미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화

이 방법은 종래의 미생물 재배 방법의 문제점을 해결하는데 도움을 줄 수 있다. 이 제품은 자동화된 미생물 재배 및 적응 진화를 위한 저비용, 작동 친화적이며 결과 신뢰할 수 있는 실험 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 운영을 자동화하고 노동 소비를 줄입니다.

그리고 동시에, 그것은 신뢰할 수있는 결과와 간단한 조작으로 좋은 문화 성능을 가지고 있습니다. 이 기술은 성장 곡선 측정, 적응 실험실 진화 및 단일 요인 다단계 분석과 같은 미생물학 연구 분야에서 주로 사용됩니다. 주사기 바늘을 0.41 밀리미터의 내경과 0.71 밀리미터의 외부 직경을 가진 주사기 바늘을 퀵 커넥터 A 및 시약 병에 연결하여 실험 준비를 시작하십시오.

그런 다음 모든 장비를 섭씨 121도에서 15 분 동안 오토클레이브하십시오. 미세 유체 칩을 설치하려면 작동 챔버의 문을 열고 광섬유 프로브를 들어올립니다. 전기장 구멍을 바늘과 맞춘 후 칩을 칩 받침대에 부드럽게 놓은 다음 두 개의 위치 결정 열을 위치 결정 구멍에 삽입하고 광섬유 프로브를 내려 놓습니다.

다음으로, 칩 상의 퀵 커넥터 A를 원고에 기재된 바와 같이 위치 번호에 따라 미생물 마이크로액적 배양 시스템 또는 MMC의 대응하는 포트에 연결한다. 완료되면 작동 챔버의 문을 닫으십시오. 배양된 에스케리치아 콜리 MG1655 현탁액을 0.05 내지 0.1의 OD600에 배지로 희석하여 10 밀리리터의 초기 박테리아 용액을 얻었다.

MMC를 초기화하려면 초기화 탭을 클릭합니다. 초기화 인터페이스가 나타나면 재배 온도를 섭씨 37도로, 광전 신호 값을 0.6으로 설정합니다. 초기화에는 약 20분이 소요됩니다.

나중에 멸균 된 시약 병을 깨끗한 벤치에 놓고 뚜껑을 조이십시오. 10 밀리리터의 멸균 주사기를 사용하여 주사기 바늘에서 옆 튜브로 세 ~ 다섯 밀리리터의 MMC 오일을 시약 병에 주입하십시오. 그런 다음 시약 병을 천천히 기울이고 회전시켜 오일이 내벽에 완전히 침투하도록하십시오.

병에 초기 박테리아 용액 다섯 밀리리터를 주입 한 후, MMC 오일의 다섯 밀리리터 내지 일곱 밀리리터를 주입하여 시약 병을 채운다. 시약 병의 독립적 인 퀵 커넥터 A를 꺼내 병의 퀵 커넥터 B에 퀵 커넥터 A를 삽입하여 샘플 주입 작업을 완료하십시오. 완료되면 작업 챔버의 문을 열어 시약 병을 금속 욕조에 넣으십시오.

칩의 C2 커넥터와 시약 병의 빠른 커넥터 A를 당깁니다. 시약 병의 측면 튜브 커넥터를 C2 커넥터에 연결하고 상단 튜브 커넥터를 O2 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 수술실의 문을 닫으십시오.

성장 곡선 측정 기능을 선택하려면 매개 변수 설정 인터페이스에서 성장 곡선을 클릭하여 숫자를 15로 입력합니다. 그런 다음 OD 감지 스위치를 켜고 파장을 600 나노 미터로 설정하십시오. 시작 탭을 클릭하여 드롭릿 생성을 시작합니다.

이 프로세스를 완료하는 데 15분이 걸립니다. 메인 인터페이스에 메시지를 표시하는 팝업 창이 나타나면 수술실 문을 열어 시약 병을 꺼내고 C2 및 O2 커넥터를 연결하십시오. 문을 닫은 후 팝업 창에서 확인 버튼을 클릭하여 자동으로 물방울을 재배하고 OD 값을 감지합니다.

