Name: 전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: 학습하세요 전자현미경을 이용한 크로마틴 복제 도메인 고해상도 이미징 방법을 EdU 및 Nanogold 라벨링을 통해 새로 합성된 DNA를 시각화하고 글루타르알데히드 고정으로 구조적 보존성을 유지합니다.

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이 작업은 RSF (보조금 #17-15-01290) 및 RFBR (보조금 #19-015-00273)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 Lomonosov Moscow State University 개발 프로그램 (PNR 5.13)과 Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology의 상관 관계 이미징 분야의 Nikon Center of Excellence에 감사 드리며 이미징 계측에 대한 액세스를 제공합니다.

상기 프로토콜은 부착성 세포에 최적화되어 있으며 HeLa, HT1080 및 CHO 세포주에서 시험하였다.
1. 세포 표지 및 고정
<ol><li>산성 세척 커버 슬립에있는 플레이트 셀은 3cm 페트리 접시에 담겨 있습니다. 70% 컨플루언시로 사용되는 세포주에 권장되는 배지에서 세포를 성장시킨다.</li>
	<li>10 mM 스톡으로부터 10 μM 최종 농도까지 EdU (5-에티닐-2'-데옥시우리딘)를 첨가하고, 세포를 10분 이상 동안 인큐베이터에 넣는다 (실험 목적에 따라 다름). 더 짧은 펄스 (최대 2 분)를 위해 10 μM EdU가 보충 된 미리 가온 된 신선한 배양 배지로 페트리 접시를 준비하고 EdU를 세포에 직접 첨가하는 대신 커버 슬립을 옮깁니다. 참고: 모든 후속 단계는 달리 표시되지 않는 경우 실온에서 수행됩니다.</li>
	<li>표지된 세포를 2.5% 글루타르알데히드로 고정시키고, 1시간 동안 100 mM 카코딜레이트 완충액에 25% 스톡을 희석하여 갓 만들었다. 참고: 후속 EdU 감지 단계는 고정 타이밍에 민감합니다. 고정 시간이 길면 EdU 라벨링에 부정적인 영향을 미쳐 신호 대 잡음비가 낮아질 수 있습니다.</li>
	<li>샘플을 5 mMMgCl2 로 보충된 PBS로 세척하여 글루타르알데히드를 제거하였다 (그 후 PBS*). 각 세척에 대해 10분 인큐베이션으로 세 번 세척한다.</li>
	<li>PBS*에서 1% 트리톤 X-100으로 원형질막을 투과시킨다(그 후 PBS*T). 각 세척에 대해 5 분 인큐베이션으로 두 번 씻으십시오.</li>
	<li>PBS*로 샘플을 광범위하게 세척하십시오. 다섯 가지 변화를 수행하고 각 변화에서 5 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>잔류하는 무함유 알데히드 그룹을 PBS* 중의 20 mM 글리신으로 각각 10분 동안 두 번 담금질한다.</li>
	<li>샘플을 30분 동안 PBS* 중의 1% BSA로 차단한다.</li>
</ol>2. 클릭반응
참고: 이 절차는 이전에 게시된 프로토콜19에서 수정되었습니다.
<ol><li>사용 직전에, EdU 검출을 위한 클릭-반응 믹스를 준비한다: 마이크로원심분리 튜브에서, 430 μL의 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 20 μL의 100 mM CuSO4, 1.2 μL의 비오틴-아지드 (DMSO 중 10 mM), 및 50 μL의 0.5 M 아스코르브산을 혼합한다. 형광 현미경 검사의 수준에서 복제 표지 및 클릭 절차의 품질 관리를 위해, 비오틴-아지드는 AlexaFluor 488-azide로 대체될 수 있다. 참고 : 위의 반응에서 성분의 첨가 순서는 중요합니다.</li>
	<li>습한 챔버에서 클릭 반응을 수행하여 반응 칵테일의 증발 및 농도 이동을 최소화하십시오. 젖은 여과지 시트를 페트리 접시의 바닥에 놓고 파라핀 필름으로 덮어서 촉촉한 챔버를 준비하십시오. 커버슬립을 필름 표면에 놓고 셀을 위로 향하게 하고 50-100 μL의 반응 칵테일을 커버슬립 위에 겹쳐 놓습니다. 반응은 실온에서 30 분이 소요된다.</li>
	<li>PBS*(PBS*T)로 0.1% 트리톤 X-100으로 샘플을 세척하고, 각각 5분 동안 5회 세척하여 반응을 중지시킨다.</li>
	<li>실온에서 30분 동안 PBS*T의 1% BSA를 차단합니다.</li>
	<li>스트렙타비딘-나노골드 용액을 1% BSA를 함유한 PBS*T로 준비합니다. 새로 준비된 습한 챔버에서 +4°C에서 하룻밤 동안 1% BSA + PBS*T에서 1.4 nm 나노골드 입자(나노프로브)와 접합된 스트렙타비딘으로 샘플을 인큐베이션한다.</li>
	<li>반응을 중지하고 PBS*T로 샘플을 세척하고, 각각 10분 동안 다섯 번 세척한다.</li>
	<li>PBS*의 1% 글루타르알데히드에 30분 동안 후고정시킴으로써 비오틴 스트렙타비딘 복합체를 안정화시킨다.</li>
	<li>탈이온수로 강렬한 세척으로 글루타르알데히드를 제거하고 PBS*로 샘플을 각각 20분 동안 다섯 번 세척한다.</li>
	<li>물에 갓 준비된 1 mg/mL NaBH4로 유리 알데히드 그룹을 담금질하고, 각각 10분 동안 두 번 담금질한다. 인큐베이션 동안, 커버슬립을 들어 올릴 수 있는H2의 기포가 형성된다. 핀셋으로 조심스럽게 밀어 내립니다.</li>
	<li>탈이온수로 각각 5 분 동안 5 번 씻으십시오. 참고: 라벨링 단계에서 품질 관리를 위해서는 형광 라벨이 붙은 스트렙타비딘으로 제어 라벨링을 수행하는 것이 좋습니다(그림 2). 이렇게 하면 지루하고 아티팩트가 발생하기 쉬운 후속 단계로 전환하기 전에 레이블링 강도와 배경 수준을 추정할 수 있습니다.</li>
</ol>3. Ag 증폭
참고: 이 절차는 Gilerovitch et al., 1995 (20,21 참조)에서 수정되었습니다.
<ol><li>아카시아 분말 50g을 탈이온수 100mL에 재현탁한다. 3 일 동안 녹이고 가스를 제거하고 치즈 천의 네 층을 통해 여과하십시오. 50mL 튜브에 5mL 분취량으로 냉동 보관하십시오. 사용 직전에 해동하십시오.</li>
