다5,6. 전기자동차는 대부분의 세포 유형에 의해 분비되는 암골체이며, 세포간 신호에 관여하며, 줄기세포의 치료 효과를 발휘하는 것으로 나타났으며,8,9,최근재생의학에대한 관심을 유도하고 있다. 중간엽 기질 세포(MSC)에서 유래된 전기는 OA를 위해 조사되는 주요 치료 용 전기자동차이지만, 다른 관절 관련 세포는 EV 소스, 예를 들어, 촌드롭로겐이터 또는 면역세포(11,12)로사용되어 왔다.
혈소판 용액(PLs)과 같은 혈소판 농축물들은 각막궤양(13,14,15) 또는 힘줄 조직 재생16과같은 상이한 부상에서 상처 치유를 향상시키는 데 사용되며, 혈소판 농축물의 EV 성분이 이러한 효과에 대한 책임이 있을 수 있다는 가설 로 인해17 . 관절 관련 질환과 관련된 일부 연구는 혈소판 유래 EV (PL-EV)를 관절 관절염 조건에 대한 치료로 사용합니다. PL-Ev는 Wnt/β-카테닌통로(18)를활성화하여 연골세포 증식 및 세포 이동을 개선, 골관절염분골19에서연골성 마커의 발현을 촉진하거나, 더 높은 수준의 연골관절염 단백질을 나타내거나, PL-E18로 치료된 골관절염 토끼의 더 적은 치창 이상을 보여준다.
전기자동차는 표적 세포로 해방되는 단백질, 지질 및 핵산을 함유하고 있으며, 세포 간 통신을 확립하여 치료 적용20과관련된 주요 특징이다. EV의 효과는 도달 셀과 후속 화물 방출에 따라 달라집니다. 이러한 효과는 대사 활동 또는 유전자 발현 수정과 같은 세포에 의한 변화에 의해 간접적으로 확인할 수 있다. 그러나 이러한 방법은 EV가 세포에 도달하는 방법을 시각화하여 기능을 발휘하도록 허용하지 않습니다. 따라서, 본 논문은 염증 중심의 OA 연골 연골 경질 에 대한 치료제로 사용되는 이러한 PL 유래 전기자동차를 라벨링하는 방법을 제시한다. 공초점 현미경 검사는 5h의 시간 경과에 있는 소멸에 존재하는 연골세포에 EV uptake 및 진행을 감시하기 위하여 이용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 원심분리기 튜브</td><td>SPL 생명 과학</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기 BD Plastipak</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올(이소프로판올)</td><td>Panreac AppliChem</td><td>1.310.901.211</td> Milli-Q 물 96-well 배양 플레이트<td>를 사용하여 20%로 준비</td></tr><tr><td></td><td>SPL 생명 과학</td><td></td><td></td>PLC30096</tr><tr><td>앱솔루트 에탄올 Pharmpur</td><td>Scharlab</td><td>ET0006005P</td> Milli-Q water Biopsy Punch with plunger<td>로 96%와 75% 에탄올을 준비하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>3 mm</td><td>Scandidact</td><td>MTP-33-32</td><td></td></tr><tr><td>소 세럼&nbsp; 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>PBS</td></tr><tr><td>연골 외식으로</td> 5 %로 준비 <td>IdISBa Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>농축 튜브 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>MCP100C41</td><td></td></tr><tr><td>농축 튜브 500 &micro; L Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리 24 x 60 mm</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 -GlutaMAX 매체</td><td>Biowest</td><td>L0092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (1x)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>임베디드 파라핀 조직 블록</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td>서비스 요금</td></tr><tr><td>Exo-spin mini-HD 컬럼</td><td>세포 안내 시스템</td><td>EX05</td><td></td></tr><tr><td>Feather S35 Microtome Blade</td><td>Feather</td><td>43037</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 &micro; m 주사기 필터</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6057</td><td></td>Oncostatin<td>을 사용한 Fluoroshield</td></tr><tr><td>M Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9635-10UG</td><td>0.1 &micro의 최종 농도로 원액을 준비합니다. g/&마이크로; L PBS-0.1% BSA</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리</td>치 <td>8.18715.1000</td>에 딜루텐 <td>PBS로 4%로 제조하고 4°°C에 저장; C</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 일반 세포막 라벨링용 적색 형광 세포 링커 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 및 Dliuent C 포함</td></tr><tr><td>구연산나트륨 이수화물</td><td>Scharlab</td><td>SO019911000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>TNF&알파;</td><td>R& D 시스템</td><td>210-TA-005</td><td>최종 농도 0.01 &micro로 원액을 준비합니다. g/&마이크로; L PBS-0.1% BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td>에 희석 <td>Milli-Q 물로 0.1% Triton-0.1% 구연산나트륨 용액을 제조하는 데 사용</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Scharlab</td><td>XI0050005P</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11 rotor</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>&</td><td>lambda;= 532 nm에서 내장된 레이저와 카메라 sCMOS</td>Shandon Finesse 325 수동 마이크로톰 Thermo Scientific&trade가 있는 Malvern <td>NS300</td> 장치</tr><tr><td></td><td>;</td><td></td><td></td>A78100101</tr><tr><td>TCS-SPE 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>5200000271</td><td></td></tr></tbody></table>

