형광 표기 매크로피노좀의 정량화를 위한 자동화된 이미징 및 분석

Macropinocytosis는 암 대사를 포함하여 세포 과정의 각종을 위해 중요한 내세포 통로입니다. 이 프로토콜을 사용하면 체외에서 세포에서 거시성 세포증의 범위를 정량화할 수 있습니다. 자동화는 재현성, 생산성 을 극대화하고 실험적 변화를 줄이는 것을 목표로합니다.

더욱이, 형광 현미경 검사는 실험적 품질을 결정하고 추가 매크로 피노좀 특성을 평가하기 위해 샘플을 육안으로 검사 할 수 있습니다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 체스카 마리 갈라파테, 내 실험실에서 연구 조수가 될 것입니다. 커버슬립 포맷이 있는 24웰 플레이트의 경우, 집게를 사용하여 에탄올 욕조에서 하나의 커버슬립을 잡습니다.

커버슬립을 플레이트 내부 벽에 탭하여 과도한 에탄올을 제거하고 커버슬립을 우물 바닥에 평평하게 놓습니다. 에탄올이 증발한 후, 커버슬립을 DPBS로 두 번 씻은 다음 각 웰에 셀 서스펜션의 500 마이크로리터를 추가하여 커버슬립 위에 세포를 시드합니다. 세포 가 루피놀 라벨링 전날 60~80%에 도달할 때까지 이산화이산화탄소가 5%인 섭씨 37도 세포 인큐베이터에 세포를 배치합니다.

거시적 라벨링 전날, 우물의 미디어를 500 마이크로리터의 사전 따뜻하게 된 혈청 없는 매체로 대체하고 세포를 인큐베이터에 16~24시간 동안 배치한다. 96웰 마이크로플레이트 포맷의 경우, 세포 현탁액을 25 밀리리터 시약 저장소로 옮기는 것으로 시작합니다. 그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여, 세포 현탁액의 종자 100 마이크로리터는 광학적으로 맑은 순환 올레핀 또는 유리 바닥으로 검은 색 96-웰 고함량 스크리닝 마이크로 플레이트의 각 웰에 한다.

세포 합류가 매크로 피노솜 라벨링 전날 60~80%에 도달할 때까지 세포를 배양한다. 전날 에는 진공 펌프에 부착된 표준 팁에 대한 멀티채널 포부 어댑터를 사용하여 각 우물에서 미디어를 분리, 제거하고 폐기합니다. 또는 멀티채널 파이펫을 사용할 수 있습니다.

시약 저장소와 멀티채널 파이펫을 사용하여 미리 따뜻해지는 세럼 이없는 매체 100마이크로리터를 각 웰에 부드럽게 추가한 다음 셀 인큐베이터에 세포를 16~24시간 동안 배치합니다. 커버슬립 포맷이 있는 24웰 플레이트의 경우, 우물내의 미디어를 200마이크로리터의 혈청 프리 미디어로 대체하여 불소로소포레로 분류된 고분자량 디엑스트라넨으로 교체하고 세포를 세포 인큐베이터에 30분 동안 배치한다. 인큐베이션 후, 미리 냉각된 세척병을 사용하여 미디어를 흡인하고 차갑게 PBS로 셀을 5회 부드럽게 씻어냅니다.

세차 하는 동안 손으로 접시를 단단히 흔들어 커버립에 달라 지는 데스테인 골재를 단조로합니다. 다음으로, 3.7%의 포름알데히드3.7%의 마이크로리터를 추가하고 20분 동안 배양하여 세포를 수정한 다음 고정 용액을 흡인하고 PBS로 셀을 두 번 세척합니다. PBS에서 DAPI의 350 마이크로리터로 핵을 얼룩지게 합니다.

20 분 후, DAPI 용액을 흡인하고 PBS 세 번으로 세포를 씻어. 현미경 슬라이드에 실리콘 분리기를 나란히 부착하여 이미징 자동화에 필요한 커버립의 간격과 재현 가능한 국소화를 얻습니다. 그런 다음 각 커버슬립에 대해, isolator의 열린 공간 내에서 현미경 슬라이드에 경화 형광 장착 매체의 방울을 추가합니다.

집게를 사용하여 커버슬립을 선택하고 보풀이 없는 물티슈에 커버립의 측면을 부드럽게 눌러 과도한 PBS를 제거합니다. 다음으로, 커버슬립을 장착 매체의 드롭에 거꾸로 놓고 닫힌 포셉을 사용하여 커버슬립을 부드럽게 탭하여 장착 매체에서 거품을 제거합니다. 슬라이드를 어두운 환경에 저장하고 장착 용지가 실온에서 건조할 수 있도록 하며, 일반적으로 16~24시간이 소요됩니다.

이미징하기 전에 현미경 슬라이드에서 개소기를 제거합니다. 슬라이드가 실온에 평형된 후 암모니아가 없는 유리 클리너로 젖은 면 팁 어플리케이터를 사용하여 커버립을 청소하십시오. 그 후, 70%에탄올로 젖은 깨끗한 면 팁 어플리케이터를 사용하여 커버슬립을 청소하고 건조하게 둡니다.

