Name: 전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 학습하세요 조직 투명화 및 라이트시트 현미경을 활용한 전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징 방법. 이 기술은 3차원 조직 구조를 보존하며 고해상도 심장 조직 재구성을 가능하게 합니다.

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이 프로젝트는 보조금 계약 No 952166 (REPAIR), FISR 프로그램에 따른 MUR, 프로젝트 FISR2019_00320 및 Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE 프로젝트에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 지원 받았습니다.

모든 동물 취급 및 절차는 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 의회의 지침 2010/63/EU의 지침에 따라 수행되었으며 이탈리아 보건부의 원칙 및 규정을 준수했습니다. 실험 프로토콜은 이탈리아 보건부 (프로토콜 번호 647/2015-PR)의 승인을 받았습니다. 모든 동물은 이탈리아 ENVIGO에서 제공하였다. 이들 실험을 위해, 생후 6개월의 수컷 C57BL/6J 마우스 5마리를 사용하였다.
1. 용액 준비
<ol><li>화학 후드의 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.6)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다. 4% PFA 분취량을 -20°C에서 몇 개월 동안 보관하십시오.</li>
	<li>하이드로겔 용액 준비: 화학 후드에서 0.01M PBS에 4% 아크릴아미드, 0.05% 비스-아크릴아미드, 0.25% 개시제 AV-044를 혼합합니다. 전체 준비 기간 동안 시약과 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 하이드로겔 분취량을 -20°C에서 수개월 동안 보관한다.</li>
	<li>클리어링 용액 준비: 탈이온수에 200mM 붕산, 4% 나트륨 도데실-설페이트(SDS)를 혼합합니다. 화학 후드에서 pH 8.6. SDS 침전을 피하기 위해 용액을 21-37 ° C 사이에 보관하십시오.</li>
	<li>실험 당일에 신선한 티로드 용액을 준비하십시오 : 10 mM 포도당, 10 mM 헤페스, 113 mM NaCl, 1.2 mMMgCl2 및 4.7 mM KCl을 첨가하고; 1 M NaOH를 사용하여 pH 7.4로 적정합니다.</li>
</ol>2. 심장 격리
<ol><li>심장 격리 절차 30 분 전에 500 I.U. 헤파린 0.1mL를 피하 주사하십시오.</li>
	<li>30mL 주사기와 6cm 페트리 접시 3개를 신선한 Tyrode 용액으로 채웁니다. 페트리 접시 중 하나의 경계에 작은 균열 (깊이 3-4mm)을 만들어 입체 현미경 아래에 놓습니다.</li>
	<li>직경 1mm의 캐뉼러를 주사기에 고정하고 페트리 접시의 균열에 삽입합니다. 주사기에 기포가 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>20mL 주사기에 4% PFA를 채우고 화학 후드에 보관하십시오. 후드 아래에 빈 페트리 접시를 준비하십시오.</li>
	<li>마우스를 1.0L/min의 유속으로 3% 이소플루란/산소로 마취시키고 시행 중인 동물 복지 규칙에 따라 경추 탈구로 희생합니다.</li>
	<li>희생 후 가슴 위의 모피를 제거하고 가슴을 열어 심장에 완전히 접근 할 수 있습니다.</li>
	<li>심장을 분리하고 이전에 50mL의 Tyrode 용액으로 채워진 페트리 접시에 담그십시오. 수술용 가위를 사용하여 대동맥궁 바로 근처의 대동맥을 절단하여 심장을 노출시킵니다.</li>
	<li>입체 현미경으로 심장을 옮기고 조심스럽게 캐뉼러를 수행하십시오. 조직 손상을 피하기 위해 캐뉼러를 대동맥에 너무 깊숙이 삽입하지 마십시오 (2mm 이하).</li>
	<li>작은 클램프와 봉합사 (크기 5/0)를 사용하여 심장을 캐뉼라에 고정하십시오.</li>
	<li>혈관에서 혈액을 제거하기 위해 10mL/분의 일정한 압력으로 30mL의 Tyrode 용액으로 심장을 관류합니다.</li>
	<li>주사기에서 캐뉼러를 분리하고 Tyrode 용액으로 채워진 페트리 접시에 심장을 넣으십시오. 캐뉼러에 기포가 생기지 않도록주의하십시오. 그렇지 않으면 기포를 올바르게 제거하십시오.</li>
	<li>차가운 20 % PFA로 채워진 4mL 주사기를 캐뉼라에 부착하고 동일한 일정한 압력으로 심장을 관류하십시오.</li>
	<li>심장을 4% PFA 10mL에 넣고 4°C에서 밤새 배양합니다(O/N). 조직 분해를 방지하려면 가능한 한 최단 시간에 2.6-2.13 단계를 수행하십시오.</li>
</ol>3. 심장 청소
<ol><li>다음날, 심장을 0.01 M PBS로 4°C에서 15분 동안 3회 세척하였다. 알림: 이 단계 후에 심장을 PBS + 0.01% 아지드화나트륨(NaN3)에 4°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>심장을 30 mL의 하이드로겔 용액에 4°C에서 흔들어(15 rpm)하여 3일 동안 배양한다.</li>
	<li>건조기, 진공 펌프 및 건조기를 펌프와 질소 파이프라인 모두에 연결하는 튜브 시스템을 사용하여 실온에서 샘플을 탈기합니다.<ol><li>샘플을 건조기에 넣고 바이알을 열고 캡을 유지합니다.</li>
		<li>건조기를 닫고 질소 파이프 라인을 열어 튜브에서 산소를 제거하십시오.</li>
		<li>진공 펌프를 켜서 건조기에서 산소를 10분 동안 제거합니다.</li>