연골 내의 마이그레이션 및 섭취 모니터링을 위한 세포외 소포 라벨링

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

세포 외 소포 (EV)는 혈소판 용해 (PL)와 같은 세포 공급원에서 파생 된 화물로 인해 세포없는 치료로서의 잠재력을 증명하기 위해 다른 연구에서 사용됩니다. 치료로 사용되는 경우, EV는 표적 세포를 입력하고 이들로부터의 반응에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 이 연구에서, PL 유래 전기 는 골관절염에 대 한 세포 없는 치료로 공부 되었습니다 (OA). 따라서, 방법은 EV를 라벨과 연골 각질에 대한 그들의 섭취량을 테스트하도록 설정되었다. PL 유래 전기는 리포마이트 염료 PKH26로 표지되고, 컬럼을 통해 두 번 세척한 다음, 나노입자 추적 분석(NTA)에 의한 입자 정량화 후 5h에 대한 체외 염증 중심OA 모델에서 테스트한다. 시간당 연골 이출은 고정되고, 파라플료로 절단되어 6 μm 섹션으로 절단되어 슬라이드에 장착하고, 공초점 현미경으로 관찰됩니다. 이를 통해 이 기간 동안 EV가 대상 셀(연골세포)에 진입하는지 여부를 검증하고 직접적인 효과를 분석할 수 있습니다.

도 1에EV 라벨링 및 업테이크 모니터링에 대한 회로도 개요가 표시됩니다. 표 1에서 NTA에 의해 검출된 입자 농도 및 EV 크기는 컬럼으로 라벨링한 후 두 번 수행된 정화 단계로 인해 공정 중에 EV 농도가 감소함을 보여준다. 그러나, 얻어진 양은 처리를 위해 사용하는 입자의 수의 최적 범위에 있다. 이러한 입자 농도는 골관절염 연골 경질을 치료하는 데 사용되는 PKH-PL-EV 및 제어의 부피를 계산하는 데 사용됩니다.
연골 이출이 EV 또는 대조군으로 처리되면 0, 1, 2, 3, 4 및 5 h의 다른 기간 동안 고정됩니다. 각 그룹은 DAPI를 포함하는 마운팅 배지를 가진 공초점 현미경 검사법을 위해 파라핀화, 슬라이스 및 준비됩니다. 각 시간 시점에서 각 그룹의 대표적인 이미지는 도 2에제시되며, EV가 연골세포에 도달하여 시간이 지...

여기에서, 우리는 골관절염을 위한 모형으로 이용된 연골 이병 에서 그들의 이동 그리고 upup를 감시하기 위하여 혈소판 lysate 유래 세포외 소포를 레이블을 붙이는 프로토콜을 제시합니다.

