Name: 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 배우세요 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 활용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화 방법입니다. 이 기술은 노동력을 줄이고 신뢰할 수 있는 결과를 제공하며, 성장 곡선 측정과 적응 실험에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2018YFA0901500), 중국 국립 자연 과학 재단 (21627812)의 국가 핵심 과학 기기 및 장비 프로젝트 및 칭화 대학 이니셔티브 과학 연구 프로그램 (20161080108)의 지원을 받았다. 또한 메탄올 필수 대장균 균주 버전 2.2(MeSV2.2)의 제공을 위해 Julia A. Vorholt 교수(미생물학 연구소, 생물학과, 취리히 취리히, 취리히 8093, 스위스)에게 감사드립니다.

1. 계기 및 소프트웨어 설치
<ol><li>깨끗하고 멸균 된 환경 (예 : 깨끗한 벤치)을 MMC를위한 전용 영구 공간으로 선택하십시오. MMC를 공간에 꾸준히 설치하십시오. 참고: MMC를 강한 전기장, 자기장 및 강한 방열원의 간섭으로부터 멀리하십시오. 심한 진동이 광학 감지 부품에 영향을 미치지 않도록 하십시오. MMC에 AC220 V, 50 HZ의 전원 공급 장치를 제공하십시오. MMC에 대한 자세한 내용은 자료 표 및 MMC16 웹 사이트를 참조하십시오.</li>
	<li>MMC.zip 파일에서 작업 소프트웨어를 설치합니다. 참고: MMC.zip 파일에 대해서는 작성자에게 문의하십시오.<ol>
<li>전용 폴더를 만들고 zip 파일을 저장하십시오.</li>
		<li>다른 전용 폴더를 "설치 디렉토리"로 만듭니다. MMC.zip의 압축을 풀고 새 폴더에 파일을 저장합니다. 참고: 컴퓨터 구성이 가장 적합합니다: (1) Windows 7 64비트 운영 체제 이상; (2) CPU: i5 이상; (3) 메모리: 4GB 이상; (4) 하드 디스크: 300GB 이상 (회전 속도가 7200rpm 이상 또는 솔리드 스테이트 디스크).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비
<ol><li>주사기 바늘(내경은 0.41mm, 외경은 0.71mm), 퀵 커넥터 A 및 시약 병(그림 2C)을 연결하고, 이를 121°C에서 15분 동안 오토클레이브한다. 주: 멸균 중에 시약 병의 뚜껑을 약간 풉니다. 사용할 때마다 몇 가지 시약 병을 더 준비 할 수 있습니다.</li>
	<li>0.22 μm 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 필터를 사용하여 MMC 오일을 필터링합니다. 미세유동 칩(도 2B)과 MMC 오일을 미리 깨끗한 벤치에 넣고 사용 전에 30분 동안 자외선 조사로 멸균한다. 참고: 퀵 커넥터 A, 시약 병, MMC 오일 및 미세유체 칩에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.</li>
	<li>미세 유체 칩 설치<ol>
<li>작동 챔버의 도어를 열고(그림 2A) 광섬유 프로브를 들어올립니다.</li>
		<li>전기장 구멍을 전기장 바늘에 맞추고 칩을 칩 받침대에 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 두 개의 위치 결정 열을 위치 결정 구멍에 삽입하고 광섬유 프로브를 내려 놓습니다(그림 2D).</li>
		<li>칩의 퀵 커넥터 A를 위치 번호(C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3)에 따라 MMC의 해당 포트에 연결합니다. 그런 다음 수술실의 문을 닫으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기름 병에 MMC 오일(약 80 mL까지)을 보충하고 사용 전에 폐병에 폐액을 비우십시오. 참고 : 폐액은 일반적으로 유기 폐기물입니다. 지역 법률 및 폐기 규정을 참조하시기 바랍니다, 실험 설정에 따라 변경에 따라.</li>
</ol>3. MMC에서의 성장 곡선 측정
<ol><li>초기 박테리아 용액 준비<ol>
<li>관련 표준 규정에 따라 Luria-Bertani (LB) 배지 및 오토클레이브를 121 ° C에서 15 분 동안 준비하십시오. 참고: LB 배지의 성분: NaCl (10 g/L), 효모 추출물 (5 g/L) 및 트립톤 (10 g/L).</li>
		<li>글리세롤 스톡으로부터 대장균 MG1655 균주를 꺼내어 LB 배지 10 mL가 있는 50 mL 진탕 플라스크에서 37°C에서 5-8시간 동안 진탕 인큐베이터(200 rpm)에서 배양한다. 참고 : 재배 시간은 특정 균주에 따라 다릅니다. 대수 기간 / 단계로 균주를 배양하는 것이 가장 좋습니다.</li>
		<li>배양된 대장균 MG1655 용액을 신선한 배지로 희석하여0.05-0.1의 OD600에 초기 박테리아 용액(약 10 mL 준비)을 얻었다.</li>
	</ol></li>
	<li>초기화를 클릭하여 MMC를 초기화합니다. 초기화 인터페이스가 나타나면 배양 온도를 37°C로 설정하고 광전 신호 값을 0.6으로 설정합니다(그림 3A). 초기화에는 약 20 분이 소요됩니다.</li>
	<li>초기화하는 동안 UV 램프(파장 254nm)를 켭니다.</li>
	<li>초기 박테리아 용액과 MMC 오일을 시약 병에 주입하십시오.<ol>
<li>깨끗한 벤치에서 멸균 된 시약 병을 꺼내 뚜껑을 조이십시오.</li>
		<li>10 mL 멸균 주사기를 사용하여 측면 튜브의 주사기 바늘에서 3-5 mL의 MMC 오일을 주입하십시오. 시약 병을 천천히 기울이고 회전시켜 오일이 내벽에 완전히 침투하도록하십시오.</li>
		<li>초기 박테리아 용액 약 5 mL를 주입 한 다음 다시 오일 5-7 mL를 주입하여 시약 병을 채 웁니다.</li>
		<li>독립적인 퀵 커넥터 A를 당기고 시약 병의 퀵 커넥터 A를 퀵 커넥터 B에 삽입하여 샘플 주입 작업을 완료합니다(그림 4A).</li>
	</ol></li>
	<li>초기화가 끝날 때까지 기다린 다음 UV 램프 (파장 254nm)를 끕니다.</li>
	<li>수술실의 문을 열고 시약 병을 금속 욕조에 넣으십시오.</li>
	<li>칩의 C2 커넥터와 시약 병의 빠른 커넥터 A를 당깁니다. 시약 병의 측면 튜브 커넥터를 C2 커넥터에 연결하고 상단 튜브 커넥터를 O2 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 수술실의 문을 닫으십시오.</li>
	<li>성장 곡선을 클릭하여 성장 곡선 측정 기능을 선택합니다(그림 3A). 매개 변수 설정 인터페이스에서 숫자를 15로 입력하고 OD 감지 스위치를 켜고 파장을 600nm로 설정합니다. 시작을 클릭하여 드롭릿 생성을 시작합니다. 약 10 분이 소요됩니다. 참고: 여기서 숫자는 생성될 액적의 수를 나타냅니다. 파장은 검출되는 OD의 파장을 의미한다. 실험 요구 사항에 따라 수 (최대 200) 및 파장 (350-800nm)을 설정합니다.</li>
	<li>메인 인터페이스에 "C2와 O2 사이의 시약 병을 제거한 다음 완료 후 OK 버튼을 클릭하십시오"라는 팝업 창이 나타나면 수술실의 문을 열어 시약 병을 꺼내고 C2 및 O2 커넥터를 연결하십시오.</li>
	<li>문을 닫고 팝업 창에서 확인 버튼을 클릭하여 자동으로 물방울을 재배하고 OD 값을 감지합니다. 참고: MMC는 액적이 광섬유 프로브를 통과할 때 OD 값을 감지합니다. 따라서 감지 기간은 생성 된 액적의 수에 따라 다릅니다.</li>
	<li>성장 곡선이 고정 단계에 도달하면 데이터 내보내기 단추를 클릭하여 OD 데이터를 내보냅니다. 데이터 저장 경로를 선택하고 재배 기간 동안 기록된 OD 값을 적절한 소프트웨어(예: Microsoft Excel)에 의해 열 수 있는 .csv 형식으로 내보냅니다. 그런 다음 매핑 소프트웨어(예: EXCEL 및 Origin 9.0)를 사용하여 성장 곡선을 플로팅합니다. 참고: 재배 과정에서 언제든지 데이터 내보내기 를 클릭하여 현재 모든 액적의 OD 데이터를 내보낼 수 있습니다.</li>
