동시 브라이트필드, 형광, 및 수축 심장 Trabeculae Ex Vivo의 광학 일관성 지형 이미징
October 2nd, 2021
이 프로토콜은 적극적으로 수축심장 trabecula ex vivo에서sarcomere, 칼슘 및 거시적 기하학적 기하학적 데이터의 컬렉션을 제공합니다. 이러한 동시 측정은 세 가지 이미징 양식의 통합에 의해 가능하게됩니다.
이 절차의 전반적인 목표는 기계적 기능, 이온 역학 및 수축 심장 조직의 기하학적 변화를 동시에 측정할 수 있는 단일 장치에 있는 3개의 이미징 시스템의 통합을 입증하는 것입니다. 특히, 우리는 조직의 힘 생산, 칼슘 과도, 국부 변위 및 모양 변화를 측정합니다. 이러한 이미징 양식의 조합은 효과적인 치료 전략의 개발을위한 주요 의미와 함께 심장 질환의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 기술의 주요 장점은 우리가 근육 활동의 이질성을 연구 할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜에 사용된 장치는 동일한 샘플을 이미징할 수 있는 3개의 이미징 시스템, 밝은 필드 현미경, 형광 현미경 및 광학 일관성 토모그래프를 포함합니다. 일련의 이색 거울은 형광 방출 및 밝은 필드 전송 이미지를 분리하는 데 사용됩니다.
이 장치의 기본 특징은 두 개의 독립적으로 작동되는 장착 후크, 세 개의 광학적으로 선명한 축이 있는 측정 챔버, 밝은 필드와 OCT 카메라를 자극기와 동기화하는 외부 트리거 라인입니다. 이 비디오에서는 심장 궤적을 분리, 준비 및 이미지화하고 몇 가지 대표적인 결과를 제시하는 방법을 보여줍니다. 마취 된 쥐에서 심장을 절제 한 후 해부 챔버로 옮기습니다.
두 개의 곡선 된 집게를 사용하여 관류 캐뉼라 위에 대어타를 당깁니다. 대어타를 한 번의 포스로 제자리에 잡습니다. 한편, 해부 용액이 관류 캐뉼라를 통해 흐를 수 있도록 튜브 라인을 엽니다.
관상 동맥 혈관이 혈액을 제거하고 심장이 완전히 해부 용액으로 침투하면 봉합사를 사용하여 대동맥을 제자리에 고정하십시오. 왼쪽 관상 동맥이 우수한 표면에 보이시게 되도록 캐뉼라를 회전하여 심장을 배치합니다. 심혼의 정점을 해부 챔버의 바닥에 고정합니다.
두 아리아를 잘라. 중격의 오른쪽을 따라 심장의 정점에 잘라. 열린 좌심실을 해부 챔버의 베이스에 고정합니다.
그런 다음 중격의 왼쪽을 따라 절단하여 오른쪽 심실을 열고 해부 챔버의 기지에 고정합니다. 오른쪽 심실에서 자유 실행 trabecula를 식별합니다. 스프링 가위와 포스프를 사용하여, trabecula를 둘러싼 벽 조직을 잘라.
그런 다음 벽 조직을 반으로 자르고, 직교는 트라베큘라의 방향으로 절단한다. 치수가 사용되는 마운팅 구성에 적합한 때까지 벽 조직을 다듬습니다. 절제된 트라베큘라를 해부 실에 둡니다.
뜨거운 물, 증류수, 그리고 측정 챔버를 통해 용액을 과압합니다. 밝은 필드 현미경 광원을 켜고 F1을 눌러 캡처를 가능하게합니다. 밝은 필드 이미지에 중심이 될 때까지 다운스트림 후크를 수동으로 조정합니다.
다운스트림 축 0을 클릭한 다음 다운스트림을 비활성화하여 모터를 활성화합니다. 후크가 끝날 때까지 다운스트림 설정점 슬라이더를 기본 관심 영역의 가장자리와 정렬합니다. 다운스트림 축을 다시 0으로 설정한 다음 다운스트림 설정점 슬라이더를 1, 000으로 이동합니다.
