Name: 티 임플란트의 혈소판 유래 세포 외 소포 기능화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 16 s
Description: 학습하세요 혈소판 유래 세포 외 소포를 이용한 티타늄 임플란트 표면 기능화 방법을. 드롭 캐스팅 기법으로 저비용 생체재료 코팅이 가능하며, 재생의학 및 정형외학 적용에 효과적입니다.

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이 연구는 INstituto 드 살루드 카를로스 III, 장관 드 Economía y Competitividad에 의해 투자되었다, ESF 유럽 사회 기금과 ERDF 유럽 지역 개발 기금에 의해 공동 투자 (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), 디레치오 제너럴 디Investigació, 콘셀러티아 d'Investigació, 지배 발레어 (FPI/2046/2017), 그리고 PROGRAMA 주니어 델 프로젝트 탤런트 플러스, construyendo SALUD, 제네란도 VALOR (주니어01/18), 지속 가능한 관광 에 의해 금융.

혈소판 리사테(PL)는 IdISBa Biobank가 제공하는 신선한 버피 코트를 사용하여 기관 가이드라인3 에 따라 이전에 설명된 바와 같이 얻어진다. 현재 프로젝트에 대한 그들의 사용은 윤리위원회 (IB 1995/12 BIO)에 의해 승인되었습니다.
1. PL에서 격리된 EV
<ol><li>더 큰 바디 제거<ol>
<li>실온에서 PL을 해동하십시오.</li>
		<li>원심분리기 PL에서 1,500 x g 에서 4°C에서 15분 동안. 이 셀 파편이 포함된 펠릿을 폐기하십시오.</li>
		<li>상체를 수집하고 4 °C에서 30 분 동안 10,000 x g 에서 2 개의 연속 원심 분리를 수행합니다. 참고: 펠릿은 마이크로베실과 같은 더 큰 전기에 해당하며,이 경우 폐기됩니다.</li>
		<li>상체를 먼저 0.8 μm 다공성 멤브레인을 통과한 다음 0.2 μm 다공성 멤브레인을 통해 필터링합니다. 참고: 이러한 단계는 원하지 않는 모든 EV를 제거합니다.</li>
		<li>필터링된 PL을 풀로 풀과 사용 전까지 -20°C에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>크기 제외 크로마토그래피<ol>
<li>여과된 PBS와 원하는 유량으로 크로마토그래피 장비에 결합된 컬럼을 상형화합니다. 참고: 사용되는 유량은 열 특성에 따라 다릅니다. 이 경우 0.5 mL/분으로 설정됩니다.</li>
		<li>처리된 PL(5mL)을 주사기로 장비에 적재합니다.</li>
		<li>PL을 컬럼에 주입하고 15mL 튜브에서 5mL 분획을 수집하기 시작합니다.</li>
		<li>EV농축 분획을 수집하고 사용할 때까지 -80°C에 보관하십시오. 참고: 처음으로 실험을 수행할 때, 단백질 정량화 및 면역 검출에 의해 모든 분획을 특성화하여 EVs3,11로 농축된 것을 결정합니다. 이 실험에서 9번째 분획이 수집됩니다.</li>
		<li>크로마토그래피 컬럼을 0.2% NaOH 용액의 30mL로 세척하고 평형에 도달하면 20% 에탄올 용액에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62781/62781fig01.jpg"> 그림 1: 혈소판 리세이트(PL) 세포외 소포(EV) 절연의 회로도도. PL은 먼저 1,500 x g에서 원심 분리된 다음 10,000 x g 에서 더 큰 바디를 제거합니다. 상체는 0.8 및 0.2 μm 필터를 통해 필터링됩니다. 처리된 PL은 컬럼에 로드되고, EV는 크기 배제 크로마토그래피로 구분된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62781/62781fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. EV 특성화
참고: 기능학을 수행하기 위해서는 전기자동차 특성화가 필요합니다12. 전자 현미경 검사법 또는 서부 얼룩 특성화는 이전에보고되었다13. 이 보고서는 Ti 표면 기능화를 위한 필수 특성화 기술에 중점을 둡니다.
<ol><li>나노 입자 추적 분석 (NTA)<ol>
<li>0.2 μm 여과 된 PBS에서 전기 자동차 (1:1000)를 희석시하십시오. 참고: 너무 농축된 시료 또는 너무 희석된 시료는 NTA 측정을 위해 범위를 벗어나고 조정이 필요합니다.</li>
		<li>희석된 전기자동차의 1mL을 주사기로 NTA 장비에 적재하고 NTA 장비에 주입한다.</li>
		<li>입자 농도 및 크기 분포 측정을 위해 제조업체의 프로토콜을 따릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단백질 농도<ol>
<li>1μL의 EV 용액을 사용하여 농도를 결정합니다. 280 nm의 파장에서 분광계로 흡광도를 측정합니다. 참고: 전기 는 입자의 수에 비해 단백질의 낮은 수준을 제시한다.</li>
		<li>제조 업체의 지시에 따라 분광계를 사용하여 흡광도 판독을 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 티타늄 표면 기능화
참고:이 방법에서는 가공티타늄 디스크, c.p. 등급 IV, 직경 6.2mm 및 높이 2mm가 사용됩니다. 디스크는 Ti 핀셋으로 조작될 수 있지만 표면을 긁지 않는 것이 중요합니다. 또한, 가공된 쪽은 전체 프로세스 중에 위쪽으로 직면해야 합니다.
<ol><li>티 디스크 세척 참고 : Ti 세척에 사용되는 솔루션의 양은 Ti 디스크를 커버하기에 충분해야합니다. 티 디스크를 유리 비커에 넣고 솔루션을 붓습니다. 그런 다음 해독하여 용액을 제거합니다.<ol>
<li>티 임플란트를 탈온화(DI) 물로 씻은 다음 물을 버립니다.</li>
		<li>에탄올70%로 Ti 임플란트를 세척한 다음 용액을 제거합니다.</li>
		<li>임플란트를 DI 물에 놓고 50°C에서 5분 동안 초음파 처리합니다. 물을 버리십시오.</li>
		<li>교반으로 10 분 동안 50 °C에서 40 % NaOH 용액으로 Ti 임플란트를 인큐베이션합니다. 솔루션을 폐기합니다. 주의: NaOH 솔루션은 준비 중에 따뜻해합니다. 용액은 부식성이며 연기 후드 내부에 사용해야합니다.</li>
		<li>50°C에서 50°C에서 임플란트를 초음파 처리한 다음 물을 제거합니다.</li>
		<li>중립 pH에 도달할 때까지 DI 워터(최소 5개)로 여러 번 세서히를 수행합니다. pH 표시기와 pH를 확인합니다.</li>
		<li>50°C에서 DI 수에서 임플란트를 5분 동안 초음파 처리하여 물을 제거합니다.</li>
		<li>50°C에서 50° C의 50% HNO3 용액에 Ti 임플란트를 10분 동안 교배하여 배양합니다. 솔루션을 제거합니다. 주의: HNO3 는 부식성 및 산화제 물질이며 연기 후드 내부에 사용해야 합니다.</li>
		<li>50°C에서 50°C에서 DI 수에서 임플란트를 5분 동안 초음파 처리합니다. 물을 제거합니다.</li>