96웰 마이크로플레이트 포맷의 경우, 이전에 입증된 우물을 심은 후, 불소엽소표지가 부착된 고분자량 디엑스트라를 첨가한 다음 세포 인큐베이터의 세포를 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 접시를 빈 5리터 비커로 수동으로 뒤집어 마이크로 플레이트에 있는 미디어를 폐기한 다음, 얼음 차가운 PBS로 채워진 두 리터 비커에 약간 각도로 접시를 천천히 잠급하여 셀과 마이크로 플레이트를 두 번 헹구고 거꾸로 접시에 거꾸로 놓고 PBS를 폐기합니다. 마지막 PBS 헹구후, 25 밀리리터 시약 저수지와 멀티 채널 파이펫을 사용하여 PBS에 3.7 %의 포름알데히드의 100 마이크로 리터를 각각 잘 추가하여 세포를 고정합니다.

실온에서 20분 간 인큐베이션한 후 고정 용액을 제거하고 잠수 및 플릭 기술을 사용하여 PBS로 셀을 세척합니다. 두 번째 PBS 세척 후, 잘 PBS에서 DAPI의 100 마이크로 리터로 핵을 얼룩. 20 분 후, 이전에 입증 된 것처럼 얼음 차가운 PBS로 세 번 세포를 헹구는다.

마이크로 플레이트를 거꾸로 보풀이 없는 와이프에 눌러 잔여 PBS를 제거합니다. 그런 다음 25 밀리리터 시약 저장소와 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각각 100 마이크로 리터의 신선한 PBS를 각 우물에 추가합니다. 이미징하기 전에 플레이트가 실온에 평형화한 다음, 보풀이 없는 물티슈로 세포 배양판을 건조하게 닦아주세요.

또는 최대 1주일 동안 빛으로부터 덮인 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오. 자동화된 매크로피노솜 이미징의 경우 자동화 프로토콜을 만들어 dextran 플루오로포어 및 DAPI의 파장 채널에서 40배 공기 목표를 사용하여 이미지를 획득합니다. 다음으로, 과다 노출을 피하기 위해 최고 수준의 대시피노시토시스를 가질 것으로 예상되는 샘플을 사용하여 노출 설정을 최적화하여 신호의 포화와 강도 데이터의 손실을 초래할 수 있습니다.

샘플을 쉽고 일관되게 찾아 고품질 이미지를 생성하는 포커스 설정을 사용합니다. 각 웰 또는 커버슬립에서 여러 이미지를 획득하여 샘플 가변성을 고려하고 시료를 정확하게 표현합니다. 거시적 색소 색인을 결정하기 위해, 자주 롤링 볼 함수라고 하는 적절한 기능을 적용하여 DAPI 및 해당 dextran 이미지의 배경을 뺍니다.

DAPI 및 dextran 신호에 빼기 효과가 최소화되지 않도록 설정을 조정합니다. 다음으로, 디엑스트라신호가 높은 필드를 사용하여, 자주 임계값 함수라고 불리는 강도 신호 설정을 결정하고 핵을 선택한 다음, 매크로피노좀만 선택하는 데 필요한 최소 강도 신호 설정을 결정한다. dextran 이미지의 경우 생성된 매크로피노솜 선택 내에서 총 형광을 계산하거나 선택을 사용하여 dextran에 대한 총 면적 양성을 결정합니다.

DAPI 이미지의 경우, 선택 영역을 사용하여 이미지내의 핵 수를 결정하여 존재하는 세포의 수를 반영한다. 그런 다음 총 dextran 형광 또는 영역을 DAPI에 의해 결정된 세포의 수로 나누어 거시적 색소 색 지수를 결정합니다. AsPC-1 PDAK 세포에서, Dextran을 추가하기 전에 5 분 동안 밀리리터 당 100 나노 그램에 EGF를 추가하면 거체 피노키토시스를 활성화합니다.

더욱이, 대식세포증의 자가크림 EGF 활성화는 글루타민 박탈에 의해 유도될 수 있다 16 받는 방24 시간. MIA PaCa-2 세포는 75 마이크로몰라 EIPA또는 10 마이크로몰러 EHop-016을 가진 2 시간 처리로 30 분 처리에 의해 억제되는 구성적인 macropinocytosis를 보여줍니다. 투여량 반응 실험에서, 거시피노세포 지수는 EHop-016 및 EIPA의 높은 약물 농도에서 점차 감소하여 구성적인 Rac1 의존형 매크로피노시토시스의 존재를 확인하였다.

이 절차를 조정하여 알부민과 같은 다른 형광 태그화물의 매크로피노세포증을 평가할 수 있습니다. 또한, 알부민의 매크로피노키틱 섭취가 세포 생존성 분석방법을 수행하여 세포 적합성에 기여하는지 평가하는 것이 좋습니다. 이 기술은 암과 기질 세포에 있는 대식세포 양공급의 식별에 중심이 되고 자동화는 우리의 상태 시험 능력을 크게 증가시켰습니다.