Name: 면역조직화학을 위한 합성 항원 대조군 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 면역조직화학을 위한 합성 항원 대조군 제작 방법을 BSA 겔을 활용하여. 이 기술은 다양한 항원 농도에서 재현 가능한 표준을 만들어 실험실 간 검정법 표준화를 지원합니다.

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저자들은 펩티드 합성을 위한 제프리 톰과 아이민 송, TMA 구축을 위한 Nianfeng Ge, IHC 염색을 위한 Shari Lau, 디지털 현미경 스캐닝을 위한 Melissa Edick, 디지털 이미지 정량화를 위한 Hai Ngu를 감사하게 여긴다.

1. 원액 및 도구의 준비
<ol><li>50 mL 원뿔형 튜브에서 5 mL의 PBS, pH 7.2의 5 mL BSA 분말을 혼합하여 25% w/v BSA 용액 20 mL를 고르게 분산시킬 때까지 준비한다. BSA 분말을 분산시키기 위해 필요에 따라 소용돌이.<ol><li>완전한 용해를 허용하도록 용액을 4°C에서 하룻밤 동안 유지한다. PBS로 최종 부피를 20 mL로 조정하여 25% w/v 원액을 만든다.</li>
	</ol></li>
	<li>6.26 g BSA 분말을 PBS 13 mL에 혼합하고, pH 7.2를 50 mL 원뿔형 튜브에 혼합하여 31.3% w/v BSA 용액 20 mL를 고르게 분산시킬 때까지 준비한다. 완전한 용해를 허용하도록 용액을 4°C에서 하룻밤 동안 유지한다. PBS로 최종 부피를 20 mL로 조정하여 31.3% w/v 원액을 만든다.</li>
	<li>열 블록을 85°C로 예열합니다. 참고: 아래 프로토콜은 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 형성된 1.26-1.4mL의 부피를 가진 펩티드/BSA 젤을 생성합니다. 더 작은 부피를 사용하기 위해, 예를 들어, 항원 재고가 제한될 때, PCR 튜브에서 겔을 제조하고 열 블록으로서 85°C로 설정된 열사이클러를 사용한다.</li>
	<li>BSA/포름알데히드 혼합물이 25% BSA 용액 700μL와 37% 포름알데히드 700μL를 혼합하여 예상대로 겔을 형성하는지 시험한다. 5-10 초 이내에 5 번 위아래로 피펫팅하여 잘 섞으십시오. 기포를 만들지 마십시오. 주의: 농축된 포름알데히드는 독성이 있습니다. 적절한 안전 예방 조치와 함께 사용하십시오.</li>
	<li>BSA와 포름알데히드 용액을 혼합한 직후, 닫힌 마이크로원심분리 튜브를 85°C에서 10분 동안 열 블록에 놓는다. 열 블록에서 튜브를 제거하고 식히십시오. 젤이 예상대로 형성되었는지 확인합니다.</li>
</ol>2. 펩티드의 제조 및 희석
<ol><li>원하는 서열의 동결건조된 펩티드 5-20 mg을 얻는다. 참고: 4B5에 의해 인식되는 인간 ERBB2 세포내 도메인의 C 말단 16개 아미노산은 TPTAENPEYLGLDVPV-COOH이다.<ol><li>N-말단, 아세틸-YGSG, 및 C-말단에 4개의 아미노산을 추가하여, GSGC-아미드는 BSA에 대한 펩티드의 가교결합을 촉진하고 BSA 분자와 펩티드 에피토프 사이의 간격을 제공한다. 참고 : 완전한 서열은 다음과 같습니다 : 아세틸 - YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC - 아미드.</li>
		<li>원하는 경우, 코어 펩티드 에피토프를 연장시키기 위해 다른 N- 및 C-말단 아미노산 서열을 사용한다. 참고: 상이한 서열의 영향은 상이한 항체/에피토프 조합에 따라 변한다. C 말단 펩티드의 첨가는 C 말단 에피토프에 대한 일부 항체의 결합을 감소시킨다. 이러한 경우 이 시퀀스를 생략하십시오.</li>
		<li>상업적 공급원으로부터의 펩티드가 >95% 순도로 공급되는지를 확인하고, 그 조성은 HPLC 및 질량 분광법 분석에 의해 확인된다.</li>
	</ol></li>
	<li>5x (1.25 E-2 M) 펩티드 원액에 필요한 부피를 계산한다. 표 1을 참조하면, 컬럼 C-E는 항원 분자량(g/mole), 항원 순도 퍼센트(0-100) 및 항원 질량(mg)에 대한 값을 입력합니다. 참고: 1.25 E-2 M의 원액을 달성하기 위해 샘플을 재현탁시키기 위한 용매 (μL 단위)의 부피는 800 x 항원 분자량 x 퍼센트 항원 순도/항원 질량이다.<ol><li>여덟 개의 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브를 준비하고 명확하게 라벨을 붙인다. 참고: 튜브에는 용매에 5x 펩티드 스톡, 용매 중 1x 펩티드 스톡, 2.5 E-4 M ~ 2.5 E-8 M 펩티드/BSA/포름알데히드 젤의 5개의 10x 연속 희석액 및 추가 항원이 결여된 BSA/포름알데히드를 포함하는 음성 대조 겔이 포함됩니다. 모든 젤 샘플은 동일하게 보입니다. 한 번에 여러 세트의 펩티드 희석액을 준비 할 때는 모든 튜브와 가공 카세트를 올바르게 라벨링하고 식별해야합니다. 가능한 경우 색상으로 구분된 마이크로 원심분리 튜브 및 처리 카세트를 사용하여 오신을 최소화하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>동결건조된 펩티드 (ERBB2 펩티드에 대해 20 mg)의 전체 질량을 적절한 용매의 60 μL에 재현탁시킴으로써 1.25 E-2 M에서 5x 펩티드 원액을 제조하였다. 