체외(In Vitro ) Differentiation of Human Dendritic Cells and their Markers in Leishmania Infection(리슈마니아 감염에서 인간 수지상 세포와 그 마커의 분화)

요약

수지상 세포(DC)는 리슈마니아 감염에 대한 선천성 면역의 필수 구성 요소입니다. DC와 리슈마니아 사이의 복잡한 상호 작용의 기저에 있는 메커니즘은 잘 이해되지 않은 상태로 남아 있습니다. 여기에서는 리슈마니아 감염이 이동 관련 및 공동 자극 분자 발현과 같은 인간 DC의 면역생물학적 기능에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 방법을 설명합니다.

초록

리슈마니아증은 의무적인 세포 내 원생동물인 리슈마 니아의 감염과 관련된 임상 증상의 집합체로 구성됩니다. 리슈마니아 기생충의 생활사는 두 개의 교대 생애 단계(amastigotes 및 promastigotes)로 구성되며, 이 기간 동안 기생충은 각각 절지동물 매개체 또는 척추동물 숙주 내에 거주합니다. 특히 리슈마니아 기생충과 면역 체계의 여러 세포 사이의 복잡한 상호 작용이 감염 결과에 큰 영향을 미칩니다. 중요한 것은 대식세포가 리슈마니아 복제의 주요 숙주 틈새 시장으로 알려져 있지만, 기생충은 호중구 및 수지상 세포(DC)와 같은 다른 선천성 면역 세포에 의해서도 식세포화된다는 것입니다.

DC는 선천성 면역 및 적응 면역 가지를 연결하는 데 중요한 역할을 하여 광범위한 병원체에 대한 면역 반응을 조율합니다. 리슈마니아 와 DC가 상호 작용하는 메커니즘은 불분명하며 병원체 포획, DC 성숙 및 활성화의 역학, 배액 림프절(dLN)로의 DC 이동, T 세포에 대한 항원 제시 등의 측면을 포함합니다. 많은 연구에서 DC가 리슈마니아에 대한 면역 반응을 조절하는 데 이중 역할을 한다는 개념을 뒷받침하고 있지만, 리슈마니아 에 대한 감수성 또는 저항에 대한 이러한 세포의 참여는 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 감염 후, DC는 공동 자극 분자(즉, CD40, CD80 및 CD86) 외에도 표면 주요 조직 적합성 복합체(MHC) II의 상향 조절과 관련된 성숙 과정을 거칩니다.

감염 결과에서 DC의 역할을 이해하는 것은 리슈마니아에 대한 면역 반응을 조절하기 위한 치료 및 예방 전략을 개발하는 데 중요합니다. 이 논문은 리슈마니아-DC 상호 작용의 특성화 방법을 설명합니다. 이 상세한 프로토콜은 DC 분화, 세포 표면 분자의 특성화 및 감염 프로토콜 단계 전반에 걸쳐 지침을 제공하여 과학자들이 리슈마니아 감염에 대한 DC 반응을 조사하고 감염 과정에서 이러한 세포가 수행하는 역할에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다.

서론

리슈 마니아 증은 리슈 마 니아 속¹의 다른 종에 의해 유발되는 방치 된 질병의 복합체를 구성합니다. 리슈마니아(Leishmania )는 트리파노소마티과(Trypanosomatidae)의 세포 내 원생동물로 인간과 다른 포유류를 감염시켜 피부 병변에서 내장 형태에 이르기까지 다양한 질병을 유발합니다². 이 질병의 주요 임상 증상은 피막성 리슈마니아증(TL)과 내장 리슈마니아증(VL)입니다. 세계보건기구(WHO)는 매년 700,000명에서 100만 명의 새로운 감염 사례가 발생하여 매년 70,000명이 사망하는 것으로 추정합니다². 전 세계적으로 리슈마니아증은 약 1,200만 명에서 1,500만 명에게 영향을 미치며, 3억 5,000만 명이 이 질병에 걸릴 위험에 처해 있습니다³.

Leishmania 속은 promastigote와 amastigote⁴의 두 가지 진화 형태를 나타냅니다. Leishmania pr....