	<li>아카시아 분말 용액의 해동된 분취량 5 mL에 2 mL의 1 M MES (pH = 6.1)를 첨가하여 아카시아 분말 용액에 7 mL의 0.28 M MES (pH = 6.1)를 만든다. 튜브를 천천히 30 분 동안 흔들어서 혼합하십시오. 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 호일로 감싸십시오.</li>
	<li>단계 3.2.와 동시에, 커버슬립을 세척 완충액 (50 mM MES, pH = 5.8, 200 mM 수크로오스)으로 각각 10분 동안 3회 세척한다.</li>
	<li>N-프로필 갈레이트(NPG)의 신선한 용액을 준비한다. 15 mL 튜브에서, 10 mg의 NPG를 96% 에탄올의 250 μL에 용해시키고, 탈이온수로 5 mL로 조정한다.</li>
	<li>호일 싸인 15 mL 튜브에 은락테이트 36 mg을 넣는다.</li>
	<li>3.2 단계 이후. 완료되면, NPG 용액 1.5 mL를 아카시아 분말 믹스에 첨가하고, 또 다른 3분 동안 암석시킨다. 참고: 이후의 모든 단계는 암실에서 수행됩니다. 비-actinic 안전 표시등(노란색 또는 빨간색)을 사용합니다.</li>
	<li>샘플을 세척 완충액으로 평형화시키고 암실로 진행하십시오. 동시에, 은유에 탈이온수 5 mL를 첨가하고 1-2 분 동안 격렬하게 흔들어서 용해시킨다.</li>
	<li>아카시아 분말 믹스에 은락테이트 용액 1.5 mL를 넣고 1 분 동안 천천히 흔든다. 믹스의 산소가 반응을 늦추기 때문에 거품 형성을 피하십시오.</li>
	<li>커버슬립으로 접시에서 용액을 배출하고 세포에 은락테이트-아카시아 파우더 믹스 3mL를 붓습니다. 접시를 여러 번 흔들고 2-5 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 시간은 아카시아 분말 배치 및 온도에 따라 달라집니다. 이것은 실험적으로 정의되어야합니다. 참고: 인큐베이션 시간이 길어지면 비특이적인 은 결합이 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>반응을 멈추려면 반응 믹스를 배수하고 탈이온수를 세 ~ 5 회 변화시킨 다음 각각 5 분 동안 세 번 더 바꿔 접시를 광범위하게 씻으십시오.</li>
	<li>염색을 브라이트필드 현미경으로 확인한다. 좋은 염색은 매우 희미한 황색 배경을 가진 밝은 갈색에서 짙은 갈색이어야합니다. 참고 : 염색이 진행되지 않으면 이미 만들어진 믹스로 즉시 반복 할 수 있습니다 (어둠 속에 보관하면 믹스가 약 15 분 동안 활성화됩니다). 그러나이 경우 염색이 너무 빨리 진행될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 금 토닝
참고: 후속 절차에서 OsO4 산화에 의한 용해로부터 은 나노입자를 보호하기 위해, 이 단계에서 금으로 함침시키는 것이 사용된다(Sawada, Esaki, 1994)22.
<ol><li>커버슬립을 탈이온수로 헹구십시오.</li>
	<li>OsO4 산화에 의한 용해로부터 은 나노입자를 보호하기 위해, 샘플을 어둠 속에서 2분 동안 0.05% 테트라클로로우르산으로 인큐베이션한다.</li>
	<li>탈이온수로 10 분 동안 철저히 씻으십시오. 참고 :이 단계에서 추가 대비가 함유 된 DNA에 첨가됩니다. 샘플의 색상은 갈색에서 검은 색으로 바뀌어야합니다.</li>
</ol>5. 크롬엠
참고: 이 프로토콜은 Ou et al., 201716에서 수정되었습니다.
<ol><li>커버슬립을 인큐베이션하고, 샘플을 어둠 속에서 10분 동안 PBS 중의 10 μM DRAQ5로 포화시킨다.</li>
	<li>50 mM 트리스 또는 PBS에 0.2% 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB) 용액을 제조하였다: 어둠 속에서 격렬하게 교반하여 DAB를 최종 부피의 90%에 용해시킨 다음, NaOH로 pH를 7.0-7.4로 조정한다. 부피를 100%로 조정하고 0.22 μM 필터를 통해 필터하고, 호일에 싸서 보관한다.</li>
	<li>DAB 용액을 세포 (3 cm 페트리 접시 당 2 mL)에 첨가하고 1 분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>커버 슬립을 유리 바닥 페트리 접시로 옮겨 거꾸로 된 현미경의 무대에 놓습니다. 10분 동안 Plan Apo λ 40х(NA = 0.95) 렌즈를 통해 금속 할로겐화물 광원과 Cy5 필터 세트(초점면에서 640nm, 1W/cm2)로 반전된 현미경에 샘플(여러 시야)을 조사합니다. 참고 : 성공적인 DAB 광변환의 표시는 조사 된 핵에서 완전한 DRAQ5 광표백 및 어두운 DAB 침전물 형성입니다. 그러나 후자는 강렬한 EdU-silver-gold 신호에서 항상 명백한 것은 아닙니다 (특히 확장 된 EdU 펄스가 활용되는 경우).</li>
	<li>탈이온수로 각각 5 분 동안 세 번 씻으십시오.</li>
</ol>6. 탈수 및 에폭시 수지 임베딩
<ol><li>마이크로 원심분리 튜브에서, K4Fe(CN)6의 2% 수용액과 동량의 2%OsO4 수용액을 혼합하여 부분적으로 환원된 사산화오스뮴 용액을 준비하여, 두 성분의 최종 농도 1%를 얻는다. 환원된OsO4 에서 커버슬립을 1시간 동안 인큐베이션하고, 각각 5분 동안 탈이온수에서 3회 세척한다. 참고: 이 단계에서 감소된 오스뮴 화합물은 DAB 침착과 반응하여 DNA의 대비를 증가시킵니다. 주의: 오스뮴은 독성이 있으며 흄 후드 아래에서 작업하며 현지 안전 규정에 따라 폐기물을 처리합니다.</li>
	<li>샘플을 일련의 등급화된 에탄올 용액으로 탈수시켜 백분율을 증가시킨다: 50% EtOH - 3 x 10분; 70% EtOH - 3 x 10 분, 80% EtOH - 3 x 10 분, 96% EtOH - 3 x 10 분, 100% EtOH - 3 x 10 분.</li>
	<li>침투 및 매립을 위해 다음과 같이 성분 부피 비율의 수지 공식을 사용하십시오 : 에폭시 수지 단량체 : DDSA:MNA : DMP-30 = 9 : 6 : 4 : 0.23 (W / W). 이 공식은 에탄올과 혼화성이다.<ol>