참고: 이 예에서는 디메틸포름아미드(DMF)가 공급업체의 컨테이너에 직접 추가되었습니다.<ol><li>용액을 검사하여 펩티드가 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 필요한 경우, 추가 용매를 첨가하고/하거나 펩티드가 완전히 용해될 때까지 샘플을 초음파 처리하여, 5x 펩티드 스톡에 대해 표 1 에 계산된 부피를 초과하지 않도록 주의한다. 주의: DMF는 독성이 있습니다. 적절한 예방 조치와 함께 사용하십시오. 참고: 아미노산 서열, 및 상응하는 소수성 및 전하에 따라, 펩티드는 DMF, 디메틸설폭사이드(DMSO), 순수한 물, 또는 아세트산, 포름산 또는 중탄산암모늄의 묽은 용액에 용해될 수 있다. 펩티드 특성은 다양한 온라인 도구(17)를 사용하여 계산될 수 있다. 일부 펩티드 공급업체는 특정 서열에 적합한 용매를 제안할 수 있다.</li>
		<li>필요에 따라 용매를 첨가하여 5x 펩티드 스톡의 부피를 표 1에서 계산된 최종 부피로 가져온다. 5 s 동안 소용돌이 및 5 초 동안 5000 x g 에서 실온에서 원심분리. 펩티드 스톡 용액은 -80°C에서 저장될 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>표 2를 참조하면, 컬럼 C는, 5x 펩티드 스톡 30 μL를 용매 (DMF가 예: DMF)에 희석하여 150 μL의 1x 펩티드 원액 ( 2.5 E-3 M)을 제조하였다. 5 s 동안 소용돌이 및 5 초 동안 5000 x g 에서 실온에서 원심분리.</li>
	<li>표 2를 참조하면, 컬럼 D는 1x 펩티드 스톡 140 μL를 31.3% BSA/PBS, pH 7.2의 560 μL로 희석하여 700 μL의 5 E-4 M 펩티드/BSA 용액 (희석 1)을 준비한다. 5 s 동안 소용돌이 및 5 초 동안 5000 x g 에서 실온에서 원심분리. 참고: 이 용액의 최종 BSA 농도는 25%(w/v)입니다.</li>
	<li>표 2를 참조하면, 컬럼 E-H는 25% BSA/PBS, pH 7.2의 630 μL에 펩티드/BSA 용액 70 μL를 첨가함으로써 5 E-4 M 펩티드/BSA 스톡의 4개의 연속 10x 연속 희석물을 준비한다. 5 s 동안 소용돌이 및 5 초 동안 5000 x g 에서 실온에서 원심분리. 참고: 이 단계 후, 25% BSA/PBS, pH 7.2에서 펩티드 (5 E-4 M 내지 5 E-8 M)의 5개의 10배 연속 희석이 있을 것이다. 처음 네 개의 샘플은 630 μL를 함유한다. 마지막 샘플은 700 μL를 함유할 것이다.</li>
	<li>표 2를 참조하면, 컬럼 I, 25% BSA/PBS, pH 7.2의 700 μL를 함유하는 음성 대조군 BSA 샘플을 제조하였다(도 1A).</li>
</ol>3. BSA 펩타이드 젤 제조
<ol><li>열 블록 또는 열순환기가 85°C에서 안정한지 확인합니다.</li>
	<li>표 3, 열 B-E를 참조한다. 한 번에 하나의 샘플을 작동시키고, 37% 포름알데히드의 첫 번째 25% BSA/펩티드 샘플 (희석 1) 630 μL에 첨가한다. 5-10 초 이내에 5 번 위아래로 피펫팅하여 잘 섞으십시오. 기포를 만들지 마십시오. 주의: 농축된 포름알데히드는 독성이 있습니다. 적절한 안전 예방 조치와 함께 사용하십시오.<ol><li>펩티드/BSA와 포름알데히드 용액을 혼합한 후, 닫힌 마이크로원심분리 튜브를 85°C의 열 블록에 10분 동안 놓는다. 참고: BSA 펩티드 용액과 포름알데히드를 완전히 혼합하되, 샘플을 열에 놓기 전에 혼합물을 피펫팅하는 데 10초 이상을 소비하지 마십시오. 포름알데히드 가교결합이 즉시 시작되기 때문에, 절차가 상이한 샘플에 대해 변화되는 경우 겔이 다르게 형성될 수 있다. 이 젤의 최종 BSA 농도는 12.5 % (w / v)입니다. 최종 BSA 농도가 10% 미만이면 고화되지 않는 겔을 수득할 수 있고; 16%를 초과하는 최종 BSA 농도는 처리 후 더 부서지기 쉽고 절편하기 어려운 겔을 생성할 수 있다.</li>
		<li>각 희석액 2-4에 대해 단계 3.2 및 3.2.1을 반복한다.</li>
		<li>희석 5에 대해 단계 3.2 및 3.2.1을 반복하되, 700 μL의 37% 포름알데히드를 첨가하되, BSA 항원 용액의 700 μL와 동일한 부피를 첨가한다.</li>
		<li>표 3 컬럼 G를 참조; 음성 대조군 샘플에 대해 3.2 및 3.2.1 단계를 반복하고, 700 μL의 37% 포름알데히드, 700 μL의 음성 대조군 BSA 용액과 동일한 부피를 첨가한다.</li>
	</ol></li>
	<li>10-12 분 후에 열 블록에서 튜브를 제거하십시오. 가열 시간은 각 샘플에 대해 가능한 한 일관되어야합니다. 젤을 벤치탑에서 5-10분 동안 식히십시오(그림 1B).</li>
	<li>깨끗하고 유연한 일회용 실험실 주걱을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에서 한 조각의 겔 샘플을 제거하고 각 샘플에 대해 NBF의 별도의 용기를 사용하여 적어도 15 mL의 중성 완충 포르말린 (NBF)을 함유 한 밀폐 용기에 넣으십시오.<ol><li>또는 새로운 단일 에지 면도날로 마이크로 원심분리 튜브의 바닥을 차단하고 공기 또는 적절한 프로브로 바닥에서 젤을 밀어냅니다 (그림 1C-G). 참고: 고형화된 포름알데히드/BSA 젤은 실온에서 최대 24시간 동안 마이크로원심분리 튜브에 남아있을 수 있습니다. 겔을 24 시간 이상 마이크로 원심분리 튜브에 방치하면 부서지기 쉽고 처리 및 절편이 더 어려워 질 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. BSA 젤 트리밍, 가공 및 임베딩