		<li>펌프를 끄고 건조기의 손잡이를 사용하여 질소 파이프 라인을 엽니 다. 압력이 대기압과 같으면 건조기를 조심스럽게 열고 바이알을 빠르게 닫으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>탈기된 하이드로겔 용액에 심장을 37°C에서 3시간 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>하이드로겔이 적절하게 중합되어 완전히 젤라틴처럼 보이면 조심스럽게 심장을 제거하고 샘플 홀더에 넣습니다.</li>
	<li>클리어링 챔버 중 하나에 심장이 있는 샘플 홀더를 삽입하고 클리어링 용액의 누출을 방지하기 위해 적절하게 닫습니다.</li>
	<li>클리어링 용액 용기가 놓인 수조와 연동 펌프를 켜서 클리어링 용액의 재순환을 시작합니다.</li>
	<li>정화 절차를 가속화하기 위해 일주일에 한 번 컨테이너의 클리어링 용액을 변경하십시오.</li>
</ol>4. 세포막 염색
<ol><li>심장이 완전히 정화된 것처럼 보이면 샘플 홀더에서 심장을 제거하고 예열된 PBS 50mL로 24시간 동안 세척합니다. 50mL의 PBS + 1%의 트리톤-X(PBS-T 1x)에서 24시간 동안 다시 세척합니다.</li>
	<li>샘플을 0.01 mg/mL 밀 배아 응집소(WGA) - 알렉사 플루오르 633 중 3 mL의 PBS-T 1x 중 7일 동안 실온에서 진탕(50rpm)하여 배양합니다.</li>
	<li>7일 배양 후, 샘플을 실온에서 1x 50 mL의 PBS-T 24 h 동안 진탕하여 세척하였다.</li>
	<li>샘플을 4% PFA에서 15분 동안 배양한 다음, PBS에서 각각 5분 동안 3회 세척한다. 알림: 이 단계 후에 심장을 PBS + 0.01% NaN3에 4°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>필요한 굴절률(RI = 1.46)을 제공하기 위해 0.01M PBS(20% 및 47% TDE/PBS)에서 2,2'-티오디에탄올(TDE)의 농도를 증가시켜 각각 8시간 동안 심장을 배양하고, 0.01M PBS에서 68% TDE의 최종 농도까지 배양합니다. 이것은 이미지16을 획득하기 위한 RI 매칭 매체(RI-medium)입니다.</li>
</ol>5. 심장 장착 및 획득
알림: 광학 시스템의 모든 구성 요소는 재료 표에 자세히 나열되어 있습니다.
<ol><li>외부 큐벳(석영, 45mm × 45mm × 42.5mm)의 약 80%를 RI 중간으로 부드럽게 채웁니다. 참고: 여기서는 1.46의 RI를 보장하는 다양한 비휘발성 솔루션을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>내부 큐벳(석영, 45mm × 12.5mm× 12.5mm)을 동일한 RI 매체로 조심스럽게 채웁니다.</li>
	<li>내부 큐벳 안에 샘플을 담그십시오. 위에서 설명한 샘플 배양을 통해 샘플이 유지되지 않고 RI 배지 내에서 안정적으로 유지될 수 있습니다.</li>
	<li>얇은 핀셋을 사용하여 샘플을 큐벳의 바닥으로 부드럽게 이동하고 세로축이 큐벳의 주축과 평행하도록 심장을 배열하여 스캔하는 동안 조직을 가로지르는 여기광 경로를 최소화합니다.</li>
	<li>두 개의 나사로 내부 큐벳 위에 맞춤형 플러그를 부드럽게 고정합니다.</li>
	<li>자석을 사용하여 샘플을 현미경 스테이지에 장착합니다.</li>
	<li>수직 샘플 스테이지를 수동으로 변환하여 내부 큐벳을 외부 큐벳에 담그십시오.</li>
	<li>여기 광원 (파장 638nm)을 켜고 저전력 (3mW 정도)을 설정합니다.</li>
	<li>전동 번역기를 사용하여 샘플을 이동하여 조직의 내부 평면을 비춥니다.</li>
	<li>이미징 소프트웨어(HCImageLive)를 켜고 카메라 트리거를 외부(라이트 시트) 모드로 설정하여 전체 설정을 제어하는 맞춤형 소프트웨어로 카메라의 획득 트리거를 구동합니다.</li>
	<li>스캔 설정 패널에서 자동 저장을 활성화하고 이미지를 저장해야 하는 출력 폴더를 설정합니다.</li>
	<li>선형 변환기를 사용하여 XY 평면의 샘플 위치를 수동으로 조정하여 샘플을 카메라 센서의 FoV 중심으로 이동합니다.</li>
	<li>선형 전동 번역기를 사용하여 Z축을 따라 샘플을 이동하여 단층 촬영 재구성을 위한 심장 경계를 식별합니다.</li>
	<li>레이저 출력을 ~20mW로 높여 이미징 세션을 준비합니다.</li>
	<li>단층 촬영 수집을 시작하고 이미징 소프트웨어의 시퀀스 패널에서 시작 버튼을 클릭하는 동시에 전동 변환기를 사용하여 6μm/s의 일정한 속도로 Z축을 따라 샘플을 이동합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications%3A+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li>
<li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+genetic+basis%2C+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22EP+Europace%22%5BJournal%5D)">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li>
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<li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li>
<li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li>
<li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808(2015).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).</li>
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<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).</li>
</ol>

