유동 세포측정에 의한 품질 제어 가래 분석

이 프로토콜은 고처리량 임상 진단 목적을 위해 과거에 유동 세포측정과 함께 사용하기 어렵게 만든 가래 처리로 경험된 일반적인 과제를 해결합니다. 이 프로토콜은 가래 중량을 사용하여 항체 및 염색 부피를 결정함으로써 시간을 절약하도록 설계되었습니다. 염색 인큐베이션 동안 다운스트림 단계에 대해 셀 수를 수행할 수 있습니다.

정확한 셀 카운트를 달성하여 정확한 재서스펜션 부피를 결정하여 유동 세포계에서 실행할 때 문제를 방지하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 폐 건강을 조사하는 연구 분야에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 예를 들면, COPD, 천식, 폐암, 또는 COVID의 효력과 같은 질병은 공부될 수 있었습니다.

절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 개발 과학자 인 마이클 라이 박사가 될 것입니다. 시작하려면 가래 시료를 계량하여 해리 시약의 양을 결정합니다. 가래 중량을 기준으로 적절한 크기의 용기에 샘플을 옮은 다음 0.5%NAC의 그램당 1밀리리터와 0.1%DTT의 그램당 4밀리리터를 추가합니다.

샘플을 최대 속도로 15초 동안 소용돌이치며 실온에서 15분 동안 최대 속도로 바위를 휘감습니다. 이 샘플을 4X 행크스 균형 잡힌 염용액 또는 HBSS로 희석하여 NAC 및 DTT를 중화시합니다. 그리고 빠른 소용돌이 후, 5 분 동안 실온에서 샘플을 바위.

100 마이크로미터 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 하나 이상의 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 필터링하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다. 세포를 아래로 펠릿. 상체를 심은 후, 15 밀리리터 원뿔 관에 펠릿을 결합하고 동일한 조건에서 HBSS로 세척하십시오.

가래 샘플의 초기 중량에 의해 결정된 버퍼의 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포 현탁액에서 알리쿼시를 가져 와서 가래 희석의 10 마이크로 리터를 0.4 % 트라이팬 블루의 30 마이크로 리터와 혼합 한 다음 살아있는 / 죽은 세포 수를 위해 혈류계의 카운팅 챔버에 적재하십시오. 보상 튜브의 라벨 가래.

텍스트에 표시된 바와 같이 각 가래 세포 관 및 보상 튜브에 HBSS 항체 및 염료를 추가합니다. 가래 세포를 분석 튜브에 추가하고 텍스트에 언급 된 바와 같이 보상 구슬을 보상 튜브에 추가합니다. 35분 동안 빛으로부터 보호되는 얼음에 있는 모든 튜브를 배양합니다.

그런 다음 얼음 차가운 HBSS로 튜브를 채운 후, 원심분리기는 섭씨 4도에서 10분 동안 800회 G.For 보정 튜브를 위해, 펠릿에 가깝게 슈퍼네티얼을 흡인하고 펠릿을 플러플하여 풀기 위해 움직입니다. 다음으로, 0.5 밀리리터의 차가운 HBSS를 보상 튜브에 추가하고 유동 세포 측정 분석에 필요할 때까지 얼음에 튜브를 저장합니다. 그런 다음 가래, 동종형, 혈액 및 상피 튜브에서 상류체를 흡인시합니다.

튜브를 가볍게 하여 펠릿을 풀어줍니다. 얼룩이 없는 및 동종형 튜브에 1%PFA의 밀리리터 2개와 혈액 및 상피 튜브에 10 밀리리터를 추가합니다. 30분 동안 얼음에 튜브를 배양한 다음, 최대 속도로 빠르게 소용돌이를 타고 다시 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 얼음 차가운 HBSS로 튜브를 채웁니다. 다음으로, 1, 600배 G.Aspirate에서 10분 동안 4도에서 튜브를 원심분리하고 손가락으로 튜브를 쓸어서 세포를 풀어주면, 얼룩이 없는 및 동형 튜브에 200 마이크로리터를 추가합니다. 총 세포 수에 따라 혈액 및 상피 관의 재발을 위해 HBSS의 필요한 부피를 계산하고 추가합니다.

유동 세포 측정 분석이 수행될 때까지 얼음의 빛으로부터 보호되는 보상 튜브에 모든 샘플을 저장합니다. 사용되는 흐름 사이토미터에 적합한 시작 절차를 적용합니다. 국립 표준 기술 연구소 또는 NIST 구슬의 혼합물을 사용하여 구슬을 축에 너무 가깝게 두지 않고 NIST 구슬을 배치하도록 전방 분산 및 측면 산란 전압이 설정되어 있는지 확인합니다.

Navios EX의 경우 LSRII 또는 높음의 유량을 중간크기로 설정합니다. 분산 및 형광 파라미터에 사용되는 각 매개 변수에 대한 전압을 조정하여 세포 모집단을 스케일로 배치합니다. 게이팅 전략과 함께 수치를 사용하여 전압을 조정하는 지침으로 사용합니다. 먼저 얼룩이 없는 가래 샘플에 대한 데이터를 획득한 다음 동형 염색 샘플, 그리고 혈액 관 및 상피 튜브를 채취한다음 한다.

가래 중량은 염색을 위한 항체 또는 염료 부피를 결정하기 위하여 이용되었습니다. 가래 중량과 세포 수율 사이의 상관 관계는 강하지 않았습니다. 가래 샘플은 세포 수율분포에 클러스터된 4개의 중량 범주로 나뉘었다.

사용된 각 항체는 가장 높은 염색 지수를 가진 고원 상상에 대한 농도에서 적정화되어 작업 농도로 선택되었다. 모든 중량 범주에서, 평균 SEC 오염은 실행 가능한 세포의 백분율로 20% 미만이었습니다. 제시는 분석에 사용되는 게이팅 전략입니다.

NIST 구슬은 이물질을 제거하기 위해 가래 샘플에 적용 된 게이트를 설정하는 데 사용되었다. 폭 게이트에 의해 작은 파편이 더 제거되었습니다. 생존 염료는 죽은 세포를 제거하는 데 사용되었으며, 단일 게이트는 이중을 제거했습니다.

항 CD45 항체 라벨링은 살아있는 단일 가래 세포를 혈액 세포 및 비 혈액 세포 구획으로 분리할 수 있었습니다. Navios EX, LSRII 및 가사에서 얻은 프로파일을 비교했습니다. 파편, 죽은 세포, 이중 및 혈액 및 비 혈액 프로파일을 비교하기위한 게이팅 전략이 표시됩니다.

이 기술은 우리가 비 침습적 임상 시험으로 사용하기 위한 폐암 리스크를 검출하기 위하여 이 방법을 적용하는 것을 허용했습니다.