</ol>4. MMC의 적응형 진화
<ol><li>초기 박테리아 용액 준비<ol>
<li>관련 표준 규정에 따라 MeSV2.2 및 오토클레이브를 위한 특수 액체 매질 및 고체 플레이트를 121°C에서 15분 동안 준비한다. 참고: 특수 매체의 구성 요소에 대해서는 표 1 및 재료 표를 참조하십시오.</li>
		<li>MeSV2.2를 고체 플레이트(직경 = 90 mm)를 사용하여 37°C 항온 배양기에서 72시간 동안 배양한다. 그 다음 독립적인 콜로니를 골라 37°C에서 72시간 동안 진탕 인큐베이터(200 rpm)에서 10 mL의 특수 액체 배지와 함께 50 mL 진탕 플라스크에서 배양한다.</li>
		<li>배양된 MeSV2.2 용액을 배지와 함께0.1-0.2의 OD600에 희석하고(총 부피가 10 mL 이상인지 확인) 진탕 플라스크에서 5시간 동안 계속 배양하여 초기 박테리아 용액을 얻었다. 참고: MeSV2.2는 메탄올-필수 대장균 균주이다. 특수 액체 배지에는 500 mmol / L 메탄올이 포함되어 있으며, 이는 MeSV2.2에 강한 스트레스이므로 매우 느린 성장을 초래합니다. 여기서 초기 박테리아 용액을 얻는 것은 단계 3.1에서 설명한 것과 다르다는 점에 유의하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>3.2, 3.3 및 3.5단계에서 설명한 대로 MMC를 초기화합니다.</li>
	<li>두 개의 멸균 된 시약 병을 꺼내십시오.이 중 하나는 초기 박테리아 용액을위한 것이고 다른 하나는 신선한 배지를위한 것입니다. 단계 3.4에서 설명된 바와 같이 초기 박테리아 용액 (5 mL), 신선한 배지 (12-15 mL), 및 MMC 오일을 시약 병에 주입한다. 참고 : 적응 진화는 여러 하위 재배를 포함하는 장기적인 과정이므로 MMC에 가능한 한 많은 신선한 배지를 저장하십시오. 배지는 실험 실행 중에 보충할 수 없습니다.</li>
	<li>3.6단계에서 설명한 대로 두 개의 시약 병을 MMC에 설치합니다. 하나는 C2와 O2 커넥터 사이에 초기 박테리아 용액을, 다른 하나는 C4와 O4 커넥터 사이의 새 배지에 설치하십시오.</li>
	<li>ALE를 클릭하여 적응 진화 기능을 선택합니다(그림 3B). 매개 변수 설정 인터페이스에서 OD 감지 스위치를 켭니다.</li>
	<li>숫자를 50, 파장을 600nm, 농도를 0%, 시간으로 입력, 파라미터를 30h, 반복을 99로 설정합니다. 시작을 클릭하여 드롭릿 생성을 시작합니다. 약 25 분이 소요됩니다. 참고: 여기서 "농도"는 적응 진화를 위한 화학적 요인의 최대 농도를 의미한다. 다른 액적의 경우, MMC에서 다른 성장 조건을 제공하기 위해 다양한 농도의 화학 인자를 도입하는 것이 실현 가능합니다. 다음 방정식을 사용하여 도입된 농도를 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62800/62800eq01.jpg"> 여기서 "C" 는 액적에 도입된 화학적 인자의 농도를 지칭하고; "a"는 C4 및 O4 커넥터 사이의 시약 병 내의 화학적 인자의 농도를 지칭하고; "b"는 C6 및 O6 커넥터 사이의 시약 병 내의 화학적 인자의 농도를 지칭하고; 및 "i"는 이용가능한 농도를 지칭한다. MMC에서 사용할 수있는 여덟 가지 농도가 있습니다. 여기의 화학 인자는 단일 농도 (500 mmol / L 메탄올)를 가지며 배지의 성분 중 하나이기 때문에 화학 인자를 함유 한 시약 병 하나만 여기에 설치되고 농도 는 0 %로 설정됩니다. 유형은 세 가지 유형으로 나뉘어지는 하위 재배 모드를 말합니다 : 시간 모드, OD 값 모드 및 형광 모드. 전자는 일정한 시간 동안 물방울을 재배 한 다음 하위 재배하는 것을 의미하고, 후자의 두 가지는 미리 정의 된 OD 값 / 형광 강도로 물방울을 재배 한 다음 하위 재배하는 것을 의미합니다. 매개 변수는 하위 재배 모드를 선택할 때 필요한 관련 매개 변수를 나타냅니다. 반복은 하위 재배의 수를 나타냅니다.</li>
	<li>3.8단계에서 설명한 대로 C2와 O2 커넥터 사이에 놓인 시약 병을 분리합니다.</li>
	<li>각 서브 재배 기간 동안 액적의 최대 OD 값이 크게 증가했는지 관찰하십시오. 증가가 발생하고 실험 요구 사항을 충족하는 경우 데이터 내보내기 단추를 클릭하여 3.9단계에서 설명한 대로 OD 데이터를 내보냅니다. 참고: 여기서 하위 재배 기간은 매개 변수에 따라 다릅니다. 예를 들어, 유형을 시간 및 매개 변수 로 설정하는 경우 하위 재배 기간은 30h입니다. 각 하위 재배 기간 동안, 액적의 최대 OD 값이 있습니다. 적응형 진화가 최대 OD 값의 증가에 의해 실험 요건을 충족하는지 여부를 추정한다(증가는 균주의 실제 재배 과정에 의존하며, 예를 들어, 20% 이상 증가함). 주의: 저장된 새 매체가 고갈되었는지 여부를 주의하십시오. 배지가 소진된 후에도 상당한 증가가 일어나지 않았다면, 더 잘 자라는 물방울을 추출하고 적응 진화의 새로운 라운드를 수행하십시오.</li>
	<li>MMC에서 표적 액적을 추출합니다.<ol>
<li>스크리닝 버튼을 클릭하여 액적 추출 기능을 선택합니다(그림 3C). 수집 옵션을 선택하고 대상 물방울의 수를 클릭 한 다음 확인을 클릭하십시오. 참고: 액적 스크리닝에는 "수집", "폐기" 및 "종자 용액 추출"이 포함됩니다. "추출 종자 용액"은 서브 재배 작업 후에 남은 액적(13)을 수집하는 것을 의미한다.</li>
		<li>팝업 창이 "CF 퀵 커넥터를 꺼내 EP 튜브에 넣으십시오"라는 메시지가 나타날 때까지 기다립니다. CF 퀵 커넥터를 소프트웨어 프롬프트에 따라 수집을 위해 마이크로 원심분리 튜브에 넣은 다음 확인을 클릭합니다(그림 4D).</li>
		<li>1-2 분 후에 소프트웨어 인터페이스는 "커넥터를 다시 삽입하고 완료되면 확인을 클릭하십시오"라는 새 창을 팝업합니다. 그런 다음 CF 퀵 커넥터를 다시 삽입하고 확인을 클릭하여 MMC가 계속 실행되도록 합니다(그림 4D). 다음 대상 액적이 액적 인식 사이트에 도달하면 4.9.2-4.9.3을 반복하여 수집합니다. 참고: 모든 표적 물방울이 수집된 후, MMC는 나머지 물방울을 계속 배양합니다. 재배가 필요하지 않은 경우 중지를 클릭하여 작업을 직접 종료하십시오.</li>
		<li>2.5 μL 피펫을 사용하여 액적을 추출하고, 90 mm 아가로스 플레이트에 떨어뜨린 다음, 측면 길이 3 cm의 삼각형 유리 확산 막대로 골고루 퍼뜨린다. 그런 다음 37 °C 항온 배양기에서 72 시간 동안 배양하십시오.</li>
		<li>3-5개의 독립적인 콜로니를 골라서 이를 신선한 배지 10 mL와 함께 50 mL 진탕 플라스크에서 37°C에서 48-72시간 동안 진탕 인큐베이터(200 rpm)에서 개별적으로 배양한다. 후속 실험을 위해 배양된 박테리아 용액을 글리세롤 튜브에 저장하기 위해 관련 표준 규정을 따르십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>5. MMC의 청소
<ol><li>실험이 완료되면 중지를 클릭하여 모든 작업을 중지 합니다. 그런 다음 정리 를 클릭하여 칩과 튜브를 청소하십시오. 약 15 분이 소요됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li>
<li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li>
<li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+technology+in+industrial+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening technology in industrial biotechnology.</a> Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).</li>