<li>커버슬립을 에탄올-수지 믹스(3부 100% EtOH:1부 에폭시 수지)에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>커버슬립을 에탄올-수지 믹스(1부 100% EtOH:1부 에폭시 수지)에서 2시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>커버슬립을 에탄올-수지 믹스(1부 100% EtOH:에폭시 수지 3부)에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>에탄올 - 수지 믹스를 갓 준비된 순수한 수지로 교체하십시오. 순수한 수지 믹스에서 8 h 동안 인큐베이션한다. 접시를 열어 에탄올의 잔해가 증발하도록하십시오.</li>
		<li>커버슬립을 순수한 수지로 새 접시에 옮기고 37-42°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>실리콘 몰드를 갓 준비된 수지로 채 웁니다. 셀이 아래를 향하도록 커버슬립을 에폭시 수지로 채워진 적절한 실리콘 몰드 위에 놓습니다. 수지를 37°C에서 24시간 동안 경화시킨 다음, 60°C에서 적어도 2일 동안 경화시킨다. 주의: 에폭시 수지 혼합의 성분은 잠재적인 발암 물질입니다. 장갑을 착용하고 흄 후드 아래에서 작업하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>몰드에서 수지 슬래브를 제거하고 메스 또는 면도날로 커버 슬립 표면을 청소하십시오. 커버슬립을 제거하려면 커버슬립을 액체 질소에 떨어뜨린 다음 슬래브를 끓는 물에 옮깁니다. 필요한 경우 반복하십시오.</li>
	<li>입체 현미경으로 조사 된 영역을 찾아 쇠톱이나 다른 적절한 장비로 슬래브에서 잘라냅니다. 필요에 따라 슬래브를 핫플레이트 상에서 70°C에서 미리 데우십시오.</li>
	<li>컷아웃을 울트라마이크로톰 샘플 홀더에 고정하여 최종 블록 트리밍을 수행합니다. 면도기를 사용하여 피라미드 모양의 샘플을 준비하십시오. 피라미드가있는 홀더를 울트라 마이크로 톰에 장착하고 칼을 설치하십시오.<ol>
<li>EdU 레이블이 있는 조사된 셀이 포함되도록 블록을 트리밍합니다. 전자 단층 촬영에 적합한 반박형 섹션 (250 nm 두께)을 준비하십시오. 참고: 섹션 두께는 실험 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>칼 가장자리에서 부분을 분리하여 단일 슬롯 그리드에 놓습니다. 전자 단층 촬영의 경우, 250nm 섹션은 1mm 단일 슬롯 그리드 상에 선택되며 건조 후이 섹션은 양쪽에서 탄소 코팅 될 수 있습니다. 추가 대조는 필요하지 않습니다. 참고: 섹션에는 이미 고대비 Au-Ag 입자가 포함되어 있으므로 단면 표면에 신탁 금 입자를 추가할 필요가 없습니다.</li>
	<li>낮은 배율 (약 600x)에서 투과 전자 현미경으로 그리드를 검사하여 적절한 복제 패턴을 가진 세포를 찾습니다. 참고: 이 프로토콜은 낮은 배율에서도 복제 초점을 쉽게 감지할 수 있을 만큼 충분히 높은 라벨링 밀도를 생성합니다. 먼저 단층 촬영을위한 후속 탐색 및 각도 투영 수집을위한 섹션의지도를 만드는 것이 좋습니다. 더 높은 배율로 전환하고 고해상도 이미지를 촬영합니다.</li>
</ol>7. 전자 단층 촬영
<ol><li>그리드를 높은 기울기 홀더가있는 투과 전자 현미경에 삽입하십시오. 샘플을 전자 현미경에 넣고 관심 영역을 찾습니다.</li>
	<li>EFTEM 모드의 현미경을 거의 평행 조명 모드로 정렬합니다. 제로 손실 피크에 배치된 20eV 에너지 선택 슬릿으로 에너지 필터를 조정합니다.</li>
	<li>단층 촬영 획득 영역을 적어도 1.5-2 분 동안 40 e / Å 2 / s의 용량 속도로 사전 조사하며, 이는 적어도 3000 e / Å2의 총 용량에 해당합니다.</li>
	<li>SerialEM에서 자동 작업으로 eucentric 높이를 조정합니다. 자동 초점 작업을 확인하여 제로 틸트 각도 및 -0.8mkm 목표 디포커스 값에서 올바르게 작동하는지 확인합니다.</li>
	<li>워크업 작업을 통해 샘플 홀더를 -60°로 기울입니다.</li>
	<li>단층 촬영 수집을 -60°에서 +60°까지 2.0° 단계로 설정합니다. 노출은 카메라의 평균 강도를 유지하기 위해 기울기 각도에 따라 설정되어야 합니다. 에너지 이동을 일으켜 정렬 불량을 일으킬 경우 이미지 이동을 제한하십시오. 단층 촬영 데이터는 .mrc 파일로 저장해야합니다.</li>
	<li>단층 촬영 재구성을 위해 .mrc 파일을 IMOD 소프트웨어로 가져옵니다. X선으로 인한 이상값 픽셀 값을 제거합니다.</li>
	<li>틸트 계열을 정렬합니다. 초기 상호 상관 관계를 수행 한 다음 수동으로 10-12 금 입자를 신탁으로 표시하십시오. 신탁 모델을 추적하고 모든 신탁이 틸트 시리즈를 통해 올바르게 추적되는지 검사합니다. 샘플 단층 촬영 (슬라이스)을 만들고 수동으로 얇은 섹션 테두리를 표시하여 볼륨 내부의 재구성 된 밀도가 기울어 질 수 없도록하십시오. 미세 정렬에 대한 평균 잔류 오차는 1.2pix 미만이었다.</li>
	<li>필터링된 백 프로젝션 알고리즘을 사용하여 토모그램을 재구성한 다음 관심 영역을 최종 볼륨에 맞게 출력을 트리밍합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 설명된 방법은 이전에 게시된 프로토콜에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 복제된 DNA를 표지하기 위한 클릭화학의 사용은 항체를 이용한 BrdU 검출을 위한 DNA 변성 전제조건의 필요성을 제거하여, 크로마틴 울트라구조를 더 잘 보존한다. 
둘째, 글루타르알데히드 고정 및 결합되지 않은 알데히드 그룹의 적절한 담금질 후에 생성되는 보조 리간드로 비오틴의 활용은 표적의 화학적 변형을 최소화하고, 따라서 내인성 비오틴으로 인한 배경을 감소시키면서 라벨링 효율을 향상시킨다. 비오틴-스트렙타비딘은 또한 형광 표지된 스트렙타비딘의 사용이 절차의 초기 단계에서 쉬운 품질 관리를 제공하기 때문에 다재다능함을 더합니다. 이 프로토콜은 FluoroNanogold 표지 된 스트렙타비딘의 도입으로 더욱 단순화 될 수 있지만, 우리 손에서 이러한 시약은 Nanogold-streptavidin에 비해 다소 높은 배경을 제공했으며, 아마도 프로브의 크기가 더 크기 때문일 수 있습니다....