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이 작업에서는 고해상도로 전체 마우스 심장을 지우고, 염색하고, 이미지화하는 성공적인 접근 방식이 도입되었습니다. 먼저, 조직 변형 프로토콜 (CLARITY)을 최적화하고 수행했으며, 심장 조직에 적용하기 위해 약간 수정했습니다. 실제로, 전체 심장의 3D로 효율적인 재구성을 얻으려면 광산란 현상을 방지하는 것이 필수적입니다. CLARITY 방법론을 사용하면 매우 투명한 온전한 심장을 얻을 수 있지만 수동적으로 수행 할 때 긴 잠복기 (약 5 개월)가 필요합니다. 뇌와 관련하여 심장 조직은 전기장을 이용하는 능동적 인 청소에 적합하지 않습니다. 저전압에서도 전기장은 손상 및 조직 파손을 초래합니다. 여기에서는 약 3 개월 만에 완전히 맑아진 심장을 얻기 위해 수동 청소 접근 방식을 최적화했습니다. 근위 대동맥을 통해 심장을 분리하고 캐뉼러링 한 후 프로토콜의 섹션 3에 설명 된대로 CLARITY 방법론을 수행했습니다. 절차 속도를 높이기 위해 수제 수동 제거 설정이 준비되었으며(그림 1</s...