업스트림 후크로 프로세스를 반복하지만 업스트림 축을 다시 0으로 설정한 후 업스트림 설정점 슬라이더를 이동하지 않습니다. 마운팅으로 이동하려면 클릭합니다. 메인 스위치를 전환하여 컨트롤러 하위 시스템을 빠르게 켜기 전에 램프 스위치를 전환하여 형광 조명 시스템을 시작합니다.
작동 모드를 전면 패널의 모드 버튼을 누르고 두 다음 두 다음 하나를 눌러 터보 블랭크로 전환합니다. 온라인 버튼을 눌러 외부 제어를 활성화합니다. 측정 챔버를 통해 슈퍼퍼서트 흐름을 일시 중지합니다.
마운팅 챔버를 해부 용액으로 채웁니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 해부 챔버에서 장착 챔버로 trabecula를 운반합니다. 트라베큘라가 중력을 통해 장착 챔버로 내려갑니다.
후크의 중간 부와 수준되도록 장착 챔버의 유체 레벨을 낮춥다. 다운스트림 설정점 슬라이더를 이동하여 트래베큘라의 여유 길이를 반영하도록 후크 사이의 거리를 조정합니다. 현미경을 사용하여 시각화를 돕고, 집게로 엔드 티슈 조각 중 하나를 가볍게 잡고 업스트림 후크에 장착하십시오.
다른 종류의 엔드 티슈를 다운스트림 후크에 장착합니다. 단단히 장착되면 챔버로 이동을 눌러 트라베큘라를 측정 챔버로 다시 이동하고 과속 흐름을 다시 시작합니다. 자극 주파수를 1로 설정하고, 자극 지속 시간을 10으로 설정하고, 자극 전압을 10으로 설정합니다.
자극을 눌러 자극을 시작합니다. 밝은 필드 조명 시스템을 켭니다. F1을 누르고 사용자 인터페이스의 줄무늬 영역을 둘러싸는 관심 영역을 선택합니다.
계산 sarcomere 길이를 클릭하여 강조 표시된 영역의 평균 sarcomere 길이를 계산합니다. 평균 sarcomere 길이가 약 2.32 미크론이 될 때까지 근육 길이를 증가시면 근육 길이를 늘립니다. 다운스트림 후크의 가장자리가 밝은 필드 이미지 내에서 볼 수 있도록 중앙 설정점 슬라이더와 분리 제어 탭의 중심 설정점 슬라이더를 조정하여 근육을 이동합니다.
10 개의 트위치에 대한 형광 정보를 수집합니다. 센터 설정점 값을 200으로 늘리고 형광 정보의 또 다른 10 트위치 가치를 수집합니다. 브라이트필드 이미지에 업스트림 후크가 들어올 때까지 이 프로세스를 반복합니다.
최종 창의 형광 정보를 수집합니다. 중앙 설정점 값을 0으로 설정하여 trabecula를 중앙 위치로 반환합니다. 자극 주파수를 0.2 Hertz로 줄이고 K-H 가퍼퍼러기에서 후라-2 로딩 솔루션으로 전환합니다.
10분마다 형광 신호를 측정합니다. PMT 신호 탭의 신호를 시각화합니다. 360 나노미터 신호가 10배 증가한 후 자극 주파수를 하나의 Hertz로 반환하고 K-H 가퍼바이스 용액으로 다시 전환한다.
신호가 안정될 때까지 10분마다 비율 측정을 확인하며, 이 시점에서 데이터 수집이 시작될 수 있습니다. 다운스트림 후크의 가장자리가 밝은 필드 이미지 내에 있는 위치로 근육을 반환합니다. 형광 소스를 활성화클릭하여 형광 정보를 캡처합니다.
하드웨어 데이터 스트리밍을 시작합니다. 브라이트필드 이미징 사용자 인터페이스에서 캡처 모드를 외부 트리거로 설정하고 프레임 속도를 100 Hertz로 늘리고 캡처할 이미지 수를 100개로 설정합니다. F1이 그 뒤를 이어 제어 시프트-S를 눌러 이 창의 밝은 필드 이미징 데이터를 기록합니다.