DNA 복제는 세포 분열 동안 유전 정보의 충실한 복사 및 전달에 필요한 기본적인 생물학적 과정입니다. 고등 진핵생물에서, DNA 복제는 엄격한 시공간-시간적 조절을 받게 되며, 이는 복제 기원의 순차적 활성화로 나타난다1. 이웃 복제 기원은 동기적으로 발사되어 replicons2의 클러스터를 형성합니다. 광학 현미경 검사의 수준에서, 진행중인 DNA 복제 부위는 다양한 수와 크기의 복제 초점으로 검출됩니다. 복제 초점은 표지된 DNA 3,4의 복제 타이밍에 따라 세포 핵 내 공간 분포의 특정 패턴을 표시하며, 이는 차례로 유전자 활성과 밀접한 상관 관계가 있다. 공간과 시간에 엄격하게 정렬된 잘 정의된 DNA 복제 시퀀스 덕분에, 복제 표지는 복제 과정 그 자체에 대한 연구뿐만 아니라 전사 활성 및 압축 수준이 정의된 특정 DNA 하위 분획을 구별하는 강력한 DNA 표지 방법입니다. 복제 크로마틴의 시각화는 일반적으로 DNA 복제 기계의 주요 단백질 성분 검출 (면역 염색 또는 형광 단백질 태그5,6의 발현) 또는 변형 된 DNA 합성 전구체 7,8,9,10의 혼입을 통해 수행됩니다. . 이들 중에서, 변형된 뉴클레오티드를 새로 복제된 DNA에 혼입하는 것에 기초한 방법만이 복제 동안 크로마틴의 형태적 변화의 포획을 허용하고, 복제가 완료된 후 복제 도메인의 거동을 추적한다.
고등 진핵생물에서 염색질로의 DNA 패키징은 기본 유전 기능 (전사, 복제, 배상 등)의 조절에 또 다른 수준의 복잡성을 추가합니다. 크로마틴 폴딩은 주형 합성에 필요한 조절 트랜스 팩터 및 DNA 형태 변화 (이중 나선 풀기)에 대한 DNA의 접근성에 영향을 미칩니다. 따라서, 세포 핵에서의 DNA 의존성 합성 과정은 크로마틴의 응축되고 억압적인 상태로부터 보다 접근하기 쉽고, 개방된 형태로의 구조적 전이를 필요로 한다는 것이 일반적으로 받아들여진다. 세포학적으로, 이들 두 크로마틴 상태는 헤테로크로마틴 및 유크로마틴으로 정의된다. 그러나 핵에서 DNA 폴딩 방식에 관한 합의는 아직 이루어지지 않았다. 가설은 핵솜 섬유가 패킹 밀도가 상 분리 메커니즘에 의해 제어되는 임의의 중합체로서 행동하는 "중합체 용융" 모델(11)로부터, 두께12,13을 증가시키는 크로마틴 섬유형 구조의 순차적 형성을 가정하는 계층적 폴딩 모델에 이르기까지 다양하다. 계층적 폴딩 모델은 최근 계내 DNA-DNA 접촉(염색체 입체 형태 포획, 3C)의 분석에 기초한 분자 접근법으로부터 지지를 얻었으며, 이는 크로마틴 구조 도메인(14)의 계층 구조의 존재를 입증한다. 복제 단위는 이러한 크로마틴 도메인(15)과 매우 잘 상관관계가 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 이들 모델에 대한 주요 비판은 다양한 프로브 (예 : 항체)에 대한 크로마틴 접근성을 향상시키면서 초 구조 연구를 위해 크로마틴 대비를 개선하기 위해 세포막의 투과 및 비 염색질 성분의 제거와 같은 샘플 준비 절차에 의해 야기 된 잠재적 인 인공 염색질 응집에 기초합니다. DNA 결합 형광단에 의한 전자 현미경을 위한 선택적 DNA 염색의 최근 기술 발전은 디아미노벤지딘(ChromEMT6)의 광산화-매개 이러한 장애물의 제거를 허용하였다. 그러나, DNA17,18을 복제하는 전자 현미경 시각화에 대해서도 동일한 고려사항이 적용된다. 여기서 우리는 무손상 알데히드 가교 세포에서 새로 합성 된 DNA와 총 크로마틴의 동시 고해상도 초구조적 매핑을 가능하게하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 클릭 화학에 의한 EdU 표지 DNA의 검출을 비오티닐화 프로브 및 스트렙타비딘-나노골드 및 ChromEMT와 결합합니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 555-azide</td><td>Termo Fisher</td><td>A20012</td><td></td></tr><tr><td>비오틴-아지드</td><td>Lumiprobe</td><td>C3730</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Boval</td><td>LY-0080</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>SPI-CHEM</td><td>26544-38-7</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>SPI-CHEM</td><td>90-72-2</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermo Scientific</td><td>62251</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 수지 단량체</td><td>SPI-CHEM</td><td>90529-77-4</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드(25%, EM 등급)</td><td>TED PELLA, INC</td><td>18426</td><td></td></tr><tr><td>아라비아 ACROS</td><td>Organics</td><td>258850010</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Panreac</td><td>141396.1209</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>SPI-CHEM</td><td>25134-21-8</td><td></td></tr><tr><td>N-프로필 갈레이트</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>은 젖산</td><td>알드리치</td><td>359750-5G</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-AlexaFluor 488 접합체</td><td>Termo Fisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Nanogold 접합체</td><td>나노 프로브</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>테트라클로로오우산</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HT1004</td><td></td></tr><tr><td>Tris(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris)</td><td>CHEM-IMPEX INT'L</td><td>298</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Chemica</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copper single slot grids</td><td>Ted Pella</td><td>1GC10H</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 형광 필터 세트 (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td><td>Nikon</td><td>Cy5 HQ</td><td>대안 : Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프 Ultra Wet 45o</td><td>Diatome</td><td>DU</td><td>대안: Ted Pella</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>대안: Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>고틸트 샘플 홀더</td><td>Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Biosan</td><td>Multi Bio RS-24</td><td></td></tr><tr><td>EFTEM 모드에서 200kV에서 작동하는 투과 전자 현미경, 고 틸트 고니오미터</td><td>Jeol</td><td>JEM-2100</td><td>대안 : FEI, Hitachi</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Ted Pella</td><td>523</td><td></td></tr><tr><td>초박 절기</td><td>Leica</td><td>UltraCut-E</td><td>대안 : RMC</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image acquisition</td><td>오픈 소스</td><td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td><td></td></tr><tr><td>이미지 처리</td><td>오픈 소스</td><td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td><td></td></tr></tbody></table>