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

이 간단한 프로토콜은 EV에 레이블을 지정하고 공초점 현미경 검사를 통해 모니터링 할 수 있습니다. 예를 들어, EV 이미징 치료에서 사용할 때 EV 분포를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 특별한 기능없이 공초점 현미경 검사법을 사용하여 연골 이외에도 연골 의 EV 마이그레이션 및 섭취를 쉽게 모니터링 할 수 있습니다.동일한 프로토콜은 시험관 내 또는 생체 내 실험용 EV에 사용할 수 있습니다. 입자의 약 10%가 정화 단계에서 손실될 것이라는 점을 고려하여 기둥이 미리 준비되고, 전기의 초기 부피가 원하는 최종 입자 농도에 도달하기에 충분했는지 확인하십시오. 세포 외 소포 또는 EV, 샘플 및 제어를 집중하여 시작합니다.EV 샘플의 시작 부피에 따라 15 밀리리터 또는 500 마이크로리터 집중 튜브에 샘플을 배치합니다. 거의 건조한 시료를 얻을 때까지 제조업체의 지시에 따라 튜브를 원심 분리합니다. 농축 된 EV 샘플을 200 마이크로 리터로 다시 중단하고 100 마이크로 리터의 희석 C를 가진 대조군을 다시 중단하고 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 전송합니다.EV 샘플을 각각 100마이크로리터의 두 개의 알리쿼트로 분리합니다. 염료로 알리쿼트 중 하나를 표시하고 치료로 사용하십시오. 다른 표시를 남기지 말고 EV 샘플처럼 처리하고 나노 입자 추적 분석에 의해 EV 농도를 정량화하는 데 사용합니다.희석 C에서 PKH26 용액의 생성 농도가 8 마이크로몰어가 될 수 있도록 2배 염료 용액을 준비한다. 샘플에 희석 C의 125 마이크로리터 당 1 밀리 마일러 PKH26 링커의 마이크로 리터 1개를 혼합합니다. 1:1 비율로 샘플에 추가하는 데 필요한 볼륨을 준비합니다.PKH 혈소판 용해 유래 전기자동차및 대조료에 2x 염료 용액을 1:1 비율로 첨가하여 1x 염료 농도, 4개의 마이크로몰라 PKH26 농도를 달성한다. NTA 혈소판 용해 유래 EV 샘플에 동일한 PBS 의 PBS 를 추가합니다. 실온에서 5분간 배양하세요.1:1 비율로 샘플에 5%소 세럼 알부민-PBS 솔루션을 추가하고 최종 볼륨이 약 400 마이크로리터인지 확인합니다. 레이블이 지정된 EV를 언바운드 염료 및 열과의 비특이적 염료 상호 작용에서 분리합니다. 기둥에서 캡을 제거하고, PKH 혈소판 리사테 유래 EV, NTA 혈소판 리사테 유래 EV의 400 마이크로리터를 추가하거나, 모든 용출된 액체를 제어하고 폐기한다.다음 단계로 진행하기 전에 샘플이 열을 완전히 입력할 때까지 기다립니다. PBS 의 600 마이크로 리터를 추가하고 모든 용출 액체를 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 PBS가 열을 완전히 입력할 때까지 기다립니다.PBS의 600 마이크로 리터를 추가하고 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브에 600 마이크로 리터의 일부를 수집합니다. 새 열의 경우 프로토콜 시작 부분에 언급된 샘플의 농도와 관련된 단계를 반복합니다. 이전에 용출된 EV 600마이크로리터를 열에 추가하고 용출된 볼륨을 폐기합니다.그런 다음 PBS의 400 마이크로 리터를 추가하고 모든 용출 된 볼륨을 폐기합니다. 600 마이크로리터의 PBS를 컬럼에 추가하고 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 600마이크로리터를 수집합니다. PBS로 연골을 두 번 세척하고 멸균 조건하에서 3밀리미터 직경의 생검 펀치를 사용하여 소비합니다.DMEM-F12 배지로 96웰 배양 판에 이식하여 섭씨 37도, CO2 5%, 습도 80%로 보충합니다. 염증 중심의 OA 모델을 확립하려면 온코스타틴 M의 밀리리터당 10 나노그램, 종양 괴사 인자-알파의 밀리리터당 2나노그램으로 세포 배양 배지를 보완한다. 온코사틴 M 및 종양 괴사 인자-알파로 보충된 세포 배양 배지에서 PKH 혈소판 리사테 유래 EV 또는 대조군당 1회 10~9번째 입자로 이물질을 치료한다.연골 이외에도 함유된 96웰 세포 배양 판에서 배지를 제거한다. 원고에 기재된 세포 배양 배지의 200마이크로리터를 각각 첨가한다. 체외 분석은 0에서 5 시간마다 중지합니다.연골을 함유한 세포 배양 우물을 PBS 200 마이크로리터로 두 번 세척합니다. 조직에 4%의 파라포름알데히드100마이크로리터를 추가하여 섭씨 4도에서 3시간 동안 고치게 합니다. PFA를 제거하고, PBS 100 마이크로리터를 추가하고, 고정 조직을 섭씨 4도에 저장하고, 48시간 이내에 샘플을 처리합니다.서로 다른 시점에서 찍은 이미지는 EV가 연골 세포에 도달하고 시간이 지남에 따라 연골 세포에 들어갈 때까지 조직에 어떻게 들어가는지 보여줍니다. 라벨이 부착된 전기 는 이미 1시간 동안 의배양 후 연골세포 주변에 국한되었다. 초기 EV 볼륨이 원하는 최종 입자 농도에 도달하기에 충분합니다.기억해야 할 또 다른 중요한 점은 향후 24시간 이내에 레이블이 부착된 EV를 사용하는 것입니다. 24시간 이내에 사용하지 않으면 형광이 감소될 수 있습니다. 이 기술은 연구원이 EV 영상을 개선하고 생물학 및 치료 분야에서 EV를 연구하는 데 도움이 될 것입니다.