심장 질환과 관련된 구조적 리모델링은 전기 전도에 영향을 미치고 장기 1,2의 전기 기계적 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 기능적 변화를 예측하는 데 사용되는 현재의 접근법은 일반적으로 MRI 및 DT-MRI를 사용하여 섬유증 침착, 혈관 트리 및 심장의 섬유 분포의 전반적인 재구성을 얻으며 장기 3,4를 가로 지르는 우선 활동 전위 전파 (APP) 경로를 모델링하는 데 사용됩니다. 이러한 전략은 심장 조직에 대한 아름다운 개요를 제공 할 수 있습니다. 그러나 공간 해상도는 세포 수준에서 심장 기능에 대한 구조적 리모델링의 영향을 조사하기에 충분하지 않습니다.
이 프레임워크를 단일 세포가 활동 전위 전파에서 개별 역할을 할 수 있는 다른 크기의 순서로 배치하는 것은 어려운 일입니다. 주요 한계는 거대한(센티미터 크기) 조직에서 고해상도 이미징(마이크로메트릭 해상도)을 수행하는 표준 이미징 방법의 비효율성입니다. 사실, 고해상도로 3D로 생물학적 조직을 이미징하는 것은 조직 불투명으로 인해 매우 복잡합니다. 전체 장기에서 3D 재구성을 수행하는 가장 일반적인 방법은 얇은 섹션을 준비하는 것입니다. 그러나 정밀한 절편, 조립 및 이미징에는 상당한 노력과 시간이 필요합니다. 샘플 절단을 요구하지 않는 대안적인 접근법은 투명한 조직을 생성하는 것입니다. 지난 몇 년 동안 조직을 명확히하기위한 몇 가지 방법론이 제안되었습니다 5,6,7,8. 거대하고 투명하며 형광 표지된 조직을 생산하는 과제는 최근 진정한 조직 변형 접근법(CLARITY9, SHIELD10)을 개발함으로써 달성되었습니다. 특히, CLARITY 방법은 손상되지 않은 조직을 막 지질 이중층의 선택적 제거에 의해 높은 투명성을 부여 할 수있는 나노 다공성, 하이드로 겔 혼성화, 지질이없는 형태로 변형시키는 것을 기반으로합니다. 특히,이 방법은 심장 준비11,12,13,14에서도 성공적으로 발견되었습니다. 그러나 심장은 너무 약해서 능동적 인 청소에 적합하지 않기 때문에 완전한 투명성을 부여하는 데 오랜 시간이 필요한 수동적 접근 방식을 사용하여 제거해야합니다.
라이트 시트 현미경과 같은 고급 이미징 기술과 결합된 CLARITY는 3D의 거대한 심장 조직을 마이크로메트릭 해상도로 이미징할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 라이트 시트 현미경에서 샘플의 조명은 검출 대물렌즈의 초점면에 제한된 얇은 라이트 시트로 수행됩니다. 형광 방출은 조명면(15)에 수직인 축을 따라 수집된다. 검출 아키텍처는 광시야 현미경과 유사하여 레이저 스캐닝 현미경보다 훨씬 빠르게 획득할 수 있습니다. 라이트 시트를 통해 샘플을 이동하면 최대 센티미터 크기의 샘플에 대한 큰 표본의 완전한 단층 촬영을 얻을 수 있습니다. 그러나 가우스 빔의 고유 특성으로 인해 제한된 공간 확장에 대해서만 매우 얇은 (수 미크론 정도의) 라이트 시트를 얻을 수 있으므로 시야 (FoV)가 크게 제한됩니다. 최근에는 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 여기 방식이 도입되어 뇌 영상에 적용되어 등방성 분해능16으로 3D 재구성이 가능합니다.
이 백서에서는 CLARITY 프로토콜에 필요한 청산 시기를 크게 줄일 수 있는 수동 청산 접근 방식을 제시합니다. 여기에 설명된 방법론적 프레임워크를 사용하면 단일 단층 촬영 스캔에서 마이크로메트릭 해상도로 전체 마우스 심장을 재구성할 수 있으며 획득 시간은 몇 분 정도입니다.