		<li>중립 pH가 얻어질 때까지 DI 수(최소 5)로 여러 번 의 세하를 수행한다. pH 표시기로 pH를 확인합니다.</li>
		<li>50°C에서 50°C에서 DI 수에서 임플란트를 5분 동안 초음파 처리합니다. 물을 제거합니다. 참고: 이 시점에서 Ti 임플란트를 70% 에탄올 용액에 저장하여 실험을 중지할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>티 패시베이션 참고: Ti 통과 단계는 아래에 나열된 순서대로 Ti 디스크를 다른 솔루션으로 완전히 덮음으로써 수행됩니다. 티 디스크는 유리 비커에 배치하고 솔루션은 부드럽게 그들에 부어된다. 모든 세척 단계에서 사용되는 볼륨은 임플란트를 완전히 커버해야하며 탈충을 통해 제거됩니다.<ol>
<li>Ti 임플란트를 30% HNO3 솔루션으로 배양하여 부드러운 동요 하에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 솔루션을 제거합니다.</li>
		<li>중립 pH에 도달할 때까지 DI 워터(최소 5개)로 여러 번 세서히를 수행합니다. pH 표시기로 pH를 확인합니다.</li>
		<li>디 워터의 실온에서 하룻밤 동안 티 임플란트를 인큐베이션합니다.</li>
		<li>진공 조건에서 임플란트를 40°C에서 10분 동안 건조시하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EV 드롭 캐스팅 참고: 세포 기능 연구의 경우 세포 배양 캐비닛에서 작업하는 것이 중요합니다.<ol>
<li>Ti 임플란트를 96웰 플레이트에 놓고 가공된 면이 위를 향합니다. 참고: 임플란트가 거꾸로 뒤집힌 경우 바늘을 사용하여 다시 설정할 수 있습니다.</li>
		<li>전기자동차 용액을 해동하고 교반과 섞습니다. 소용돌이를 사용하여 3초 동안 펄스를 사용하십시오.</li>
		<li>티 표면에 전기 를 입금합니다. 이 연구에서는 NTA가 결정한 농도에 따라 임플란트당 최대 4 x 1011 EV를 고정하기 위해 40μL의 EV 용액을 Ti에 배치합니다.</li>
		<li>낙하가 완전히 건조 할 때까지 진공 조건하에서 Ti가 함유 된 플레이트를 37 °C에서 놓습니다 (~2 h). 참고: 진공 챔버에 존재하는 임플란트 수와 물에 따라 시간을 조정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62781/62781fig02.jpg"> 그림 2: 드롭 캐스팅에 의한 Ti 패시베이션 및 EV 기능화의 회로도. Ti 임플란트는 실온에서 30% HNO3 용액에서 30분 동안 인큐베이션으로 먼저 전달됩니다. DI 물로 여러 번 해시 한 후 pH는 중립에 도달합니다. 그런 다음, Ti 임플란트는 DI 물의 실온에서 하룻밤 동안 배양됩니다. 그 후, 임플란트는 40 °C에서 진공 조건하에서 건조된다. 전기자동차의 경우 40μL의 전기자동차 용액이 Ti 임플란트에 증착됩니다. 다음으로, 임플란트는 전기가 물리적으로 표면에 결합될 때까지 진공 상태에서 2시간 동안 배양됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62781/62781fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
4. Ti 표면 특성화
<ol><li>릴리스 스터디<ol>
<li>37°C에서 여과된 PBS의 200 μL로 Ti 표면을 배양합니다. 참고: PBS는 NTA 측정과의 간섭을 피하기 위해 필터링됩니다.</li>
		<li>PBS를 다른 시점에서 교체하고 -80 °C에 저장합니다. 참고: 이 연구에서는 2일, 6일, 10일, 14일 의 시간 점을 분석했습니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 NTA에 의해 입자 연구를 위해 저장된 PBS를 분석합니다. 참고: PBS의 입자 농도는 시간이 지남에 따라 EV 릴리스 프로파일을 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생체 적합성 연구 참고: 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(hUC-MSC)는 기관 가이드라인에 따라 IdISBa 바이오뱅크로부터 수득된다.<ol>
<li>사용 전까지 20%의 FBS로 보충된 DMEM 저혈당에서 hUC-MSC를 유지하십시오. 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.</li>
		<li>세포 파종의 경우, PBS의 5mL로 플라스크에서 셀을 두 번 세척하십시오.</li>
		<li>트립신 솔루션의 1 mL을 추가하여 hUC-MSC를 트립시니즈합니다. 세포의 단층이 완전히 커버되는지 확인합니다. 트립신 용액을 제거하고 세포 배양 플라스크를 37°C에서 약 2분 동안 배치합니다. 현미경의 밑에 세포 분리를 봅니다. 분리된 셀은 둥근 모양으로 나타나며 서스펜션에 있을 것입니다.</li>
		<li>1% 전기 자동차고갈고갈기 FBS와 DMEM 낮은 포도당에서 세포를 다시 중단합니다. 참고: 1% FBS로 보충된 미디어를 준비한 다음 18h에 120,000 x g 의 초원심분리기를 준비하여 FBS-EV를 제거합니다. 혈소판 EV와의 간섭을 피하기 위해 전기 를 제거하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>Neubauer 챔버를 가진 세포의 수를 계산하여 세포 농도를 결정14.</li>
		<li>hUC-MSC를 50,000세포/mL 농도로 가져옵니다.</li>
		<li>세포 용액의 200 μL을 Ti 임플란트에 시드합니다.</li>
		<li>48h 후, 50 μL의 매체를 수집하고 제조업체의 프로토콜에 따라 젖산 탈수소효소(LDH) 활동 키트를 사용하여 세포독성 측정을 수행한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Torreggiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+novel+effectors+of+human+platelet+lysate+activity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity.</a> European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 TI 표면에 EV 기능화에 대한 명확한 지침을 제공하는 것을 목표로합니다. 제시된 방법은 기능화의 물리작용 형인 낙하 주조 전략을 기반으로 한다. Ti 표면에 대한 EV 기능화에 관한 불쌍한 참고 문헌이 존재하지만 Ti10에서 EV를 고정하여 다른 이점을 보여주는 연구는 거의 없습니다. 어쨌든, 탐구된 전략의 몇몇은 생화학적 결합8, 중합체 함정9 또는 드롭 주조10을 포함합니다. 공유 결합을 통한 화학 코팅의 사용은 더 높은 등급의 기능화로 보다 균일한 코팅을 달성할 수 있지만 화학 반응은 EV 구조 및 기능에 해를 끼칠 수 있습니다15. 낙하 주조는 중합체 함정 또는 생화학 적 결합에 비해 쉽고 저렴한 방법입니다.
해결할 수 있는 프로토콜의 한 가지 ...