<ol><li>깨끗한 단일 가장자리 면도기를 사용하여 젤 콘을 약 5mm 두께의 원통형 디스크로 다듬습니다(그림 1H,I). 디스크를 생검 랩으로 감싸고, 하나의 큰 겔 디스크를 하나의 카세트(단계 5의 파일럿 연구에 사용됨)에 넣고, 나머지 겔 디스크를 함께 두 번째 카세트(그림 2A,E)에 넣어 6단계에서 조직 마이크로어레이(TMA) 구축에 사용합니다. 포장된 젤 디스크를 명확하게 라벨이 붙은 조직 처리 카세트에 넣으십시오.<ol><li>카세트화된 겔을 처리 전에 겔 샘플 당 적어도 10% NBF의 적어도 15 mL에 넣고, 각 샘플에 대해 NBF의 분리된 용기를 사용한다. 젤은 6-48 시간 동안 10 % NBF에 남아있을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>겔을 자동화된 조직학 조직 프로세서에서 처리하고, 압력과 진공으로 큰 조직 스케줄을 따른다. 각 단계는 1 시간이 걸립니다 : 10 % NBF, 70 % 에탄올, 95 % 에탄올 (두 번 반복), 100 % 에탄올 (두 번 반복), 자일렌 (세 번 반복), 파라핀 60 °C (세 번 반복). 참고: 샘플을 수동으로 처리하기로 선택한 조사관의 경우 동일한 시약 및 시간 순서를 따르십시오.</li>
	<li>샘플 처리가 완료되면 조직 처리기에서 카세트를 제거하고 파라핀 임베딩 센터로 옮깁니다.</li>
	<li>생검 랩에서 젤을 풀고 파라핀에 젤을 내장하십시오. 각 샘플에 대해 하나의 젤 디스크를 작은 15mm x 15mm 몰드에 내장하고 나머지 젤 디스크를 두 번째로 큰 몰드에 함께 내장합니다(그림 2F-H). 하나의 샘플을 갖는 첫 번째 블록은 파일럿 연구에서 펩티드 겔을 시험하는데 사용될 것이다. 두 번째 블록은 TMA 구성에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 펩티드 희석 계열의 파일럿 평가
<ol><li>각 펩티드 희석 시리즈에 대해, 총 6개의 개별 섹션, 즉 다섯 개의 희석 시리즈 샘플 각각으로부터 하나의 섹션과 BSA 전용 음성 대조군 샘플로부터의 한 섹션을 포함하는 두 개의 유리 슬라이드를 만들 계획이다.<ol><li>첫 번째 유리 슬라이드 상에, 세 개의 가장 높은 펩티드 농도 (2.5 E-4 M 내지 2.5 E-6 M)를 갖는 하나의 겔 디스크를 함유하는 각각의 더 작은 블록으로부터 하나의 4 μm 두께의 섹션을 절단한다.</li>
		<li>두 번째 슬라이드 상에, BSA 전용 대조군 블록으로부터 2개의 가장 낮은 펩티드 농도(2.5 E-7 M 및 2.5 E-8 M)와 하나의 섹션으로 각 블록으로부터 하나의 4 μm 두께의 섹션을 절단한다. 슬라이드에 샘플의 순서를 기록합니다. 참고 : 파라핀 임베디드 젤이 부드럽게 절단되어 조각화, 찢어짐 또는 수다스러운 유물없이 균일 한 섹션을 생성 할 것으로 기대하십시오. 특정 파라핀 포매된 겔 샘플이 절편화하기 어려운 경우, 절편화하기 전에 블록면을 빙냉 증류수에 간단히 담그십시오. 필요한 경우 다른 담금질 시간 또는 다른 용액 (예 : 암모니아수)으로 실험하십시오.</li>
		<li>절편화 후, 슬라이드를 실온 (약 23°C)에서 24시간 동안 건조시키고, 이어서 30분 동안 60°C로 건조시켰다.</li>
	</ol></li>
	<li>각 펩티드에 대해 제조된 두 슬라이드를 표준 IHC 프로토콜에 따라 원하는 항체로 염색시킨다. 참고: 이 데모에서 토끼 모노클로날 4B5에 사용된 슬라이드 상의 1차 항체 농도는 1.5ug/mL였다.<ol><li>각 겔 섹션 내에서 비교적 균일한 신호를 볼 것으로 예상되며, 상이한 겔 샘플은 펩티드 희석액에 상응하는 신호 강도의 범위를 나타낸다.</li>
	</ol></li>
	<li>파일럿 연구에 대한 결과가 만족스러우면, 프로토콜의 다음 단계에 기재된 바와 같이, 상이한 농도의 펩티드 항원을 함유하는 겔 공여체 블록으로부터 TMA를 작제한다.</li>
</ol>6. BSA 젤 TMA 구조
<ol><li>BSA 겔 단독을 함유하는 공여체 블록으로부터의 중복된 1 mm 직경 코어를 함유하는 조직 마이크로어레이 및 ERBB2 펩티드의 다섯 희석물을 모두 함유하는 BSA 겔을 구축한다. 주: 원하는 경우, 추가적인 음성 대조군으로서 비표적 펩티드의 동일한 다섯 희석물을 함유하는 BSA 겔을 포함한다. 원하는 경우, 양성 대조군으로서 대표적인 ERBB2 발현 세포주의 코어를 포함한다.</li>
	<li>TMA의 4 μm 두께의 절편을 절단하고 실험실 표준 프로토콜에 따라 1.5 ug / mL의 항 ERBB2 / HER2 / neu 토끼 모노클로날 4B5 ( 재료 표 참조)로 염색하십시오.</li>
	<li>결과 얼룩 강도를 검사에 의해 정성적으로 또는 디지털 이미지 스캐닝 및 분석을 통해 정량적으로 평가합니다(그림 3A,B). 참고: 디지털 이미지 분석이 이 프로토콜의 초점이 아니므로 이러한 단계는 독자가 원하는 대로 수행할 수 있도록 남아 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