<li>Kim, J., Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+analysis+for+the+optimization+of+Campylobacter+isolation+from+chicken+carcasses+using+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1381(2019).</li>
<li>Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+microscale+processing+technologies+for+quantification+of+biocatalytic+Baeyer-Villiger+oxidation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).</li>
<li>Harms, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+a+24-station+high+throughput+microbioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).</li>
<li>Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-four+well+plate+miniature+bioreactor+system+as+a+scale-down+model+for+cell+culture+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).</li>
<li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).</li>
<li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+a+kinetics+analysis+of+the+high-pressure+inactivation+of+microorganisms+using+microplates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).</li>
<li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li>
<li>Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics+for+microbiology%3A+techniques%2C+applications+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).</li>
<li>Liao, P. Y., Huang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divide+and+conquer%3A+analytical+chemistry+of+nucleic+acids+in+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Sinica+Chimica%22%5BJournal%5D)">Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets.</a> Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).</li>
<li>Jian, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+microdroplet+culture+system+%28MMC%29%3A+An+integrated+platform+for+automated%2C+high-throughput+microbial+cultivation+and+adaptive+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).</li>
<li>Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empowering+a+methanol-dependent+Escherichia+coli+via+adaptive+evolution+using+a+high-throughput+microbial+microdroplet+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570(2020).</li>
<li>Meyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-essential+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Methanol-essential growth of Escherichia coli.</a> Nature Communications. 9, 1508(2018).</li>
<li>Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110">http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110</a> (2021).</li>
<li>Grünberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+growth+rate+0.6%3A+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Kaganovitch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+single-cell+analysis+in+picoliter-sized+batch+cultivation+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers.</a> New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).</li>
<li>Baraban, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millifluidic+droplet+analyser+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Millifluidic droplet analyser for microbiology.</a> Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).</li>
<li>Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li>
<li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li>
<li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998(2020).</li>
<li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li>
<li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155(2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 장기 적응 진화를 수행하는 방법을 제시합니다. MMC는 소형화, 자동화 및 고처리량 미생물 배양 시스템입니다. 기존의 미생물 고처리량 배양 방법 및 장비와 비교하여 MMC는 낮은 노동력 및 시약 소비, 간단한 조작, 온라인 검출 (OD 및 형광), 고분해능 데이터 수집 및 우수한 병렬화와 같은 많은 장점을 가지고 있습니다. MMC는 또한 일반적으로 pL 및 nL 액적을 사용하는 기존의 액적 미세 유체 기술과 다른 몇 가지 특별한 장점을 가지고 있습니다. pL 및 nL 물방울을 사용한 이전에 보고된 대부분의 시스템은 재배 성능이 좋지 않으며 검출 가능한 파라미터가 거의 없습니다(일반적으로 형광만 해당)18,19,20,21.<...