성장 곡선이 고정 단계에 도달하면 데이터 내보내기 단추를 클릭하여 OD 데이터를 내보냅니다. 데이터 저장 경로를 선택하고 재배 기간 동안 기록된 OD 값을 CVS 형식으로 내보내 성장 곡선을 플로팅하려면 Excel 및 Origin 9.0과 같은 매핑 소프트웨어를 사용합니다. 앞서 설명한 바와 같이 필요한 양의 초기 박테리아 용액, 신선한 배지 및 MMC 오일을 새로운 배지의 초기 박테리아 용액에 대해 별도의 멸균 시약 병에 주입하십시오.

적응 진화의 기능을 선택하려면 소프트웨어에서 ALE를 클릭하십시오. 매개 변수 설정 인터페이스에서 OD 감지 스위치를 켠 다음 원고에 설명 된 모든 매개 변수를 설정하고 시작 탭을 눌러 액적 생성을 시작하십시오. 이 과정은 약 25 분이 소요됩니다.

각 하위 재배 기간 동안 액적의 최대 OD 값이 크게 증가했는지 여부를 관찰하십시오. 증가가 발생하고 실험 요구 사항을 충족하는 경우 데이터 내보내기 단추를 클릭하여 OD 데이터를 내보냅니다. MMC에서 표적 액적을 추출하려면 스크리닝 탭을 클릭하여 액적 추출 기능을 선택하십시오.

그런 다음 수집 옵션을 선택하고 대상 물방울의 수를 클릭하십시오. 완료되면 확인을 클릭하십시오. 팝업 창이 메시지를 표시하는 것을 기다립니다. 그런 다음 CF 퀵 커넥터를 수집을 위해 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 확인을 클릭하십시오. 소프트웨어 인터페이스가 메시지를 표시하는 새 창을 팝업하면 한 두 분 후에 CF 퀵 커넥터를 다시 삽입하고 확인을 클릭하여 MMC가 계속 실행되도록 합니다.

다음 대상 액적이 액적 인식 사이트에 도달하면 이전에 지정된 대로 수집합니다. 2.5 마이크로 리터 피펫을 사용하여 물방울을 꺼내 90 밀리미터 고체 플레이트에 놓은 다음 측면 길이가 3 센티미터 인 유리 삼각형 코팅 막대로 방울을 고르게 퍼뜨린 다음 섭씨 37도 항온 배양기에서 72 시간 동안 방울을 경작하십시오. 나중에 3 ~ 5 개의 독립적 인 박테리아 식민지를 선택하여 분당 200 회전, 섭씨 37도에서 48 ~ 72 시간 동안 10 밀리리터의 신선한 배지가있는 50 밀리리터 쉐이크 플라스크에서 각 식민지를 별도로 배양하십시오.

배양 후, 관련 표준 규정을 따라 배양된 박테리아 용액을 글리세롤 튜브에 저장한다. 대표적인 분석은 전체 적응 진화 과정에서 50 방울의 성장 곡선을 보여줍니다. 메탄올 필수 에스케리치아 콜라이 균주 또는 MeSV2.2가 빠른 성장에 이어 초기 느린 성장을 나타냄을 관찰하였다.

전체 적응 진화 과정에서 액적 여섯 개에 대한 성장 곡선을 별도로 플롯팅하였다. 첫 번째 세대의 최대 OD600 값은 0.37이었으며, 이는 마지막 하위 배양 기간 동안 0.58로 증가했으며, 이는 액적 6의 균주가 명백한 적응 진화를 실현했음을 나타냅니다. 또한, 액적 여섯 균주와 초기 균주의 성장 곡선을 비교하였다.

액적 여섯 균주는 초기 균주보다 정지기에서 더 높은 최대 비생장률 및 세포 농도를 나타내었다. 가장 중요한 것은 계기판과 시약 병의 연결이 올바른지 확인하는 것인데, 이는 작업이 정상적으로 진행될 수있는 물방울입니다. 이 방법은 연구원에게 미생물 배양을위한 새로운 아이디어를 제공하고 균주의 적응 진화를위한 효율적이고 저렴한 플랫폼을 제공합니다.