Charles A. Havnar, Kathy J. Hötzel, Charles A. Jones, Carmina M. Espiritu, Linda K. Rangell 및 Franklin V. Peale은 Genentech와 Roche의 직원 및 주주입니다. 그들의 계열사는이 연구에 사용 된 시약 및 도구를 생산합니다.

이 방법을 통해 사용자는 대부분의 조직학 실험실에 익숙한 재료 및 기술을 사용하여 IHC 반응의 표준으로 알려진 조성 및 항원 농도의 균일 한 샘플을 만들 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 관심있는 항체가 결합하는 에피토프를 확인하는 것이다. 이 프로토콜은 ERBB2/HER2 ICD로부터의 선형 펩티드 항원을 사용하는 것을 기술한다. 동일한 프로토콜이 올리고뉴클레오티드, 형광 표지, 단백질 도메인, 또는 전장 단백질을 함유하는 BSA 겔을 형성하는데 사용될 수 있다. 이러한 후자의 접근법은 단일 선형 펩티드 서열에 의해 재생성되지 않는 형태적 에피토프에 결합하는 항체에 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 마우스, 래트 및 토끼의 0.1 mg/mL 순진한 IgG를 함유하는 BSA 겔 표준은 이차 검출 및 염색 단계가 예상대로 작동하였음을 확인하기 위한 공정 대조군으로 사용될 수 있다.
여기에 기재된 항원-BSA 겔 방법은 IHC 반응을 제어하고 표준화하기 위한 다른 기술을 보완한다....