<table><tbody><tr><td>2-2' Thiodiethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 아미드</td><td>Bio-Rad</td><td>61-0140</td><td></td></tr><tr><td>AV-044 개시제</td><td>Wako 화학 물질</td><td>AVP5874</td><td></td></tr><tr><td>bis-acrylamide</td><td>bio-rad</td><td>161-042</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>하마 마츠</td><td>Orca 플래시 4.0 v3</td><td></td></tr><tr><td>카메라 소프트웨어</td><td>Hamamatsu</td><td>HC 이미지</td><td></td></tr><tr><td>시준 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>감지 암</td><td>통합 광학</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>여기 렌즈</td><td>Nikon</td><td>91863</td><td></td></tr><tr><td>Extera&igrave; nal 석영 큐벳</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-753</td><td></td></tr><tr><td>폴드 미러</td><td>Thorlabs</td><td>BBE1-E02</td><td></td></tr><tr><td>갈바노메트릭 미러</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211/M</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HCImage 라이브</td><td>하마마츠</td><td>4.6.1.19</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>내부 석영 큐벳</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-204</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>레이저 소스</td><td>통합 광학</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>장역 통과 필터</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0650</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 베이스</td><td>Thorlabs</td><td>KB25/M</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Chem-Lab</td><td>CI-1316-0250</td><td></td></tr><tr><td>전동 traslator</td><td>Physisk Instrument</td><td>M-122.2DD</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59888</td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Thorlabs</td><td>TL2X-SAP</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>한천 Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polycap AS</td><td>Whatman</td><td>2606T</td><td></td></tr><tr><td>릴레이 렌즈</td><td>Qioptiq</td><td>G063200000</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데실 설페이</td>트 <td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>튜브 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>ACT508-200-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>조정 가능한 렌즈</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>KNF Neuberger Inc</td><td>N86KT.18</td><td></td></tr><tr><td>물 목욕</td><td>Memmert</td><td>WTB</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

유전 적 및 비 유전 적 심장 질환 모두 심장에 심각한 리모델링 과정을 일으킬 수 있습니다. 콜라겐 침착 (섬유증) 및 세포 정렬 불량과 같은 구조적 리모델링은 전기 전도에 영향을 미치고 전기 기계적 기능 장애를 유발하며 결국 부정맥을 유발할 수 있습니다. 이러한 기능 변경에 대한 현재 예측 모델은 통합되지 않은 저해상도 구조 정보를 기반으로 합니다. 이 프레임워크를 다른 규모의 배열에 배치하는 것은 대규모 조직에서 고해상도 이미징을 수행하는 데 있어 표준 이미징 방법의 비효율성으로 인해 어렵습니다. 이 작업에서는 마이크로 메트릭 해상도로 전체 마우스 심장을 이미징 할 수있는 방법 론적 프레임 워크를 설명합니다. 이 목표를 달성하려면 조직 변형과 이미징 방법의 발전이 결합 된 기술적 노력이 필요했습니다. 먼저, 온전한 심장을 높은 투명성과 깊은 염색을 허용하는 나노다공성, 하이드로겔 하이브리드화, 지질이 없는 형태로 변환할 수 있는 최적화된 CLARITY 프로토콜을 설명합니다. 이어서, 미크론 스케일 해상도로 메조스코픽 시야(mm-scale)의 이미지를 신속하게 획득할 수 있는 형광 광시트 현미경이 설명된다. mesoSPIM 프로젝트에 따라 고안된 현미경을 사용하면 단일 단층 촬영 스캔에서 마이크로 메트릭 해상도로 전체 마우스 심장을 재구성 할 수 있습니다. 우리는이 방법 론적 프레임 워크가 전기 기능 장애에서 세포 구조 혼란의 개입을 명확히하고 기능적 및 구조적 데이터를 모두 고려한 포괄적 인 모델을위한 길을 열어 조직 리모델링 후 전기적 및 기계적 변화로 이어지는 구조적 원인에 대한 통합 조사를 가능하게한다고 믿습니다.