프로토콜

참고: 세포는 건강한 기증자 지원자로부터 얻었습니다. 여기에 설명된 절차는 국가 윤리 위원회(번호 2.751.345)-Fiocruz, Bahia, Brazil)의 승인을 받았습니다.

1. 인간 수지상 세포의 분화

1. 50mL 원뿔형 튜브에 10mL의 폴리수크로오스-나트륨 트리아조에이트 혼합물을 피펫팅합니다.
2. 각 기증자에 대해 각각 50mL 원뿔형 튜브에 라벨을 붙입니다.
3. 건강한 헌혈자로부터 30mL의 혈액을 수집하고 층류 후드에서 모든 후속 단계를 수행합니다.
4. 혈액을 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮기고 실온에서 1:1의 비율로 식염수(0.9% 염화나트륨)에 혈액을 희석합니다.
5. 천천히 희석된 혈액을 튜브의 폴리수크로오스-나트륨 트리아조에이트 혼합물에 오버레이합니다(단계 1.1). 튜브를 400 × g 에서 25 ° C에서 30 분 동안 한 번 원심 분리하십시오.
   알림: 그라디언트 레이어의 혼합을 방지하기 위해 원심분리 전에 브레이크를 끄십시오. 첫 번째 원심분리 후 원심분리기의 온도를 4°C로 낮춥니다.
6. 원심분리기에서 튜브를 조심스....

결과

이 보고서는 유세포 분석 및 컨포칼 현미경을 사용하여 리슈마니아 감염에서 DC의 역할을 조사합니다. 초기에는 인간 단핵구 유래 DC의 표현형 프로파일이 확립되었습니다. 특히, 얻어진 CD11c⁺ 수지상 세포 집단은 CCR7, CD209, CD80, CD1a 및 HLA-DR에 대해 양성이었습니다. 결과는 DC 집단에서 이러한 마커의 발현이 리슈마니아 감염에 의해 큰 영향을 받는다는 것을 나타냅니다. 감염된 DC는 증강된 CD80, CD209, CCR7 및 HLA-DR 발현을 보였습니다. 그러나 CD1a의 하향 조절은 L .amazonensis에 감염된 DC에서도 관찰되었습니다. 또한 주성분 분석을 통해 이러한 분자의 발현에 상당한 차이가 있는 것으로 나타났습니다(그림 1B-D). 차원 축소 기법인 t-Distributed Stochastic Neigh.......

토론

리슈마니아증은 전 세계적으로 심각한 공중 보건 문제입니다. 이 질병의 발병 기전은 매우 복잡하며, 척추동물 숙주에서 기생충의 생존을 촉진하는 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵다¹⁷. DC는 여과 및 림프 기관을 포함하여 몸 전체에서 발견되는 전문 항원 제시 세포입니다. 항원 포획 및 처리 후, 미성숙 DC는 림프절로 이동하는 복잡한 성숙 과정을 거치며, 림프절로 이동하는 이 세포는 T 림프구에 항원을 제시하는 역할을 합니다¹⁸. 이 성숙 과정은 증가된 MHC-class II 분자 발현, 특히 CD11c, CD86, CD80 및 CD1a¹⁹를 특징으로 합니다. 리슈마니아증(leishmaniasis)에서는 단핵구 유래 DC가 식세포(phagocytose) 기생충을 식세포로 전달하고 화물을 dLN으로 전달하여 T세포에 항원 발현을 유도한다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안티 CCR7	온도
안티 CD209	이소파마
안티 CD83	라이카 SP8
안티 HLA-DR	Gibco
소 혈청 알부민	Thermo	A2153-100G	, 시그마
Ciprofloxacin,	Gibco
컨포칼 현미경	Thermo Fisher Scientific
Fetal bovine serum	Gibco
Flow Jo	Thermo Fisher Scientific
겐타마이신	Thermo Fisher Scientific
글루타민	Gibco
HEPES	Thermo Fisher Scientific
팔로이딘	Thermo Fisher Scientific
인산염 완충 용액	Peprotech
prolong gold antifade kit	BD pharmigen
RPMI	BD pharmigen
Saponin	BD pharmigen	47036 – 50G – F	시그마
슈나이더의 곤충 배지	소프트웨어 BD biosciences

, , , , , , ,