면역조직화학(IHC)은 포르말린-고정, 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편에서 표적 항원의 민감하고 특이적이며 공간적으로 정밀한 검출을 가능하게 한다. 그러나, IHC 염색 결과는 온온 및 냉 허혈 시간, 조직 고정, 조직 전처리, 항체 반응성 및 농도, 분석 검출 화학, 및 반응 시간1을 포함하는 다수의 변수에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, IHC 반응의 재현 가능한 성능 및 해석은 이들 변수의 엄격한 제어와 잘 특성화된 양성 및 음성 대조군 샘플의 사용을 필요로 한다. 자주 사용되는 대조군에는 관심 항원을 발현하는 독립적인 분석으로부터 공지된 파라핀 포매된 조직 또는 배양된 세포주가 포함되지만, 이러한 샘플이 항상 이용가능한 것은 아니다1. 더욱이, 조직 및 세포주 조절에서 표적 항원의 발현 수준은 일반적으로 단지 정성적으로만 이해되고 가변적일 수 있다. 재현 가능하고 정확하게 알려진 표적 항원 농도를 함유하는 대조군은 IHC 반응 조건의 최적화를 보조할 수 있다. 합성 IHC 대조군 샘플을 생성하기 위해 생리학적으로 관련된 농도 범위에서 다양한 항원 유형에 적응할 수 있는 일반적인 방법이 저자2에 의해 기술되었다. 이러한 유형의 표준을 만들고 사용하기 위해 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.
적절한 조절은 IHC 검정 1,3,4의 유효한 해석을 위해 필수적이다. 조직, 배양된 세포 및 펩티드-코팅된 기질은 조사자의 특정 필요에 따라 IHC 대조군으로 사용되었다. IHC 대조군으로서 조직을 사용하는 데 내재된 이점과 한계는 광범위하게 논의되었다 1,4. 많은 항체의 경우, 적절한 대조군은 넓은 동적 범위에 걸쳐 표적 항원을 발현하는 세포 집단을 함유하는 선택된 정상 조직으로부터 선택될 수 있다. 조직 조절은 표적 항원이 발현 부위 또는 풍부함에 관하여 잘 특성화되지 않을 때, 또는 잠재적으로 교차-반응하는 항원이 동일한 세포 또는 조직 부위에서 공동-발현될 때 덜 적합하다. 이러한 맥락에서, 관심있는 항원을 발현하는 배양된 세포주의 블록이 도움이 될 수 있다. 표적 특이성의 추가의 증거를 제공하기 위해, 세포주는 표적 항원을 과발현 또는 과발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 접근법은 최근에 PD-L1 항원5의 범위를 발현하는 원형 세포주의 조직 마이크로어레이를 사용하여 다양한 항-PD-L1 검정을 평가하는데 사용되었다. 세포주 블록의 일상적인 사용에 대한 실질적인 제한은 충분한 세포 수를 생산하는데 필요한 비용 및 시간 및 일부 항원의 발현이 클론 세포주 내에서도 신뢰성 있게 일관되지 않을 수 있다는 사실을포함한다(6). 합성 펩티드는 짧은 선형 에피토프를 인식하는 항체에 대한 IHC 조절을 위한 세 번째 옵션이다. 스티븐 보겐 (Steven Bogen)과 동료들은 유리 슬라이드 7,8 및 유리 비드9의 표면에 결합 된 펩타이드의 사용에 대해 광범위하게 발표했습니다. 이 그룹의 한 연구는 펩티드 기반 IHC 대조군의 정량 분석이 병행10에서 분석 된 조직 대조군의 정성적 평가에 의해 놓친 염색 과정 변화를 검출 할 수 있음을 보여주었습니다. 비드 기반 항원을 사용하는 표준이 널리 적용될 수 있지만, 많은 세부 사항은 저자에게 독점적이어서 광범위한 채택을 제한합니다.
IHC 표준에 대한 또 다른 접근법은 표적 항원을 인위적으로 생성 된 단백질 겔에 통합합니다. 이 개념은 1972 년 Per Brandtzaeg에 의해 글루타르 알데히드11을 사용하여 정상적인 토끼 혈청을 중합 한 연구에서 처음 입증되었습니다. 이어서, 생성된 겔의 작은 블록들을 다양한 농도에서 관심있는 면역글로불린 항원을 함유하는 용액에 1-4주 동안 담갔다. 알콜 고정 및 파라핀 임베딩 후, 생성된 대조군의 절편은 그들이 담근 항원 용액의 로그에 상응하는 강도로 염색되는 것으로 나타났다. 나중에, 연구자들은 면역 전자 현미경 연구12,13에서 양성 대조군으로 희석 된 BSA 또는 뇌 균질 용액에서 특정 아미노산의 글루타르 알데히드 접합체를 준비했습니다. 보다 최근의 연구는 질량 분광법 분석14에서 FFPE 조직에 대한 대리자로서 포름 알데히드 고정 단백질 용액으로 만든 젤의 사용을 조사했다. 최근의 또 다른 연구는 인간 또는 소 혈청 알부민 용액을 다양한 농도 및 pH15로 가열하여 형성된 겔의 구조 및 특성을 조사했습니다. 이 저자들은 혈청 알부민이 실험 조건에 따라 기계적 탄력성, 이차 구조 보존 및 지방산 결합 능력이 다른 세 가지 유형의 젤을 형성한다는 것을 발견했습니다. 함께,이 논문들은 여기에 사용 된 접근법의 일반적인 타당성을 보여줍니다. 정의된 조성물의 단백질 용액은 일상적인 조직학적 방법을 사용하여 추가로 처리, 절편화 및 염색될 수 있는 조직형 겔을 생성한다.
이 프로토콜은 열 및 포름알데히드로 중합된 소 혈청 알부민 (BSA)으로부터 제조된 합성 IHC 대조군의 형성을 기술한다. 겔은 전장 단백질, 단백질 도메인 및 선형 펩티드뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드2를 포함하는 비단백질 항원을 포함하는 매우 다양한 항원을 혼입할 수 있다. 본 실증은 인간 ERBB2 (HER2/neu) 단백질 TPTAENPEYLGLDVPV-COOH의 C 말단 16개 아미노산을 코딩하는 선형 펩티드의 예시적인 항원을 사용한다 (표 문헌 참조). 이 서열은 허셉테스트 폴리클로날 시약 (ENPEYLGLDVP) 및 모노클로날 항체 CB11 (AENPEYL) 및 4B5 (TAENPEYLGL) (표 문헌 참조)16을 포함하는 세 개의 상업적으로 입수가능한, 진단적으로 관련된 항체에 의해 인식되는 에피토프를 포함한다.
여기에서 입증 된 방법은 모든 조직학 실험실에 익숙한 프로세스와 기술을 사용하여 쉽게 사용할 수있는 시약을 사용합니다. 가장 중요한 한계는 표적 항원을 동정하고 구매할 필요성이며, 이는 많은 경우에 비교적 적은 비용으로 달성될 수 있다. 이러한 합성 제어는 완전히 정의 된 구성이며 간단한 방법으로 만들어지기 때문에 재현 가능한 결과로 많은 실험실에서 구현할 수 있습니다. 이들의 사용은 IHC 염색 결과의 객관적이고 정량화 가능한 평가를 촉진하고 실험실 내 및 실험실 간 재현성을 더 크게 허용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td><td>Ventana</td><td>5278368001</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Wraps</td><td>Leica</td><td>3801090</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>BSA #9998</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔</td>형 <td>튜브 Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>일회용 베이스 몰드 (15 mm x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>일회용 베이스 몰드 (24 mm x 24 mm)</td><td>Fisher</td><td>22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>일회용 주걱</td><td>VWR</td><td>80081-188</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15686</td><td></td></tr><tr><td>ERBB2 / HER2 펩타이드</td><td></td><td></td><td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td></tr><tr><td>Leica Autostainer XL</td><td>Leica</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stir Bar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT 전체 슬라이드 이미저</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 마이크로퓨지 튜브 1.5mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라플라스트 파라핀</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>펩타이드 매개변수 계산기</td><td>Pep-Calc17</td><td>https://www.pep-calc.com/</td><td></td></tr> <tr><td>펩타이드 공급업체</td><td>ABclonal Science</td><td></td><td>사용자는 질량, 순도 및 비용에 대한 자세한 내용은 펩타이드 공급업체에 문의해야 합니다.</td></tr><tr><td></td><td>Anaspec 펩타이드</td><td></td><td>사용자는 질량, 순도 및 비용에 대한 자세한 내용을 위해 펩타이드 공급업체에 문의해야 합니다.</td></tr><tr><td></td><td>CPC Scientific</td><td></td><td>사용자는 질량, 순도 및 비용에 대한 자세한 내용은 펩타이드 공급업체에 문의해야 합니다.</td></tr><tr><td></td><td>뉴잉글랜드 펩티드</td><td></td><td>사용자는 질량, 순도 및 비용에 대한 자세한 내용은 펩타이드 공급업체에 문의해야 합니다.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>시약 알코올</td><td>Thermo Scientific</td><td>9111</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Razor</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 양전하 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>6776214</td><td></td></tr><tr><td>TMA Tissue Grand Master</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td></td></tr></tbody></table>