전기자동차는 모든 세포에 의해 분비되는 멤브레인 소포(30-200 nm)이며 화물을 전달함으로써 세포 간 통신에서 중요한 역할을 한다. 그(것)들은 핵산, 성장 인자, 또는 생리활성 지질1을 포함할 수 있는 액티브한 생체 분자의 각종을 포함합니다. 이러한 이유로, EV치료에서 그들의 잠재적인 사용에 대 한 평가 되었습니다. 정형 외과 및 뼈 재생의 관점에서, 다른 소스에서 전기 테스트 되었습니다. 그 중에서도 혈소판 유래 전기는 낮은 세포독성 프로파일2,3을 유지하면서 줄기 세포에 대한 분화 효과를 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 매일 임상 실습에서 이를 사용하기 위해서는 전기자동차와 생체재료의 결합 가능성을 탐구하기 위한 추가 연구가 필요하다.
티타늄 기반 생체 재료는 기계적 특성, 높은 생체 적합성 및 장기 내구성으로 인해 뼈 치유 임상 개입을위한 발판으로 널리 사용됩니다4. 그럼에도 불구하고, Ti 임플란트는 생물활성 물질이므로 주변 뼈 조직5와 결합할 수 있는 능력이 좋지 않습니다. 이러한 이유로, 티타늄 수정은 표면에 보다 기능적인 마이크로 환경을 달성하여 성능을 향상시키기 위해 연구되고있다4,6,7. 이러한 의미에서, 전기자동차는 화학8 또는 물리적 상호작용에 의해 티타늄에 고정될 수 있다9,10. 줄기 세포 또는 대식세포로부터 유래된 고정된 전기는 세포 접착 및 증식을 촉진하여 Ti의 생체 활성을 향상시켜 골성 효과를 유도합니다8,9,10.
이 문서는 PL 유래 EV로 Ti 표면을 코팅하기위한 드롭 캐스팅 전략에 중점을 둡니다. 또한, 우리는 시간이 지남에 따라 코팅 된 표면에서 EV 방출 프로파일을 평가하고 체외에서 세포 생체 적합성을 확인합니다.