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

세포 핵에서 DNA 폴딩의 원리와 기본적인 유전 기능 (전사, 복제, 분리 등)의 이행 중에 발생하는 동적 변형은 부분적으로 구조적으로 보존 된 핵에서 특정 염색질 유전자좌의 고해상도 시각화에 대한 실험 접근법이 부족하기 때문에 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기서 우리는 새로 합성 된 DNA의 EdU 표지와 나노 골드 입자의 Ag 증폭 및 크로마틴의 ChromEM 염색을 통한 후속 라벨 검출을 결합하여 단층 세포 배양물 에서 복제 도메인을 시각화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 상온 시료 처리를 위한 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 전통적인 글루타르알데히드 고정과 호환되는 고대비, 고효율 사전 임베딩 라벨링을 가능하게 합니다. 라벨링을 사전 임베딩하는 또 다른 이점은 단면화를 위해 관심있는 세포를 미리 선택할 수 있다는 것이다. 이것은 이종 세포 집단의 분석뿐만 아니라 복제 부위에서 크로마틴 조직의 고해상도 3D 분석에 대한 전자 단층 촬영 접근법과의 호환성, 복제 후 크로마틴 재배열 및 자매 염색질 분리의 분석에 특히 중요합니다.

포유류 세포 핵에서의 복제 초점은 S상 진행에 따라 핵 내 분포의 뚜렷한 패턴을 나타낸다. 이러한 패턴은 복제되는 유전자좌의 전사 활성과 상관관계가 있다. 여기에 제시된 방법은 다소 강한 고정 절차를 이용하기 때문에, 실온 화학적 고정에 의해 얻어지는 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 조건 하에서도 다양한 전사 상태에서 크로마틴 유전자좌의 특정 검출을 위해 복제 펄스 라벨링을 사용하는 것은 매우 간단합니다.
품질 관리 단계는이 프로토콜의 핵심 절차를 성공적으로 완료하기위한 것입니다. 처음에는 형광 표지된 아지드와의 클릭 반응으로 성공적인 EdU 라벨링을 확인해야 하며, 이종 세포 집단을 사용할 경우 일반적인 복제 패턴을 보여 줍니다(그림 2). 두 번째 중요한 단계는 스트렙타비딘 라벨링이며, 이는 글루타르알데히드 고정에 의해 강하게 영향을 받을 수 있습니다. 스트렙타비딘 결합 효율의 평가를 위해, 스트렙타비딘-나노골드와...