면역조직화학을 위한 합성 항원 대조군

Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

면역조직화학(IHC) 분석은 단백질 발현 패턴에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며, 이에 대한 신뢰할 수 있는 해석은 잘 특성화된 양성 및 음성 대조군 샘플을 필요로 합니다. 적절한 조직 또는 세포주 조절이 항상 이용 가능한 것은 아니기 때문에, 합성 IHC 대조군을 생성하는 간단한 방법이 유익할 수 있다. 이러한 방법은 여기에 설명되어 있습니다. 단백질, 펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한 다양한 항원 유형에 광범위한 농도로 적응할 수 있다. 이 프로토콜은 다양한 진단적 관련 항체에 의해 인식되는 인간 적혈구 종양유전자 B2 (ERBB2/HER2) 세포내 도메인 (ICD)으로부터의 펩티드를 예로서 사용하여 합성 항원 조절을 생성하는 데 필요한 단계를 설명한다. 소 혈청 알부민 (BSA) 용액에서 HER2 ICD 펩티드의 연속 희석물을 포름알데히드와 혼합하고 85°C에서 10분 동안 가열하여 펩티드/BSA 혼합물을 응고시키고 가교시킨다. 생성된 겔은 조직처럼 처리, 절편화 및 염색될 수 있고, 광범위한 염색 강도에 걸쳐 공지된 항원 농도의 일련의 샘플을 산출한다.
이 간단한 프로토콜은 일상적인 조직학 실험실 절차와 일치합니다. 상기 방법은 단지 사용자가 원하는 항원의 충분한 양을 가질 것을 요구한다. 관련 에피토프를 인코딩하는 재조합 단백질, 단백질 도메인, 또는 선형 펩티드는 국부적으로 또는 상업적으로 합성될 수 있다. 사내 항체를 생성하는 실험실은 합성 대조군 표적으로서 면역화 항원의 분취량을 예비할 수 있다. 광범위한 농도에 걸쳐 잘 정의된 양성 대조군을 만들 수 있는 기회를 통해 사용자는 실험실 내 및 실험실 간 분석 성능을 평가하고, 분석의 동적 범위와 선형성에 대한 통찰력을 얻고, 특정 실험 목표에 맞게 분석 조건을 최적화할 수 있습니다.

펩티드는 실온에서 적절한 용매에 전적으로 용해되어 광학적으로 투명한 용액을 형성해야 한다. 가시적 미립자 물질이 30-60분 후에도 여전히 존재하는 경우, 표 1에서 계산된 5x 펩티드 원액의 의도된 부피를 초과하지 않는 원래의 용매 또는 대체 용매의 추가 부피를 첨가하는 것이 도움이 될 수 있다. 마찬가지로 결합된 펩티드/BSA 용액은 반투명하게 유지되어야 합니다(그림 1A).
펩티드/BSA 겔 샘플은 37% 포름알데히드로 가열한 후 불투명한 고무 덩어리를 형성해야 합니다(그림 1B-I). 겔 샘플의 경미한 파쇄는 마이크로원심분리 튜브로부터 제거하는 동안 발생할 수 있다(도 3A). 이것들은 후속 단계를 방해해서는 안됩니다. 파라...