미생물 재배는 미생물 과학 연구 및 산업 응용을위한 중요한 토대 이며, 미생물 1,2,3의 격리, 식별, 재구성, 스크리닝 및 진화에 널리 사용됩니다. 기존의 미생물 재배 방법은 주로 시험관, 진탕 플라스크 및 고체 플레이트를 재배 용기로 사용하며 진탕 배양기, 분광 광도계, 마이크로 플레이트 판독기 및 미생물 재배, 검출 및 스크리닝을위한 기타 장비와 결합됩니다. 그러나 이러한 방법에는 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 많은 노동 및 시약 소비와 같은 많은 문제가 있습니다. 최근 몇 년 동안 개발 된 고처리량 재배 방법은 주로 마이크로 플레이트를 기반으로합니다. 그러나 마이크로플레이트는 낮은 수준의 용존 산소, 열악한 혼합 특성, 심한 증발 및 열 효과를 가지며, 이는 종종 불량 한 성장 상태 및 미생물 4,5,6,7의 실험 병렬화로 이어진다; 반면에 자동 재배 및 공정 검출 8,9를 달성하기 위해서는 액체 처리 워크 스테이션 및 마이크로 플레이트 판독기와 같은 값 비싼 장비를 장착해야합니다.
미세 유체 기술의 중요한 분야로서, 액적 미세 유체 학은 전통적인 연속 유동 미세 유체 시스템을 기반으로 최근 몇 년 동안 개발되었습니다. 두 개의 비혼화성 액체상(보통 오일-물)을 사용하여 분산된 마이크로액적을 생성하고 이들(10)에서 작동하는 이산 유동 미세유체 기술이다. 마이크로 액적은 작은 부피, 큰 비표면적, 높은 내부 질량 전달 속도, 구획화로 인한 교차 오염이 없으며 강력한 제어 가능성과 액적의 높은 처리량의 장점을 가지고 있기 때문에 미생물의 고처리량 재배, 선별 및 진화에 액적 미세 유체 기술을 적용하는 많은 종류의 연구가있었습니다11 . 그러나 액적 미세 유체 기술을 대중화하고 널리 적용하기위한 일련의 주요 문제가 여전히 있습니다. 첫째, 액적 미세 유체 공학의 작동은 번거롭고 복잡하여 작업자에게 높은 기술 요구 사항을 초래합니다. 둘째, 액적 미세 유체 기술은 광학, 기계 및 전기 구성 요소를 결합하고 생명 공학 응용 시나리오와 관련되어야합니다. 여러 분야의 협력이 없다면 단일 실험실 또는 팀이 효율적인 액적 미세 유체 제어 시스템을 구축하는 것은 어렵습니다. 셋째, 소량의 마이크로액적(피콜리터(pL)에서 마이크로리터(μL)까지)으로 인해, 서브재배, 분류 및 샘플링과 같은 일부 기본적인 미생물 작업을 위한 액적의 정확한 자동 제어 및 실시간 온라인 검출을 실현하는 데 많은 어려움이 소요되며, 통합 장비 시스템(12)을 구축하는 것도 어렵다.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 액적 미세유체 기술(13)에 기초한 자동 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)이 성공적으로 개발되었다. MMC는 액적 인식 모듈, 액적 스펙트럼 감지 모듈, 미세유체 칩 모듈 및 샘플링 모듈의 네 가지 기능 모듈로 구성됩니다. 모든 모듈의 시스템 통합 및 제어를 통해 생성, 재배, 측정 (광학 밀도 (OD) 및 형광), 분리, 융합, 물방울 분류를 포함한 자동화 된 운영 시스템이 정확하게 확립되어 미생물 액적 재배 과정에서 필요한 접종, 재배, 모니터링, 하위 재배, 분류 및 샘플링과 같은 기능의 통합을 달성합니다. MMC는 2-3 μL 부피의 최대 200개의 복제 액적 배양 단위를 보유할 수 있으며, 이는 200개의 진탕 플라스크 배양 단위에 해당한다. 마이크로 액적 재배 시스템은 미생물의 성장 동안 비 오염, 용존 산소, 혼합 및 질량 에너지 교환의 요구 사항을 충족시킬 수 있으며 성장 곡선 측정, 적응 진화, 단일 요인 다단계 분석 및 대사 산물 연구 및 분석 (형광 검출 기준)13,14과 같은 여러 통합 기능을 통해 미생물 연구의 다양한 요구를 충족시킬 수 있습니다.
여기서, 프로토콜은 MMC를 사용하여 자동화 및 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 자세히 소개한다(도 1). MMC에서의 적응 진화를 입증하기 위해 야생형 대장 균(E. coli) MG1655를 일례로 하여 성장 곡선 측정 및 메탄올-필수 대장균 균주 MeSV2.215를 수득하였다. MMC 용 운영 소프트웨어가 개발되어 작업을 매우 간단하고 명확하게 만듭니다. 전체 과정에서 사용자는 초기 박테리아 용액을 준비하고 MMC의 조건을 설정 한 다음 박테리아 용액 및 관련 시약을 MMC에 주입해야합니다. 그 후, MMC는 액적 생성, 인식 및 번호 매기기, 재배 및 적응 진화와 같은 작업을 자동으로 수행합니다. 또한 높은 시간 분해능을 가진 물방울의 온라인 검출 (OD 및 형광)을 수행하고 소프트웨어에 관련 데이터 (내보낼 수 있음)를 표시합니다. 작업자는 결과에 따라 언제든지 재배 과정을 중단하고 후속 실험을 위해 표적 액적을 추출 할 수 있습니다. MMC는 작동하기 쉽고 노동력과 시약을 덜 소비하며 상대적으로 높은 실험 처리량과 우수한 데이터 병렬 성을 가지며 이는 기존 재배 방법에 비해 상당한 이점을 가지고 있습니다. 연구자들이 관련 미생물 연구를 수행 할 수있는 저렴한 비용, 작동 친화적이고 강력한 실험 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 &무; m PVDF 필터 멤브레인</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>SLGPR33RB</td><td>MMC 오일</td></tr><tr><td>4 &deg를 살균하십시오. C 냉장고</td><td>Haier</td><td>BCD-289BSW</td><td>시약 보관용</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td>솔리드 플레이트 준비용</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약 베이징 Co., Ltd.</td><td>20011160</td><td>MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.</td></tr><tr><td>클린 벤치</td><td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td><td>DL-CJ-INDII</td><td>무균 작동 및 UV 살균</td></tr><tr><td>CoCl2&middot용; 6H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약 베이징 Co., 주식 회사.</td><td>10007216</td><td>MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소입니다.</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>레노버</td><td>E450</td><td>소프트웨어 설치 및 MMC 제어</td></tr><tr><td>항온 인큐베이터</td><td>상하이 qixin 과학 기기 co., LTD</td><td>LRH 250</td> 고체 매체 CuSO를 <td>사용하여 미생물 배<</td></tr><tr><td>sub>4&middot; 5H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약 베이징 Co., 주식</td> 회사<td>10008218</td><td>MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.</td></tr><tr><td>전자 저울</td><td>OHAUS</td><td>AR 3130</td><td>시약 계량용</td></tr><tr><td>EP 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>1.5 mL</td><td>액적 수집용</td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약 베이징 Co., 주식 회사.