<table><tbody><tr><td>0,8 &마이크로; m 주사기 필터</td><td>Sartorius</td><td>16592K</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 원심분리기 튜브</td><td>SPL 생명 과학</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 배양 플레이트</td><td>SPL 생명 과학</td><td>PLC30096</td><td></td></tr><tr><td>Absolut 에탄올</td><td>Scharlau</td><td>ET0006005P</td><td>Milli-Q&reg; 물 AKTA로 20%&nbsp; 에탄올을 준비하는 데 사용됩니다</td></tr>.<tr><td> 정수기 시스템</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-0014</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-15R 원심분리기</td><td>Beckman Coutler</td><td>392934</td><td>SX4750A 스윙 로터</td></tr><tr><td>원심분리기 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11 로터</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 원뿔형 바닥, 50ml</td><td>SPL 생명 과학</td><td>PLC50050</td><td></td></tr><tr><td>세포 독성 검출 키트(LDH)</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>일회용 주사기 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>BDH307736</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 저포도당 Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>21885025</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS (1x)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS) Embrionic 인증</td><td>GIBCO</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 &micro; m 주사기 필터</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep&nbsp; 16/60 세포크릴&nbsp; S-400 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9356-04</td><td>프리캐스트 컬럼</td></tr><tr><td>인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(hUC-MSC)</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 분광 광도계</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 나노입자 추적 분석</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td>&lambda;= 532nm에서 내장 레이저 및 카메라 sCMOS</td></tr><tr><td>가 있는 장치니들</td><td>테루모</td><td>946077135</td><td></td></tr><tr><td>질산 69,5%</td><td>Scharlau</td><td>AC16071000</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>8043-30-1124</td><td>SW-32Ti 로터</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액 100X</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>pH 테스트 스트립 4.5-10.0</td><td>Sigma</td><td>P-4536</td><td></td></tr><tr><td>혈소판 용해물(PL)</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td> 헌<td>혈 후 버려진 버피 코트</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 원심분리기 통</td><td>Beckman Coutler</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Power wave HT</td><td>BioTek</td><td>10340763</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap tube, 15 ml, (Lx&Oslash;): 120 x 17 mm, PP, 인쇄</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hidroxide</td><td>Sharlau</td><td>SO04251000</td><td></td></tr><tr><td>티타늄 임플란트 복제품</td><td>임플란트 미디어, SA</td><td>NA</td><td>티타늄 등급 IV. 직경 : 6,2 mm. 높이 : 1,95 mm</td></tr><tr><td>트립신 -EDTA 1 X</td><td>Biowest</td><td>L0930</td><td></td></tr><tr><td>Tryton X100</td><td>시그마</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