이 작업은 면역 조직 화학을위한 합성 항원 대조군을 만드는 간단한 방법을 문서화합니다. 이 기술은 광범위한 농도에서 다양한 항원에 적응할 수 있다. 샘플은 인트라 및 인터-어세이 성능 및 재현성을 평가하기 위한 참조를 제공한다.

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

BSA 항원 겔은 기존 대조군을 보완할 수 있는 잘 특성화된 재현 가능한 IHC 표준물질입니다. 이 프로토콜은 표준 조직학 및 IHC 시약 및 방법을 사용하여 알려진 조성의 재현 가능한 표준을 만듭니다. 이러한 제어는 여러 실험실에서 진단적으로 관련된 많은 분석에 대해 IHC 분석을 교정하고 표준화할 수 있는 기회를 제공합니다.펩티드 또는 단백질을 용해시키기에 적합한 용매를 찾는 것이 중요하다. 기포를 도입하지 않고 항원과 포름알데히드 용액을 빠르게 혼합하는 것은 까다로울 수 있습니다. 시작하려면 고르게 분포 될 때까지 50 밀리리터의 원추형 튜브에 14 밀리리터의 PBS에 5 그램의 BSA 분말을 혼합하여 25 중량 % BSA 용액 20 밀리리터를 준비하십시오.용액을 와동시켜 BSA 분말을 용해시킨다. 완전히 용해되도록 용액을 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오. 다음날 PBS를 사용하여 최종 부피를 20 밀리리터로 조정하십시오.유사하게, 13 밀리리터의 PBS에 6.26 그램의 BSA 분말을 혼합하여 31.3 중량% 중량% BSA 용액 20 밀리리터를 준비합니다. 완전한 용해를 위해 밤새 배양 한 후 PBS로 최종 부피를 20 밀리리터로 조정하십시오. BSA 포름알데히드 혼합물이 겔을 형성하는지 테스트하려면 열 블록을 섭씨 85도로 예열합니다.그런 다음 700 마이크로 리터의 25 % BSA 용액과 700 마이크로 리터의 37 % 포름 알데히드를 혼합하십시오. 기포를 만들지 않고 5-10초 이내에 5회 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다. 혼합 직후 닫힌 마이크로 원심 분리기 튜브를 섭씨 85도로 예열된 열 블록에 놓습니다.10 분 후 열 블록에서 튜브를 제거하십시오. 식히고 젤이 예상대로 형성되었는지 확인하십시오. 8개의 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하고 명확하게 라벨을 붙입니다.이어서, 5x 펩티드 원액을 제조하고, 자유화된 펩티드의 전체 질량을 60 마이크로리터의 적절한 용매에 재현탁시켜 12.5 밀리몰 농도를 첨가한다. 펩타이드가 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 용액을 관찰하십시오. 그런 다음 필요에 따라 용매를 추가하여 펩타이드 분자량, 질량 및 순도에 따라 12.5 밀리몰 용액을 만듭니다.이 예에서, 5x 펩티드 스톡은 626.9 마이크로리터의 최종 부피를 갖는다. 다른 펩타이드 샘플은 다른 최종 부피를 필요로 할 것이다. 다음으로, 1x 펩티드 스톡 용액 150 마이크로리터를 준비하고, 5x 펩타이드 스톡 30 마이크로리터를 120 마이크로리터의 용매로 희석하여 2.5 밀리몰 농도를 첨가한다.용액을 5 초 동안 와동시키고 실온에서 원심 분리합니다. 다음으로, 1x 펩타이드 스톡 140마이크로리터를 31.3%BSA 용액 560마이크로리터로 희석하여 0.5밀리몰 펩타이드 BSA 용액 700마이크로리터를 준비합니다. 볼텍싱 후 실온에서 용액을 원심분리합니다.유사하게, 25% BSA 용액의 630 마이크로리터에 70 마이크로리터의 펩티드 BSA 용액을 첨가하여 펩티드 BSA 스톡의 4개의 연속 10x 연속 희석을 준비합니다. BSA 펩타이드 젤을 준비하려면 펩타이드 BSA 희석액에 37%포름알데히드를 한 번에 하나의 샘플씩 작동하는 1:1 비율로 첨가합니다. 기포를 만들지 않고 5-10초 이내에 5회 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.혼합 후 닫힌 마이크로 원심 분리기 튜브를 섭씨 85 도의 열 블록에 10 분 동안 놓습니다. 모든 펩타이드 BSA와 포름알데히드 용액을 준비하고 가열한 후 겔을 벤치탑에서 5-10분 동안 식힙니다. 다음으로, 깨끗하고 유연한 일회용 실험실 주걱을 사용하여 마이크로 원심 분리기 튜브에서 겔 샘플을 한 조각으로 제거합니다.적어도 15 밀리리터의 중성 완충 포르말린을 함유하는 밀봉 용기에 넣고, 각 샘플에 대해 별도의 용기를 사용한다. 또는 새로운 단일 모서리 면도날을 사용하여 마이크로 원심 분리기 튜브의 바닥을 잘라 내고 공기 또는 적절한 프로브로 바닥에서 젤을 밀어냅니다. 깨끗한 단일 날이 있는 면도기를 사용하여 겔 콘을 약 5mm 두께의 원통형 디스크로 자릅니다.디스크를 생검 랩으로 감싼 후 하나의 큰 젤 디스크를 하나의 카세트에 넣고 나머지 젤 디스크를 함께 두 번째 카세트에 넣어 조직 마이크로 어레이 구성에 사용합니다. 처리하기 전에 각 샘플에 대해 별도의 용기를 사용하여 젤 당 최소 15 밀리리터의 10 % 중성 완충 포르말린에 카세트 젤을 넣으십시오. 다음으로, 자동화된 조직학 조직 프로세서에서 압력과 진공으로 큰 조직 일정에 따라 젤을 처리합니다.샘플 처리가 완료되면 티슈 프로세서에서 카세트를 제거하고 파라핀 임베딩 센터로 옮깁니다. 생검 랩에서 젤을 개봉 한 후 젤을 파라핀에 삽입하거나 각 샘플에 젤 디스크 하나를 작은 15 x 15mm 몰드에 삽입합니다. 그리고 나머지 젤 디스크는 두 번째 더 큰 금형에서 함께 디스크됩니다.각 펩타이드 희석 시리즈에 대해 총 6개의 개별 섹션을 포함하는 2개의 유리 슬라이드를 만듭니다. 5개의 희석 시리즈 샘플 각각으로부터의 하나의 섹션 및 BSA 전용 음성 대조군 샘플로부터의 하나의 섹션. 슬라이드를 절편하고 건조시킨 후, 각각의 펩티드에 대해 준비된 2개의 슬라이드를 원하는 1차 항체로 염색한다.표준 면역 조직 화학 프로토콜에 따르면 각 겔 섹션 내에서 비교적 균일 한 신호를 볼 것으로 예상됩니다. 상이한 겔 샘플은 펩티드 희석물에 상응하는 신호 강도의 범위를 나타낸다. BSA 겔 조직 마이크로어레이 구축을 위해 조직 마이크로어레이의 4마이크로미터 두께 섹션을 절단하고 실험실 표준 프로토콜에 따라 토끼 단일클론 항체로 염색합니다.검사를 통해 결과 얼룩 강도를 정성적으로 평가하거나 정량적으로 디지털 이미지 스캐닝 및 분석을 구입합니다. 적절한 항체와 반응한 후, 음성 대조군 BSA 겔 샘플만이 최소한의 신호를 보였다. 개별 겔 샘플의 신호 강도는 비교적 균일하며 항원 농도가 증가함에 따라 증가합니다.MDA-MB-175 세포의 10 % 이상이 희미하고 완전히 원주 막 염색을 보입니다. 대조적으로, SKBR-3 세포의 10% 이상은 강렬한 완전 원주 막 염색을 보여줍니다 포름알데히드가 첨가되면 용액이 실온에서도 겔화되기 시작하기 때문에 빠르게 작동합니다. 우리는 이 방법을 사용하여 새로운 항체를 테스트할 때 IHC 대조군을 만들어 테스트 항체가 신호를 나타내지 않는 경우에도 분석이 예상대로 수행되었다는 확신을 줍니다.조직 또는 세포주 제어는 본질적으로 가변적입니다. 합성 항원 제어를 통해 특정 ISD 반응 조건 변화의 효과를보다 정확하게 측정 할 수 있습니다.