labeling-extracellular-vesicles-for-monitoring-migration-uptake

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

프레 젠 테이션의 목표는 MR 영상과 시각 수있는 연골의 결함에 매트릭스 관련 줄기 세포 이식을 생성하는 높은 재현성 방법을 입증하는 것입니다. 줄기 세포는 아가로 오스와 혼합 FDA 승인 Ferumoxides, 연골의 결함에 심어 및 7T MR 스캐너와 함께 몇 군데으로 표시됩니다.

Ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 Mesenchymal 줄기 세포로 표시

이 비디오에서는 세포외 소포체 또는 EV의 세포 흡수를 시각화하고 정량화하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 컨포칼 현미경을 사용하여 3D 형광 이미징을 활용하며 내재화된 EV와 세포 표면에 부착된 EV를 구별할 수 있습니다.

Extracellular Vesicle Uptake Assay: 3D 형광 이미징 기법을 사용하여 세포외 소포의 세포 흡수를 시각화하고 정량화하는 방법

이 프로토콜에는 빨강 형광 라벨 내부 관절 (IA) 주입을 통해 쥐 무릎 관절염 (KOA) 모델에 의해 셀 속성과 biodistribution 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs)의 모니터링 하는 효율적인 방법을 설명 합니다.

Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

이 프로토콜에서 우리는 형광 기반 나노-추적 분석 하 여 인간의 전체 혈액에서 세포 외 vesicles의 신속한 격리 및 특정 마커의 특성화에 대 한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 제시 결과 재현성의 높은 레벨을 표시 하 고 셀 문화 supernatants 조정 될 수 있습니다.

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

여기에서는 3D 바이오리액터를 이용하여 활액 중간엽 줄기세포로부터 다수의 GMP급 엑소좀을 생산하는 프로토콜을 제시합니다.

3D 생물반응기 배양에 의한 활액 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 대규모 제조

우리는 PKH 염료로 대식세포 유래 작은 세포외 소포를 라벨과 시험관 내 및 척수에서 그들의 upup을 관찰하는 프로토콜을 기술합니다.

체외 및 척수에서 형광 라벨 작은 세포 외 소포의 섭취

세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

이 프로토콜은 중간엽 기질 세포에서 방출되는 세포외 소포체(EV)를 분류하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 특히 기기 설정 및 분류 조건의 최적화에 중점을 둡니다. 목표는 세포외 소포체의 특성을 보존하면서 분류하는 것입니다.

세포외 소포 격리를 위한 성공적인 분류 설정

학습하세요 연골 조직에서 세포외 소포의 마이그레이션과 섭취를 공초점 현미경으로 관찰하는 방법을. 혈소판 라이세이트 유래 EV 라벨링 기술은 골관절염 연구와 치료 적용에 활용됩니다.

연골 내의 마이그레이션 및 섭취 모니터링을 위한 세포외 소포 라벨링

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