이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

우리는 새로 합성 된 DNA의 EdU 표지 및 나노 골드 입자의 은색 강화 및 크로마틴의 ChromEM 염색을 통한 라벨 검출에 의해 세포 내의 복제 도메인의 전자 현미경 시각화를위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 상온 샘플 처리를 위해 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 전통적인 글루타르알데히드 고정으로 고대비 사전 임베딩 라벨링을 제공합니다. 이 프로토콜은 페트리 접시의 커버슬립 상에서 성장하는 부착 세포에 최적화되어 있습니다.EdU를 최종 농도 10 마이크로몰에 첨가하고, 원하는 라벨링 시간 동안 세포를 인큐베이터에 넣는다. 표지 된 세포를 100 밀리몰 소듐 카코딜레이트 용액에 2.5 % gluaradehydrate로 1 시간 동안 고정하십시오. 고정 시간이 길면 EdU 라벨링에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다.샘플을 다섯 밀리몰의 염화마그네슘으로 보충된 PBS로 헹구어 글루타르알데히드를 제거하고, PBS 스타로 더 간주한다. 10 분 동안 세 번 씻으십시오. PBS 별에 Trione X-100의 1 % 용액으로 원형질막을 투과시키고 각각 5 분 동안 두 번 변경하십시오.이 용액은 PBS 스타 T.Exexex로 샘플을 PBS 스타로 광범위하게 세척하는 것으로 추가로 지칭된다. 각각 다섯 분 동안 다섯 가지 변경 사항. 잔류 알데히드 그룹을 PBS 별에 20 밀리몰의 글리신으로 담금질하고, 10분 동안 2회 켄칭한다.샘플을 1%BSA로 PBS 별에 넣고 반시간 동안 보관한다. BSA에서 차단하면서 EdU 검출을 위해 반응 칵테일을 준비하십시오. 구성 요소 추가 순서가 중요합니다.EdU 비오틴-아지드 컨쥬게이션은 반응 칵테일에서 증발 및 농도 이동을 최소화하기 위해 습한 챔버에서 수행된다. 촉촉한 챔버를 준비하십시오. 커버슬립을 파라 필름 위에 올려놓고 세포를 위로 향하게 하고 50 내지 100 마이크로리터의 반응 칵테일을 커버슬립 위에 올려 놓는다.반응은 실온에서 30 분 걸립니다. PBS 별 T에서 샘플을 세척하여, 각각 다섯 분 동안 다섯 번 세척하여 반응을 중지시킨다. PBS 별 T에 1%BSA로 다시 차단하여 반 시간 더 차단합니다.PBS 별 T에 스트렙타비딘-나노골드 용액을 1%BSA로 준비한다. 샘플을 스트렙타비딘으로 하룻밤 동안 플러스 네 도에서 새로 준비된 습한 챔버에서 배양하십시오. 이 절차는 EdU 비오틴-아지드 접합과 동일합니다.반응을 중지하고 샘플을 세척하고, PBS로 각각 10분 동안 다섯 번 스타티.안정화 비오틴 스트렙타비딘 복합체를 추가로 고정시켜 PBS 스타글루타르알데히드 1%글루타르알데히드를 반시간 동안 고정시킨다. 탈이온수로 강렬한 세척으로 글루타르알데히드를 제거하십시오. 잔류 알데히드 그룹을 밀리리터 나트륨 보로하이드라이드 당 하나의 밀리그램으로 담금질한다.다시 철저히 씻으십시오. 다음 단계는 황금 코스에 은을 증착함으로써 나노 금 입자의 크기를 증가시키는 것입니다. 암실 활동을 최소화하기 위해 프리믹스를 준비하십시오.샘플을 세척 완충액으로 평형화시키고 암실로 진행하십시오. 암실에서 성분을 혼합하여 세척액을 준비하고 샘플에 적용하십시오. 아카시아 분말 용액은 매우 점도가 높습니다.따라서 구성 요소를 혼합하는 동안 거품과 거품 형성을 피하기 위해 튜브를 천천히 흔드십시오. 반응은 두 분에서 다섯 분 정도 걸립니다. 최적의 반응 시간을 결정하기 위해 테스트 실행을 수행하는 것이 좋습니다.더 긴 인큐베이션 시간은 비특이적 인 은 증착을 초래할 수 있습니다. 반응을 멈추려면 탈이온수의 세 가지 내지 다섯 가지 변화로 샘플을 빠르게 헹구십시오. 그 다음에는 각각 다섯 분 동안 세 가지 변경 사항이 더 있습니다.오스뮴 테트록사이드에 의한 용해로부터 은 나노입자를 보호하기 위해, 샘플을 암흑 속에서 두 분 동안 0.05% 테트라클로로우르산에서 인큐베이션한다. 탈 이온수로 철저히 씻으십시오. 이 단계에서, 추가적인 콘트라스트가 함유 물질을 함유하는 DNA에 첨가된다.DRAQ5 DNA 염색으로 샘플을 포화시킵니다. 디아미오노벤지딘 용액을 샘플에 첨가하고 일분 동안 인큐베이션한다. 