개발 된 패시브 클리어링 설정을 통해 약 3 개월 만에 제거 된 성인 마우스 심장 (10mm x 6mm x 6mm x 6mm 정도의 치수)을 얻을 수 있습니다. 설정의 모든 구성 요소는 그림 1과 같이 장착됩니다. 각 클리어링 챔버 사이의 무시할 수 있는 온도 구배(약 3°C)를 통해 모든 챔버에서 온도를 적절한 범위로 유지할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62795/62795fig01.jpg"> 그림 1: 수동 지우기 설정의 개략도. 투명화 용액(여과 후)은 연동 펌프의 도움으로 샘플 챔버를 통해 연속적으로 순환합니다. 50°C로 설정된 수조에서 용액 용기를 유지하면 용액 온도가 챔버 내에서...

우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

이 방법론은 클리어링 프로토콜의 개선과 Mesos PIM 기술의 광학 절편의 눈 기능을 결합하여 마이크로미터 해상도에서 메조 스코픽 재구성을 수행할 수 있습니다. 원래의 3차원 조직 조직을 잃지 않고 한 번의 스캔으로 대규모 심장 조직 또는 전체 마우스 심장 전체 용액을 이미지화할 수 있는 가능성을 제공합니다. 심장이 근위 대동맥에 의해 캐뉼레이션되어 티로 용액으로 세척되고 0.01 몰 PBS의 4 % 파라 폼 알데히드로 고정 된 후 클리어링 프로토콜을 시작할 준비가되었습니다.섭씨 4도에서 0.01 몰 PBS로 15 분 동안 심장을 3 번 씻으십시오. 이 단계 후에 심장은 PBS와 0.01 % 나트륨 아 지드화물에 섭씨 4도에서 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 섭씨 4도에서 3 일 동안 15RPM의 흔들림 상태에서 20ml의 하이드로 겔 용액에서 심장을 배양하십시오.건조기를 사용하여 실온에서 샘플을 탈가스화하고, 진공 펌프, 및 건조기를 펌프 밴드 및 질소 파이프라인 모두에 연결하는 튜브 시스템을 포함한다. 샘플을 건조기에 넣고 캡을 유지하면서 바이알을 엽니 다. 건조기를 닫고 질소 파이프 라인을 열어 튜브에서 산소를 제거하십시오.진공 펌프를 켜서 건조기에서 산소를 10분 동안 제거합니다. 펌프를 끄고 건조기의 손잡이를 질소 파이프 라인으로여십시오. 그런 다음 질소 탭을여십시오.압력이 대기압과 같으면 건조기를 조심스럽게 열고 바이알을 빠르게 닫으십시오. 탈기 된 하이드로 겔 용액에 심장을 섭씨 37도에서 약 3 시간 동안 그대로 두십시오. 하이드로 겔이 적절하게 중합되어 완전히 젤라틴처럼 보이면 조심스럽게 심장을 제거하고 투명 용액이있는 바이알의 클리어링 용액에 넣으십시오.정화 절차를 가속화하기 위해 3 일에 한 번 바이알의 투명액을 교체하십시오. 심장이 완전히 정화 된 것처럼 보이면 바이알에서 꺼내어 흔들리는 상태에서 24 시간 동안 예열 된 PBS 50ml로 씻으십시오. 진탕 상태에서 24 시간 동안 하나의 X PBS T 50 밀리리터로 다시 세척하십시오.샘플을 7일 동안 실온에서 50 RPM에서 진탕 조건에서 1 X PBS T의 3 밀리리터 중 밀 배아 아글루티닌 알렉사 플로어 633 밀리리터당 0.01 밀리그램으로 인큐베이션한다. 7일간의 인큐베이션 후, 샘플을 실온에서 50 밀리리터의 X PBS T로 24시간 동안 진탕하면서 세척하였다. 