티 임플란트의 혈소판 유래 세포 외 소포 기능화

Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants

세포 외 소포 (EV)는 세포 통신에서 중요한 역할을 하는 생물학적 나노 채소입니다. 그들의 함량은 재생 의학에 있는 중대한 잠재력을 제시하는 단백질 과 핵산과 같은 적극적인 생체 분자를 포함합니다. 최근에는 혈소판 리사테(PL)에서 추출한 전기자동차가 PL에 필적하는 골성 능력을 보여주었다. 게다가, 생체 재료는 정형 외과 또는 치과 복원에 자주 사용됩니다. 여기서는 골성 특성을 향상시키기 위해 PL 유래 EV로 Ti 표면을 기능화하는 방법을 제공합니다.
EV는 크기 제외 크로마토그래피에 의해 PL에서 분리되며, 그 후 Ti 표면은 드롭 캐스팅에 의해 PL-EV로 기능화됩니다. 기능화는 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출 분석서에 의해 EV 방출 및 생체 적합성에 의해 입증된다.

이 문서에 제시된 방법을 사용하면 기능성 티타늄 디스크를 사용하여 EV를 얻을 수 있습니다. 전기 자동차는 물리적으로 표면에 결합되어 시간이 지남에 따라 지속적인 방출을 허용합니다. 방출되는 전기자동차의 양은 2일, 6, 10 및 14일에 NTA로 측정할 수 있다. 첫 번째 측정, 2 일에, 약 109 EV가 출시 되는 것을 보여, 6 일에 지속적인 출시 다음 (~108 EV); 10일(~107EV ), 14일차(~107EV ). 이는 시간이 지남에 따라 출시된 EV의 양이 감소했음에도 불구하고 지속적인 릴리스를 확인합니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62781/62781fig03.jpg"> 그림 3<stro...

여기서, 우리는 혈소판 용해 (PL)에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 티타늄(Ti) 임플란트 표면코팅에 대한 이들의 사용에 대한 방법을 제시한다. 우리는 낙하 주조 코팅 방법, 표면에서 의 EV 방출 프로파일, 그리고 티 표면 코팅 된 전기 EV의 생체 내 생체 적합성을 설명합니다.

Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...