</td><td>10011928</td><td>MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.</td></tr><tr><td>동결 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>2.0 mL</td><td>균주 보존용</td></tr><tr><td>글루코네이</td><td>트 Sigma-Aldrich</td><td>S2054</td><td>MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>GENERAL-REAGENT</td><td>G66258A</td><td>스트레인 보존용</td></tr><tr><td>고압 증기 살균 포트</td><td>SANYO 전기</td><td>MLS3020</td><td>오토클레이브 살균용</td></tr><tr><td>이소프로필-&베타;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Biotopped</td><td>420322</td><td>MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Solarbio</td><td>K8020</td><td>MeSV2.2 용 특수 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>MACKLIN</td><td>P815661</td><td>MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소입니다.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>MACKLIN</td><td>M813895</td><td>MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>BIOBYING</td><td></td><td>1305715 MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소입니다.</td></tr><tr><td>미생물 미세방울 배양 시스템(MMC)</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td><td>&nbsp; MMC-I</td><td>성장 곡선 결정 및 적응 진화를 수행합니다. http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110</td></tr><tr><td>Microfluidic chip</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.를 참조하십시오.</td><td>MMC-ALE-OD</td><td>다양한 액적 작업용. http://www.tmaxtree.com/en/ MMC</td></tr> <tr><td>오일</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.를 참조하십시오.</td><td>MMC-M/S-OD</td><td>액적 미세유체공학을 위한 유상. http://www.tmaxtree.com/en/</td></tr> <tr><td>MnCl2</td><td>Sinopharm 화학 시약 Beijing Co., Ltd.를 참조하십시오.</td><td>20026118</td><td>MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>GENERAL-REAGENT</td><td>G81793J</td><td>LB 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>일반 시약</td><td></td> G10267B <td>MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sinopharm 화학 시약 베이징 Co., Ltd.</td><td>10001518</td><td>MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Corning Incorporated</td><td>90 mm</td><td>고체 매체</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td>2.5 &mu의 준비를 위해; L, 10 &뮤; L, 100&mu; L, 1000&mu; L</td><td>액체 취급</td></tr><tr><td>용 퀵 커넥터 A</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td><td>&엠대시;</td><td>각 조인트의 연결용. http://www.tmaxtree.com/en/</td></tr> <tr><td>시약 병</td><td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.를 참조하십시오.</td><td>MMC-PCB</td><td>박테리아 용액 및 시약의 샘플링 및 저장. http://www.tmaxtree.com/en/</td></tr> <tr><td>쉐이크 플라스크</td><td>Union-Biotech</td><td>50mL</td><td>미생물 배양</td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td>용 <td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.를 참조하십시오.</td><td>SKY-210 2B</td><td>쉐이크 플라스크</td></tr><tr><td>스트렙토 마이신 설페이</td>트 <td>Solarbio</td><td>S8290</td><td>MeSV2.2 용 특수 매체의 구성 요소에서</td></tr> 미생물 배양을 위해.<tr><td>주사기</td><td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td><td>10 mL</td><td>액체를 뽑아 시약병에 주입</td></tr><tr><td>주사기 바늘</td><td>OUBEL Hardware Store</td><td>22G</td><td>내경은 0.41mm, 외경은 0.71mm입니다.</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>옥소이드 주식회사</td><td>LP0042</td><td>LB 매체</td></tr><tr><td>초저온 냉장고</td><td>SANYO 초저</td><td>MDF-U4086S</td>의 구성 요소 <td>변형률 보존 (-80 > C)</td></tr><tr><td>UV&ndash; Vis 분광 광도계</td><td>General Electric Company</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td>OD 값 측정용</td></tr><tr><td>비타민 B1</td><td>Solarbio</td><td>SV8080</td><td>MeSV2.2용 특수 매체 구성 요소.</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Oxoid Ltd.</td><td>LP0021</td><td>LB 매체</td></tr><tr><td>ZnSO4&middot의 구성 요소; 7H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약 베이징 Co., 주식</td> 회사<td>10024018</td><td>MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.</td></tr></tbody></table>