센터 설정점 값을 200으로 늘리고 밝은 필드 캡처 프로세스를 반복합니다. 최종 창에 대해 이미징 데이터가 수집될 때까지 스캐닝 프로토콜을 계속 합니다. 중앙 설정점 값을 0으로 설정하여 trabecula를 중앙 위치로 반환합니다.
마스터 키를 돌려 전원 버튼을 누르고 SD 버튼을 눌러 OCT 조명 소스를 켭니다. 갈바노미터 헤드를 덮고 배경을 클릭하여 배경 간섭 패턴을 측정하고 측정에서 빼십시오. 이미지 캡처 모드를 라이브 뷰로 설정합니다.
X 및 Y 오프셋 값을 조정하여 X 및 Y 축의 trabecula를 중앙에 연결합니다. trabecula를 중심으로 Y축을 따라 스캔하여 Y 위치를 조정하여 업스트림 및 다운스트림 후크에 해당하는 위치를 찾습니다. 이러한 위치를 아래로 기록합니다.
10으로 나눈 이러한 값 간의 절대 차이로 범위 Y를 설정합니다. 이미지 캡처 모드를 트리거된 자극으로 설정하고 X에서 100범위로 설정하고 활성 매개 변수 설정 단추를 클릭합니다. 데이터를 스트림한 다음 수집합니다.
여기에 제시 된 trabecula의 전체 길이에 대한 지역 칼슘과 밝은 필드 정보를 캡처하기 위해, 일곱 근육 위치가 필요했다. 각 포지션의 평균 힘의 수치는 트위치 힘이 이 움직임에 방해받지 않았다는 것을 시사하며, 강제 생산 행위에 대한 포지션 의존도가 없음을 드러낸다. 100 헤르츠의 속도로 광학 일관성 단층 촬영을 사용하여 수집 된 이러한 스캔은 ImageJ 플러그인, Weka를 사용하여 분할되었다.
각 단면은 측면 해상도와 깊이 해상도의 차이로 인해 왜곡된 것처럼 보입니다. 각 축을 각각의 해상도로 독립적으로 배율 조정하여 수정되었습니다. trabecula의 원시 C 스캔을 확장 한 후, 근육은 대략 원통형이다.
측정 챔버 벽의 반사는 때때로 근육 데이터와 겹칠 수 있지만 세분화 소프트웨어는 이를 고려하여 교육을 받을 수 있습니다. 일단 분할되면, 근육의 길이를 따라 단면 영역은 트위치 전체에 걸쳐 계산될 수 있습니다. 이 특정 trabecula에는 작은 가지가 있습니다.
분기의 움직임은 트라베큘라를 따라 약 반쯤 분명하다. 마지막으로 분할된 이미지를 메시로 변환하여 기하학적 모델의 구성을 지원합니다. 초당 100프레임의 속도로 7개 위치에서 캡처된 이미징 데이터를 함께 꿰매어 trabecula의 단일 완전한 이미지를 생성했습니다.
340 및 380 나노미터 흥분광과 관련된 생략형 형광의 비율은 trabecula가 후 세포내 칼슘과 상관 관계가 있습니다. 각 창에서 10개의 세포내 칼슘 과분의 평균은 그(것)들이 심상한 지역에 정렬됩니다. 이 trabecula에 대 한 일시적인 피크 합리적으로 일관 된 표시 하는 동안, 확장 칼슘 의 길이 따라 감소.
마찬가지로 변위 추적 및 sarcomere 길이 계산 의 결과는 지역 적 변동성의 존재를 나타냅니다. 사용되는 마커리스 추적 기법은 각 픽셀의 변위를 계산할 수 있습니다. 사메레 길이 추정치의 적합성은 FFT 신호에 맞는 가우시안의 폭과 진폭에 기초하여 테스트되었습니다.
이러한 조건은 0과 500 미크론 사이의 근육 영역에서 충족되지 않았기 때문에 사메레 길이 정보를 계산할 수 없었습니다. 관련 변위를 감안할 때, 이 지역의 사코메레스는 트위치의 수축 단계에서 길쭉해질 가능성이 높습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 심장 trabeculae를 격리하고 안정적으로 다중 모달 이미징을 준비하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.