synthetic-antigen-controls-for-immunohistochemistry

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기에서는 포르말린 고정, 파라핀 포매 쥐 중추신경계(CNS) 및 말초 림프절(LN) 조직 절편에서 이중 면역 염색을 위한 최적화되고 상세한 프로토콜을 제시합니다.

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여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

동일한 숙주 종으로부터의 1차 항체를 사용하여 멀티플렉스 면역염색을 위해 여러 가지 다른 방법이 확립되었다. 여기서, 우리는 포르말린 고정 파라핀 내장 마우스 부신 절편에서 멀티플렉스 면역 염색 동안 항체 교차 반응성을 차단하기 위해 마이크로파 매개 항체 스트리핑 및 플루오로포폴-티라미드의 사용을 설명한다.

마우스 부신에 멀티플렉스 면역 염색을 위한 마이크로 웨이브 및 플루오로포어 티라미드 - 동일한 숙주 종에서 분리되지 않은 1 차 항체를 사용하여

여기에 제시된 것은 면역 조직 화학을위한 포르말린 고정, 파라핀 내장 세포 펠릿 제어를 생성하기위한 프로토콜입니다.

포르말린 고정, 파라핀 포매 세포 펠릿 면역조직화학 대조군을 위한 표준화된 공정

적출된 적혈구의 단백질 활성화의 동적 변화를 포착하는 것은 추후 평가를 위해 급성 자극에 대한 동적 변화를 보존하는 것과 같은 방법론적 문제를 제기합니다. 제시된 프로토콜은 관련 단백질 변화의 보존 및 분석과 후속 검출을 가능하게 하는 샘플 준비 및 염색 기술을 설명합니다.

적혈구 단백질의 동적 변화에 대한 면역염색 기반 검출

이 실험 프로토콜은 주로 단일 채널 항체 배양 조건을 최적화하고 항체 및 채널의 설정을 조정하여 임상 기원 폐암 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결함으로써 다중 면역조직화학(IHC) 염색 방법을 설명하고 최적화합니다.

파라핀 포매된 폐암 조직을 위한 다중 면역조직화학 염색

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

배우세요 면역조직화학을 위한 합성 항원 대조군 제작 방법을 BSA 겔을 활용하여. 이 기술은 다양한 항원 농도에서 재현 가능한 표준을 만들어 실험실 간 검정법 표준화를 지원합니다.

면역조직화학을 위한 합성 항원 대조군

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