미생물 마이크로액적 배양 시스템(mmc)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

기존의 미생물 재배 방법은 일반적으로 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 노동 및 시약의 큰 소비를 가지고 있습니다. 더욱이, 최근 개발된 마이크로플레이트 기반의 고처리량 재배 방법은 낮은 용존산소, 불량한 혼합물, 심한 증발 및 열 효과로 인해 미생물 성장 상태 및 실험 병렬화가 불량하다. 작은 부피, 높은 처리량 및 강력한 제어 가능성과 같은 마이크로 액적의 많은 장점으로 인해 액적 기반 미세 유체 기술은 이러한 문제를 극복 할 수 있으며, 이는 고처리량 미생물 재배, 스크리닝 및 진화에 대한 많은 종류의 연구에 사용되었습니다. 그러나 대부분의 선행 연구는 실험실 건설 및 적용 단계에 남아 있습니다. 높은 운영 요구 사항, 높은 건설 어려움 및 자동화 된 통합 기술의 부족과 같은 몇 가지 주요 문제는 미생물 연구에서 액적 미세 유체 기술의 광범위한 적용을 제한합니다. 여기에서는 액적 미세유체 기술을 기반으로 자동화된 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)이 성공적으로 개발되어 미생물 액적 재배 과정에서 필요한 접종, 재배, 온라인 모니터링, 하위 재배, 분류 및 샘플링과 같은 기능의 통합을 달성했습니다. 본 프로토콜에서는 야생형 대장 균(E. coli) MG1655 및 메탄올-필수 대장균 균주(MeSV2.2)를 예로 들어 MMC를 사용하여 자동화되고 상대적으로 높은 처리량의 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 상세히 소개하였다. 이 방법은 작동하기 쉽고 노동력과 시약을 덜 소비하며 실험 처리량이 높고 데이터 병렬성이 우수하여 기존 재배 방법에 비해 큰 장점이 있습니다. 과학 연구자가 관련 미생물 연구를 수행 할 수있는 저렴한 비용, 작동 친화적이며 결과 신뢰할 수있는 실험 플랫폼을 제공합니다.

이 프로토콜은 대장균 MG1655 및 MeSV2.2 균주를 예로 사용하여 MMC에서 자동화되고 상대적으로 높은 처리량 전략을 갖는 미생물 배양 및 메탄올 필수 적응 진화를 입증합니다. 성장 곡선 측정은 주로 미생물 재배를 특성화하기 위해 사용되었다. 적응 진화는 자동화된 연속 서브 재배에 의해 수행되었고, 각각의 서브 재배 동안 선택적 압력으로서 고농도의 메탄올을 첨가하였다. 적응 진화가 실현되었는지 여부는 각 서브 재배 기간 동안 액적의 최대 OD 값의 변동 추세를 통해 추정되었다. MMC의 조정 가능한 파라미터 및 정확도 파라미터는 표 2에 나타내었다.
성장 곡선 측정 결과 배양 과정 중에 검출된 15개의 액적의OD600 값을 약 20 h 동안 배양한 후에 MMC로부터 내보냈다(도 5A). 검...

이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 설명합니다. MMC는 미생물을 자동으로 지속적으로 재배 및 하위 재배 할 수 있으며 상대적으로 높은 처리량과 우수한 병렬화로 온라인으로 성장을 모니터링하여 노동 및 시약 소비를 줄일 수 있습니다.