커버 슬립을 유리 바닥 페트리 접시로 옮기고 거꾸로 된 현미경의 무대에 놓습니다.640 나노 미터 적색 빛으로 여러 시야를 조사하십시오. 왼쪽 패널은 DRAQ5의 완전한 사진 표백을 보여줍니다. 오른쪽 패널에서, DAB 침전물을 나타내는 투과광에서 동일한 시야각이 영상화된다.탈이온수로 샘플을 세척하십시오. 다음 단계는 흄 후드 아래에서 수행되어야합니다. 부분적으로 환원된 오스뮴 테트록사이드 용액을 제조하였다.조심하세요. 이 물질은 매우 휘발성이며 독성이 있습니다. 준비된 용액을 샘플 상에 바릅니다.이 단계에서, 환원된 오스뮴 화합물은 디아미오노벤지딘 침착과 반응하여 DNA의 콘트라스트를 증가시킨다. 현지 규정에 따라 오스뮴 함유 용액을 폐기하고 샘플을 다섯 분 동안 세 번 씻으십시오. 샘플은 일련의 증가된 에탄올 농도에서 추가로 탈수되고, 이어서 에탄올 수지 혼합물로 세포의 침윤이 뒤따른다.알코올 수지 믹스를 갓 준비된 순수한 수지로 교체하십시오. 적절한 크기의 임베딩 몰드를 갓 준비된 수지로 채 웁니다. 셀이 수지로 채워진 캐비티 위로 아래로 향하도록 커버슬립을 놓습니다.37도에서 24 시간 동안 수지를 경화하십시오. 그런 다음 적어도 이틀 동안 60도에서. 덮개의 바닥면에서 수지를 제거하십시오.슬래브를 액체 질소에 떨어 뜨린 다음 끓는 물로 옮깁니다. 유리는 분리되어야합니다. 필요한 경우 반복하십시오.조사된 시야는 디아미오노벤지딘 침착 및 DAB 염색으로 인해 명확하게 볼 수 있어야 한다. 쇠톱이나 다른 적절한 도구를 사용하여 슬래브에서 관심 영역을 잘라냅니다. 컷아웃을 울트라마이크로톰 단순 홀더에 넣습니다.최종 블록 트리밍을 위해 울트라 마이크로 톰을 설정하십시오. 면도날을 사용하여 피라미드 모양의 필렛을 준비하십시오. 피라미드 꼭대기에있는 평평한 면적의 크기는 약 400 x 200 미크론이어야합니다.준비된 피라미드를 울트라 마이크로 톰 암에 장착하고 칼을 설치하십시오. 섹션을 준비합니다. 단면 두께는 실험 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다.우리는 EM 단층 촬영을 목표로합니다. 그래서 우리는 250 나노 미터 두께의 섹션을 세미 씬 섹션이라고도합니다. 나이프 가장자리에서 섹션을 분리하여 슬롯 그리드에 장착합니다.우리는 슬롯 그리드를 사용했고, 그들은 한 밀리미터 둘레에 둥글고, 한 밀리미터의 측면 개구부가있었습니다. 작은 개구부 크기는 섹션의 더 나은 안정성을 제공합니다. 샘플을 그리드에서 말리십시오.현재 섹션은 관찰 할 준비가되었습니다. 그리드를 전자 현미경 샘플 홀더에 넣습니다. 샘플을 전자 현미경에 적재하십시오.틸트 시리즈를 획득합니다. 포유류 세포 핵에서의 복제 초점은 S상 진행에 따라 뚜렷한 분포 패턴을 나타낸다. 형광 표지된 아지드와의 클릭 반응에 의해 확인된 성공적인 EdU 라벨링은 글루타르알데히드가 상부에 고정된 후 이종 세포 집단에서 전형적인 복제 패턴을 입증한다.스트렙타비딘 라벨링은 글루타르알데히드에 의해 영향을 받을 수 있다. 그래서 먼저 스트렙타비딘 나노골드와 동일한 조건으로 염색한 스트렙타비딘 형광을 하단에 확인한다. 은 증진 절차의 좋은 결과는 바닥에 표시된 일부 핵과 매우 희미한 노란색 세포 플라스트 염색의 짙은 갈색 염색입니다.사전 임베딩 라벨링의 장점은 단면화를 위해 셀을 선택할 수 있다는 것이다. 이 단계에서는 라벨링 패턴이 밝은 현장 현미경으로 보이기 때문에 가능합니다. 적절한 레이블 지정으로 인해 잘 구분된 복제 사이트가 생성됩니다.화살촉은 DAB 염색된 크로마틴 섬유를 보여준다. 오른쪽의 배경 라벨링은 평방 미크론 당 몇 개의 나노 입자로 제한됩니다. 반박형 섹션은 단층 촬영을 할 준비가되어 있으며 금 나노 입자를 추가 할 필요가 없습니다.기술된 접근법은 복제가 가능한 부위에서 크로마틴 조직의 연구에 사용되었다. 크로마틴 분리의 고해상도 이미징을 포함하는 크로마틴의 복제 후 재배열 분석용. 또한 큰 염색체 도메인의 복제 표지 및 고차 크로마틴 폴딩 및 헤테로 크로마틴의 연구에 사용됩니다.이러한 이미징 기술은 또한 다른 비현미경적 접근법에 의해 생성된 데이터의 기준점으로서 중요하다. 이 방법은 또한 초해상도 기술을 포함하는 상관 관계된 현미경 연구에 수용될 수 있다. 이것은 크로마틴 고차 구조와 세포의 다양한 생리 학적 상태에서의 역학에 대한 연구에서 새로운 지평을 열어줍니다.