샘플을 4% PFA에서 15분 동안 배양한 다음 0.01몰 PBS에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다.심장을 각각 8시간 동안 0.01몰 PBS에서 20 및 47% TDE에서 연속적으로 배양합니다. 그런 다음 마지막으로 0.01몰 PBS에서 68%TDE에서 1.46의 필요한 굴절률을 제공합니다. 외부 석영 큐벳의 약 80%를 굴절률 매체로 부드럽게 채웁니다.내부 석영 큐벳을 동일한 굴절률 매체로 채웁니다. 샘플을 내부 큐벳 안에 담그십시오. 얇은 핀셋을 사용하여 샘플을 큐벳의 바닥으로 부드럽게 이동하고 세로 축이 큐벳의 주축과 평행하도록 심장을 배열하여 스캔하는 동안 조직을 가로지르는 여기광 경로를 최소화합니다.두 개의 나사로 내부 큐벳 위의 맞춤형 플러그를 조심스럽게 고정합니다. 자석을 사용하여 샘플을 현미경 스테이지에 장착합니다. 수직 샘플 스테이지를 수동으로 변환하여 내부 큐벳을 외부 큐벳에 담그십시오.파장이 638 나노 미터 인 여기 광원을 켜고 3 밀리 와트 정도의 저전력으로 설정하십시오. 전동 번역기를 사용하여 샘플을 이동하여 조직의 내부 플레이트를 비춥니다. HC 이미지 라이브 카메라 소프트웨어를 켜고 외부 에지 트리거 라이트 시트 모드에서 카메라 트리거를 설정하여 전체 설정을 제어하는 맞춤형 소프트웨어로 카메라의 획득 트리거를 구동합니다.카메라 소프트웨어에서 자동 저장을 활성화하고 이미지를 저장해야 하는 출력 폴더를 설정합니다. 선형 변환기로 XY 평면의 샘플 위치를 수동으로 조정하여 샘플을 카메라 센서의 시야 중심으로 이동합니다. 선형 전동 변환기를 사용하여 Z 축을 따라 샘플을 이동하여 단층 촬영 재구성을위한 심장 경계를 식별합니다.이미징 세션을 시작하기 전에 레이저 출력을 약 20밀리와트로 높입니다. 이미징 소프트웨어의 캡처 패널에서 시작 버튼을 클릭하여 단층 촬영 수집을 시작하고 동시에 전동 변환기를 사용하여 초당 6마이크로미터의 일정한 속도로 Z축을 따라 샘플을 이동하기 시작합니다. 투명도 방법론과 TDE를 굴절률 매질로 조합해도 샘플의 최종 부피가 크게 변경되지 않으며 시편의 등방성 변형이 발생하지 않습니다.여기 광학은 시야의 가장자리에서 최대 175 마이크로 미터까지 분기되는 약 6 마이크로 미터의 최소 폐기물을 가진 라이트 시트를 생성했습니다. 카메라 롤링 셔터와 라이트 시트 폐기물의 축 방향 스캔의 동기화는 전체 시야를 따라 약 6.7 마이크로미터의 평균 FW HM을 초래하는 라이트 시트의 폐기물과 여기된 샘플 부분에서만 방출 신호를 수집하는 것을 보장한다. 현미경의 Z 점 확산 기능은 또한 형광 나노스피어의 단층 촬영 재구성에 의해 추정되었고, 6.4 마이크로미터의 FW H M은 적합에 의해 추정되었다.전체 장기에서 충분한 신호 대 잡음비로 단일 세포막을 3 차원으로 분해하는 시스템의 잠재력도 확인되었습니다. 탈기 절차는 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. 제대로 수행되지 않으면 조직은 세척 용액에서 배양하는 동안 나타내는 손상에 직면할 수 있습니다.제시된 프로토콜은 다중 염색 프로토콜과 결합하여 다양한 생물학적 구조를 통합하는 전체 장기 재건을 달성하고 병리학 모델을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