미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

이 방법은 종래의 미생물 재배 방법의 문제점을 해결하는데 도움을 줄 수 있다. 이 제품은 자동화된 미생물 재배 및 적응 진화를 위한 저비용, 작동 친화적이며 결과 신뢰할 수 있는 실험 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 운영을 자동화하고 노동 소비를 줄입니다.그리고 동시에, 그것은 신뢰할 수있는 결과와 간단한 조작으로 좋은 문화 성능을 가지고 있습니다. 이 기술은 성장 곡선 측정, 적응 실험실 진화 및 단일 요인 다단계 분석과 같은 미생물학 연구 분야에서 주로 사용됩니다. 주사기 바늘을 0.41 밀리미터의 내경과 0.71 밀리미터의 외부 직경을 가진 주사기 바늘을 퀵 커넥터 A 및 시약 병에 연결하여 실험 준비를 시작하십시오.그런 다음 모든 장비를 섭씨 121도에서 15 분 동안 오토클레이브하십시오. 미세 유체 칩을 설치하려면 작동 챔버의 문을 열고 광섬유 프로브를 들어올립니다. 전기장 구멍을 바늘과 맞춘 후 칩을 칩 받침대에 부드럽게 놓은 다음 두 개의 위치 결정 열을 위치 결정 구멍에 삽입하고 광섬유 프로브를 내려 놓습니다.다음으로, 칩 상의 퀵 커넥터 A를 원고에 기재된 바와 같이 위치 번호에 따라 미생물 마이크로액적 배양 시스템 또는 MMC의 대응하는 포트에 연결한다. 완료되면 작동 챔버의 문을 닫으십시오. 배양된 에스케리치아 콜리 MG1655 현탁액을 0.05 내지 0.1의 OD600에 배지로 희석하여 10 밀리리터의 초기 박테리아 용액을 얻었다.MMC를 초기화하려면 초기화 탭을 클릭합니다. 초기화 인터페이스가 나타나면 재배 온도를 섭씨 37도로, 광전 신호 값을 0.6으로 설정합니다. 초기화에는 약 20분이 소요됩니다.나중에 멸균 된 시약 병을 깨끗한 벤치에 놓고 뚜껑을 조이십시오. 10 밀리리터의 멸균 주사기를 사용하여 주사기 바늘에서 옆 튜브로 세 ~ 다섯 밀리리터의 MMC 오일을 시약 병에 주입하십시오. 그런 다음 시약 병을 천천히 기울이고 회전시켜 오일이 내벽에 완전히 침투하도록하십시오.병에 초기 박테리아 용액 다섯 밀리리터를 주입 한 후, MMC 오일의 다섯 밀리리터 내지 일곱 밀리리터를 주입하여 시약 병을 채운다. 시약 병의 독립적 인 퀵 커넥터 A를 꺼내 병의 퀵 커넥터 B에 퀵 커넥터 A를 삽입하여 샘플 주입 작업을 완료하십시오. 완료되면 작업 챔버의 문을 열어 시약 병을 금속 욕조에 넣으십시오.칩의 C2 커넥터와 시약 병의 빠른 커넥터 A를 당깁니다. 시약 병의 측면 튜브 커넥터를 C2 커넥터에 연결하고 상단 튜브 커넥터를 O2 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 수술실의 문을 닫으십시오.성장 곡선 측정 기능을 선택하려면 매개 변수 설정 인터페이스에서 성장 곡선을 클릭하여 숫자를 15로 입력합니다. 그런 다음 OD 감지 스위치를 켜고 파장을 600 나노 미터로 설정하십시오. 시작 탭을 클릭하여 드롭릿 생성을 시작합니다.이 프로세스를 완료하는 데 15분이 걸립니다. 메인 인터페이스에 메시지를 표시하는 팝업 창이 나타나면 수술실 문을 열어 시약 병을 꺼내고 C2 및 O2 커넥터를 연결하십시오. 문을 닫은 후 팝업 창에서 확인 버튼을 클릭하여 자동으로 물방울을 재배하고 OD 값을 감지합니다.성장 곡선이 고정 단계에 도달하면 데이터 내보내기 단추를 클릭하여 OD 데이터를 내보냅니다. 데이터 저장 경로를 선택하고 재배 기간 동안 기록된 OD 값을 CVS 형식으로 내보내 성장 곡선을 플로팅하려면 Excel 및 Origin 9.0과 같은 매핑 소프트웨어를 사용합니다. 앞서 설명한 바와 같이 필요한 양의 초기 박테리아 용액, 신선한 배지 및 MMC 오일을 새로운 배지의 초기 박테리아 용액에 대해 별도의 멸균 시약 병에 주입하십시오.적응 진화의 기능을 선택하려면 소프트웨어에서 ALE를 클릭하십시오. 매개 변수 설정 인터페이스에서 OD 감지 스위치를 켠 다음 원고에 설명 된 모든 매개 변수를 설정하고 시작 탭을 눌러 액적 생성을 시작하십시오. 이 과정은 약 25 분이 소요됩니다.각 하위 재배 기간 동안 액적의 최대 OD 값이 크게 증가했는지 여부를 관찰하십시오. 증가가 발생하고 실험 요구 사항을 충족하는 경우 데이터 내보내기 단추를 클릭하여 OD 데이터를 내보냅니다. MMC에서 표적 액적을 추출하려면 스크리닝 탭을 클릭하여 액적 추출 기능을 선택하십시오.그런 다음 수집 옵션을 선택하고 대상 물방울의 수를 클릭하십시오. 완료되면 확인을 클릭하십시오. 팝업 창이 메시지를 표시하는 것을 기다립니다. 그런 다음 CF 퀵 커넥터를 수집을 위해 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 확인을 클릭하십시오. 소프트웨어 인터페이스가 메시지를 표시하는 새 창을 팝업하면 한 두 분 후에 CF 퀵 커넥터를 다시 삽입하고 확인을 클릭하여 MMC가 계속 실행되도록 합니다.다음 대상 액적이 액적 인식 사이트에 도달하면 이전에 지정된 대로 수집합니다. 2.5 마이크로 리터 피펫을 사용하여 물방울을 꺼내 90 밀리미터 고체 플레이트에 놓은 다음 측면 길이가 3 센티미터 인 유리 삼각형 코팅 막대로 방울을 고르게 퍼뜨린 다음 섭씨 37도 항온 배양기에서 72 시간 동안 방울을 경작하십시오. 나중에 3 ~ 5 개의 독립적 인 박테리아 식민지를 선택하여 분당 200 회전, 섭씨 37도에서 48 ~ 72 시간 동안 10 밀리리터의 신선한 배지가있는 50 밀리리터 쉐이크 플라스크에서 각 식민지를 별도로 배양하십시오.배양 후, 관련 표준 규정을 따라 배양된 박테리아 용액을 글리세롤 튜브에 저장한다. 대표적인 분석은 전체 적응 진화 과정에서 50 방울의 성장 곡선을 보여줍니다. 메탄올 필수 에스케리치아 콜라이 균주 또는 MeSV2.2가 빠른 성장에 이어 초기 느린 성장을 나타냄을 관찰하였다.전체 적응 진화 과정에서 액적 여섯 개에 대한 성장 곡선을 별도로 플롯팅하였다. 첫 번째 세대의 최대 OD600 값은 0.37이었으며, 이는 마지막 하위 배양 기간 동안 0.58로 증가했으며, 이는 액적 6의 균주가 명백한 적응 진화를 실현했음을 나타냅니다. 또한, 액적 여섯 균주와 초기 균주의 성장 곡선을 비교하였다.액적 여섯 균주는 초기 균주보다 정지기에서 더 높은 최대 비생장률 및 세포 농도를 나타내었다. 가장 중요한 것은 계기판과 시약 병의 연결이 올바른지 확인하는 것인데, 이는 작업이 정상적으로 진행될 수있는 물방울입니다. 이 방법은 연구원에게 미생물 배양을위한 새로운 아이디어를 제공하고 균주의 적응 진화를위한 효율적이고 저렴한 플랫폼을 제공합니다.