imaging-replicative-domains-ultrastructurally-preserved-chromatin

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

가까운 원시 상태에서 세균 세포의 ultrastructure 연구를 전자 cryotomography (요법)를 사용하는 방법을 우리는 "macromolecular"(~ 4 NM) 해상도, 여기를 보여줍니다.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

이 프로토콜, 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 보여 줍니다.

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 동기 재배, 형광 현미경 검사 법, 급속 한, 및 높은 모니터링 전압 cryo 전자 단층 촬영 사용 됩니다. 이러한 방법론에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 미래의 응용 프로그램 및 개발 논의.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

우리는 스캐닝 전자 현미경의 자동화 된 이미징 절차와 함께 배열 단층 촬영 샘플로 사용하기 위해 대형 전송 지원에 직렬 섹션의 리본과 컬렉션의 준비를 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 로컬, 희귀 한 이벤트의 스크리닝, 검색 및 표적 이미징및 대량 데이터 볼륨을 수집 할 수 있습니다.

스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

이 프로토콜은 고압 냉동(HPF)과 와플 방법, 극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 리프트아웃, 선량 대칭 병렬 채취를 통합하여 두꺼운 조직에 대한 냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)을 표준화하여, 쥐 해마에서 재 현 가능한 현장 분석을 위한 균일하게 얇은 층상과 유리화 표본을 제공합니다.

쥐 해마에서 입증된 두꺼운 조직을 위한 냉동 전자 단층촬영 워크플로우

처프 긴 noncoding RNAs의 게놈에 바인딩 사이트 (lncRNAs)를 매핑하는 소설 및 신속한 기술입니다. 방법은 lncRNA 바인딩된 게놈 사이트의 열거를 허용하는 안티 센스가 원래의 oligonucleotides의 특이성을 이용합니다.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

학습하세요 전자현미경을 이용한 크로마틴 복제 도메인 고해상도 이미징 방법을 EdU 및 Nanogold 라벨링을 통해 새로 합성된 DNA를 시각화하고 글루타르알데히드 고정으로 구조적 보존성을 유지합니다.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

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