생물 재료와 세포 외 소포 조합은 재생 의학 연구에 대 한 바람직한 접근. 따라서, 이 연구는 정형 외과 및 뼈 재생을위한 실용적인 도구로 전기 EV와 티타늄 기능화를보고합니다. 낙하 주조 기능화는 중합체 함정 또는 생화학 적 결합과 같은 다른 전략에 비해 쉽고 저렴한 방법입니다.유리 비커에 산화된 물로 티타늄 디스크를 세척하여 티타늄 표면 기능화를 시작합니다. 그런 다음 70 %의 에탄올로 디스크를 세척하기 전에 물을 버립니다. 50°C에서 5분간 세척된 임플란트를 분해하는 용액을 탈온화된 물에서 5분간 초음파 처리합니다.수중 나트륨 용액을 50C에서 10분 동안 50C의 40% 나트륨 용액에 물을 인큐베이션한 후, 소화된 물에 임플란트를 초음파 처리한 후 입증된 바와 같이 분해된 물에 임플란트를 초음파 처리합니다. 다음으로, 산화된 물로 임플란트의 적어도 5개의 세동을 수행합니다. pH가 pH 표시기에서 중립적일 때까지.앞서 설명한 바와 같이 수산화나트륨을 50%의 질산으로 대체하여 초음파 처리 및 배양 과정을 반복합니다. 임플란트를 70% 에탄올 용액에 저장하기 전에 분해된 물로 세척 및 초음파 처리를 수행합니다. 티타늄 임플란트를 30% 질산 용액에 30% 생동감있는 반교로 실내 온도에서 30분간 배양합니다.배양 후 pH가 pH 지표에서 중립적일 때까지 탈온화된 물로 적어도 5개의 세하를 수행합니다. 그런 다음 티타늄 임플란트를 탈온화 된 물의 실온에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 10 분 동안 40 C에서 진공 상태에서 임플란트를 건조시.세포 배양 캐비닛 에서 작업, 기계 측을 향하고 96 잘 접시에 티타늄 임플란트를 배치합니다. 해빙 EV 솔루션에 의한 세포외 소포 EV 드롭 주조, 3초 의 펄스에서 소용돌이 용액을 준비합니다. 혼합 후, 나노 입자 추적 분석에 의해 결정된 농도에 따라, 임플란트 당 최대 4 x 10^11 EV를 고정하기 위해 티타늄 표면에 전기 용액40 마이크로리터를 증착한다.다음으로, 플레이트를 진공 상태 인 37 C에서 약 2 시간 동안 또는 방울이 완전히 건조 할 때까지 놓습니다. 진공 챔버에 존재하는 티타늄 임플란트의 수와 물에 따라 건조 시간을 조정합니다. 티타늄 디스크에서 방출되는 전기 의 양은 나노 입자 추적 분석에 의해 측정되었다.2일에는 약 10^9대의 EV가 출시되었고, 6일, 10일, 14일에는 지속적인 출시가 진행되었습니다. 티타늄 EV의 체외 세포 생체 적합성은 젖산 탈수소 효소 또는 LDH 방출 분석으로 평가되었으며, 세포가 임플란트에 파종된 후 48시간 후에. 티타늄 전기자동차는 최대 허용된 세포독성 값보다 LDH의 양이 더 낮았다.반면, 티타늄 대조군은 LDH 활동 수준을 높게 나타냈다. 가장 중요한 단계는 코팅 된 임플란트의 진공 건조입니다. 최적의 물리 흡수를 얻기 위해 모든 물이 증발되는지 확인하는 것이 중요합니다.

platelet-derived-extracellular-vesicle-functionalization-ti

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

혈액 - 문의 autologous 세포 및 시험 biocompatibility과 biomaterials 것은 시딩의 티타늄에 대한 방법을 설명합니다. 이 방법은 돼지의 venae cavae에 주입 수술의 분 이내에 씨앗 내피 전구 세포와 티타늄 튜브를 사용합니다. 이 기술은 다른 많은 implantable 생명 의학 장치에 적용할 수 있습니다.

Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

이 비디오에서는, 우리는 그들의 기능을 개선하고 세포의 이동을 제어하는​​ 다공성 금속 임플란트에 대한 수정 방법을 보여줍니다. 기술은 3D 및 기저막의 생산은 2-D에서 세포의 움직임을 제어하는​​ 모방에서 세포의 움직임을 제어하는​​ 기공 그라디언트의 개발을 포함한다. 또한, 혈액 단백질의 분석을 통해 생체의 모니터링 임플란트 통합을위한 HPLC 기반 방법이 설명되어 있습니다.

모공 그라디언트, 고분자 전해질 및 그들의 간접적 인 모니터링과 금속 임플란트의 멀티 스케일 변경<em&gt; 생체 내</em

생체 활성 및 기계적으로 신뢰할 수 있는 금속 골격은 다공성 Ti 제조를 위한 동적 동결 주조와 Ti 골격의 코팅 및 치밀화의 두 가지 공정으로 구성된 방법을 통해 제작되었습니다. 밀집화 공정은 간단하고 효과적이며 기능적으로 등급이 매겨진 골격 제작에 적용할 수 있습니다.

바이오 메디컬 응용 프로그램을위한 기계적 조정 및 생리 활성 금속 비계의 제조

세포 접착성은 생체 재료 연구 및 조직 공학의 많은 접근 방식에서 핵심입니다. 펩타이드를 함유한 중요한 고분자 PTFE의 표면 개질을 위해 습식 화학을 사용하여 단계별 기술을 제시합니다.

향상된 세포 접착 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 젖은 화학 및 펩티드 고정화

여기에서는 불투명 티타늄 지지체에 세포 생존을 검출뿐만 아니라, 골격 불순물 일별을 검출하는 형광 기반 이미징 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 비 투명 지지체에 세포 세포 또는 세포 상호 작용 금속을 묘화의 결점이 문제를 해결합니다.

비 투명 공사장 공중 발판에 이미징 세포 생존 - 소설 니트 티타늄 임플란트의 예를 사용하여

여기에 제시된 펩티드 CD47(pepCD47)을 다비스포산 화학을 이용한 금속 스텐트에 대한 프로토콜이 제시된다. pepCD47을 사용하여 금속 스텐트의 기능화는 염증 세포의 부착 및 활성화를 방지하므로 생체 적합성을 향상시키게 합니다.

CD47 유래 펩타이드 고정화를 통해 금속 임플란트에 대한 혈액 매개 세포 부착 완화

본 프로토콜은 가스 증착 및 수용액 반응을 통한 표면 개질을 위한 처리 동안 실리콘 평면 피질 내 미세전극을 취급하기 위한 도구를 기술한다. 절차 전반에 걸쳐 장치를 처리하는 데 사용되는 구성 요소의 어셈블리가 자세히 설명되어 있습니다.

실리콘 평면 피질 내 미세 전극의 표면 처리를위한 도구

여기 작은 분자와 단백질과 패턴 기판의 patterning 산화물 무료 실리콘과 게르마늄 반응 유기 monolayers과 입증 작용화에 대한 간단한 방법을 설명합니다. 접근 방식은 완전히, 화학 산화로부터 표면을 보호 기능 형태를 통해 정확한 컨트롤을 제공하며, 화학적으로 차별 패턴을 준비 액세스를 제공합니다.

소프트 리소그래피 작용화 및 Patterning 산화물없는 실리콘과 게르마늄

이 문서에서는 높은 처리량 방법은 항원 제시 세포의 특정 수용체​​를 타겟에 더 이상 사용할 수 polyanhydride의 nanoparticles의 표면에 oligosaccharides과 첨부 파일의 합성을 위해 제공됩니다.

Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

Graphene은 생물 의학 임플란트의 코팅 소재로 가능성을 제공합니다. 이 연구에서 우리는 graphene의 나노 미터 두께의 레이어 코팅 nitinol 합금하는 방법을 설명하고 graphene은 임플란트 응답에 영향을 미칠 수 있는지 결정합니다.

생명을 주입 Graphene 코팅

학습하세요 혈소판 유래 세포 외 소포를 이용한 티타늄 임플란트 표면 기능화 방법을. 드롭 캐스팅 기법으로 저비용 생체재료 코팅이 가능하며, 재생의학 및 정형외학 적용에 효과적입니다.

티 임플란트의 혈소판 유래 세포 외 소포 기능화

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