이 과정은 심장 조직 수축의 생리학적 으로 정보에 입각한 유한 원소 모델의 건설에 필요한 데이터 세트를 수집하는 경로를 설정합니다.
개요
이 프로토콜은 기계적 기능, 이온 역학 및 수축하는 심장 조직의 기하학적 변화를 측정하기 위해 세 가지 이미징 시스템의 통합을 보여줍니다. 이 기술은 심장 근육의 힘 생성, 칼슘 일시적 변화 및 심장 근육의 형태 변화를 동시에 평가할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 심장 생리학
- 이미징 기술
- 심장 질환 연구
배경
- 심장 근육 활동을 이해하는 것은 심장 질환을 해결하는 데 중요합니다.
- 동시 이미징은 근육 기능의 이질성을 보여줄 수 있습니다.
- 여러 이미징 모드의 통합은 데이터 수집을 향상시킵니다.
- 이 연구는 심장 조직의 모델로 심장 근육을 집중합니다.
연구 목적
- 심장 조직의 기계적 및 이온 특성을 측정하기 위해.
- 심장 질환 치료 전략에 대한 영향을 탐구합니다.
- 심장 연구를 위한 새로운 이미징 장치를 보여줍니다.
사용된 방법
- 밝은 필드, 형광 및 광 코히런스 톰그래피 이미징 사용.
- 쥐 심장에서 심장 근육의 준비.
- 힘과 칼슘 역학의 동시 측정.
- 동기화된 이미징 시스템을 통한 데이터 수집.
주요 결과
- 심장 근육의 성공적인 분리 및 이미징.
- 섬유소 길이 및 칼슘 일시적 변화의 정량화.
- 동적 변화를 캡처하는 장치의 능력 증명.
- 심장 근육 활동의 이질성에 대한 통찰력.
결론
- 통합된 이미징 시스템은 심장 조직에 대한 포괄적인 데이터를 제공합니다.
- 이 접근 방식은 심장 기능에 대한 이해를 발전시킬 수 있습니다.
- 심장 질환 치료 개발에 대한 잠재적 응용 가능성.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This multimodal imaging approach enables simultaneous assessment of mechanical function, ionic dynamics, and geometric changes in cardiac tissue, addressing a critical gap in understanding excitation-contraction heterogeneity. By providing spatially resolved data on sarcomere length, calcium transients, and tissue deformation, the method supports mechanistic de-risking in cardiac target validation and preclinical model development. The integrated platform enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular events to functional outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating calcium handling with contractile function at subcellular resolution.
- Operational Value: Provides quantitative, spatially mapped outputs that clarify pathway-specific effects on tissue mechanics.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through direct visualization of excitation-contraction coupling in intact tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible measurements of displacement, strain, and sarcomere dynamics for assay benchmarking.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated trabeculae for downstream compound screening with real-time functional readouts.
- Scalability: The scanning protocol overcomes imaging window limitations, enabling full-length tissue analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers disease-relevant structural and functional data that align with translational biomarker discovery in cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying regional heterogeneity in contractile response.
- Predictive Confidence: Enables construction of physiologically informed finite element models for preclinical continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical modeling by providing multimodal, quantitative readouts that bridge molecular, cellular, and tissue-level phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by synchronizing calcium transient data with mechanical output and geometric change.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with standardized length control and force measurement capabilities.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions through synchronized brightfield, fluorescence, and OCT data streams.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation via geometrically accurate, data-driven computational models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal studies of cardiac tissue under varying pharmacological or genetic conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking ionic dynamics to tissue-level deformation and force production.
- Operational Value: Ensures reproducibility through synchronized, trigger-based data acquisition across imaging modalities.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing spatially heterogeneous responses that may be masked in bulk measurements.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on excitation-contraction homogeneity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac tissue isolation, multimodal microscopy, and image synchronization.
- Dependent on stable superfusion, precise length control, and external triggering for data alignment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue mounting, stimulation protocols, and region-of-interest selection.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different species or disease models.
- Limited by the physical size of the trabecula and the need for sequential scanning to achieve full-length coverage.