고주파 도플러 초음파는 지역 심근 기능을 평가하기위한 새로운 기술입니다. 이 작품은 심근 스트레인, 국소 빈혈 - reperfused (IR) murine 마음에 DP / DT 및 승모판 병리 현상의 반복 측정이 다양한 이미징 플랫폼의 응용을 보여주는 첫번째 증거를 제공합니다.

고주파 고해상도 Echocardiography : 국소 빈혈 - reperfused Murine 중심부에 심근 스트레인, 수축성 및 승모판 병리 현상의 비침습 반복 측정에 대한 최초의 증거

이 동영상은 anesthetized 마우스 echocardiography을 수행하는 레일 마운트 고주파 초음파 프로브의 사용을 보여줍니다. 방법은 컬러 도플러, 스트레인 분석뿐만 아니라 일반 목표 대비 이미징과 같은 새로운,보다 강력한 도구 이외에도 심장 기능을 모두 종래의 2 차원 및 M 모드 측정을 설명합니다.

Murine Echocardiography 및 초음파 이미징

그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

이 문서에서 우리는 높은 해상도, 형광 표지 된 마우스의 뇌의 미세 뇌 해부학과, 재구성하는 전체 실험 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜은 샘플 준비 및 청소, 영상, 데이터 후 처리 및 다중 스케일의 시각화를 위해 설치 표본이 포함되어 있습니다.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

이 연구는 자가면역 심근염에 걸린 쥐의 심장 이상을 평가하기 위한 비침습적 도구로서 자기 공명 현미경 이미징의 성공적인 확립을 보여줍니다.  이 데이터는 이 기술이 살아있는 동물의 질병 진행을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 나타냅니다.

마우스에있는 자기 공명 현미경 영상으로 실험자가 면역 심근염에있는 심장의 이상 유무 비 침습적 평가

여기에, 우리는 높은 공간 및 시간 해상도, 마우스 우심방 특히 중국 - 심방 노드에서 전기 활동의 광학 매핑을위한 프로토콜을 제시한다.

마우스 중국 - 심방 노드의 고해상도 광학 매핑

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

여기에 제시된 것은 혈관 동맥이 수납 및 가압되기 때문에, 모세관 침대 및 백혈구를 포함하는 혈관 나무 구성 요소뿐만 아니라 압력을 유지하는 동맥 관류 압력 및 흐름의 전 생체 모니터링에 의해 살아있는 뮤린 심장 조직에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하는 프로토콜이다.

마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

여기에서는 쥐 심혈관계의 생체 역학 및 생체 분자 변화를 평가하기 위해 생체 내 4차원 초음파 이미징 및 생체 외 질량 분석 이미징을 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 수술로 유도된 심근경색의 심장 리모델링과 노화 동물의 혈관 변화를 분석하는 데 적용됩니다.

쥐 심혈관 리모델링에 대한 다중 모드 연구: 4차원 초음파 및 질량 분석 이미징

학습하세요 조직 투명화 및 라이트시트 현미경을 활용한 전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징 방법. 이 기술은 3차원 조직 구조를 보존하며 고해상도 심장 조직 재구성을 가능하게 합니다.

전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징

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