automated-microbial-cultivation-adaptive-evolution-using-microbial

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Jian, X. et. al., 미생물 미세액방울 배양 시스템(MMC)을 사용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 박테리아 성장의 실시간 모니터링을 위한 미세유체 액적 기반 플랫폼의 사용을 보여줍니다. 박테리아 현탁액을 포함하는 균일한 물방울을 생성하고 검출 경로를 통해 안내함으로써 이 시스템은 세포 밀도를 지속적으로 광학적으로 측정하여 성장 곡선을 구성할 수 있습니다.

미세유체 미세액방울 배양 시스템을 사용한 박테리아 성장의 실시간 모니터링

출처: Jian, X., et al., MMC(Microbial Microdroplet Culture System)를 사용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 미생물 미세 액적 배양 시스템을 사용하여 메탄올 내성을 향한 박테리아의 적응 진화를 유도하는 방법을 보여줍니다. 조작된 박테리아 배양액을 높은 메탄올 스트레스 배지와 혼합하고 이를 미세 물방울로 분할함으로써 시스템은 메탄올 스트레스 하에서 향상된 성장을 보이는 돌연변이를 선택합니다. 반복적인 농축 주기와 콜로니 분리를 통해 추가 분석 또는 적용을 위해 메탄올 적응 박테리아 균주를 배양합니다.

미생물 미세액방울 배양 시스템을 이용한 박테리아의 적응 진화

이 프로토콜에서는 원핵 생물의 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 생물반응기(PLBR)의 제작, 설정 및 기본 작동이 소개됩니다. 산업적으로 관련된 미생물을 원리 증명으로 분석하여 기존 방법으로는 거의 불가능했던 특정 기간 동안의 성장 속도, 형태 및 표현형 이질성에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

미생물 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 바이오리액터: 제작, 시스템 설정 및 작동

우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

약물 농도를 동적으로 조정하여 항생제 약물 내성의 특성을 분석할 수 있는 저비용의 구성 가능한 모비드도스타트를 설명합니다. 이 장치는 다중화된 미세유체 플랫폼과 통합될 수 있습니다. 이 접근 방식은 실험실 항생제 약물 내성 연구를 위해 확장할 수 있습니다.

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

여기서는 chemostat 문화 사용 조건 하에서 미생물 적응 진화 실험을 얻을 프로토콜을 제시한다. 또한, 진화 된 균주의 게놈 분석은 설명한다.

Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차

이 원고는 미생물 배양 미디어의 맞춤형 디자인에 대 한 일반적인 접근 방식을 설명합니다. Kriging 기반 실험 설계 및 microbioreactor 기술을 결합 충분 한 재배 처리량, 안정성 및 액체 미디어 처리 속도 높이기 위해 연구소 로봇에 의해 지원 되는 워크플로 반복 하 여 사용이 준비입니다.

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

Microbioreactor 시스템에 다양 한 조건에서 48 병렬 세포 배양의 동시 작업에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 셀 문화 과정, 수확 및 후속 항 체 titer 분석을 설명 합니다.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프의 배열및 현장 믹싱 계수로 구성된 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를위한 미세 유체 시스템을 제시합니다. 미세 유체 칩은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건을 분석할 수 있게 해줍니다.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

이 프로토콜은 MISS 세포(Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System)를 사용하여 미생물 단클론 분리, 배양 및 피킹을 수행하는 방법을 설명합니다. MISS cell은 액적 미세유체 기술을 기반으로 하는 통합 워크플로우를 달성하며, 이는 우수한 액적 단분산성, 높은 병렬 배양 및 고처리량 바이오매스 검출을 제공합니다.

Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System을 사용한 자동화된 High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking

우리는 밀리유체 연속 배양 장치(MCCD)에 대한 프로토콜을 제시하는데, 이는 수백 나노몰 농도까지 지속된 저영양 조건이나 시간적 영양분 변동 조건에서 세균 집단을 미세한 시간 척도로 배양할 수 있게 합니다.

영양소가 낮고 변동하는 상태에서 대 장 균 연구를 위한 연속 배양 밀리플루이딕 장치

배우세요 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 활용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화 방법입니다. 이 기술은 노동력을 줄이고 신뢰할 수 있는 결과를 제공하며, 성장 곡선 측정과 적응 실험에 활용됩니다.

미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화

더 많은 동영상 탐색