G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)를 통합 한 모델 지질 막의 건설

이 프로토콜은 항리고적으로 중요한 G 단백질 결합 수용체의 종류 중 하나인 인간 1A 세로토닌 수용체 단백질(_5-HT1AR)의 재구성을 위해 여기에 설명된 바와 같이, 일체형 막 단백질(IMP)을 거대한 유니라멜라 지질 소포(GUV)에 통합하기 위한 강력하고 일반화가능한 기술로 아가로즈 팽윤을 활용한다.

그들의 토착 환경에서 일체형 막 단백질을 공부하는 것은 플라즈마 막의 복잡성 때문에 도전이었습니다. 거대한 unilamellar 지질 소포, 또는 GUV는 생물 막 특성을 연구하는 가장 눈에 띄는 플랫폼 중 하나이며 다양한 생리 적 조건을 모방하도록 설계 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 하이드로겔 부종 에 이어 자발적인 통합 된 GUV를 기반으로 단백질을 제조하는 방법을 설명합니다. GUV를 제조하는 전통적인 방법은 일체형 멤브레인 단백질 통합을 위해 일반화할 수 없습니다. 이러한 방법은 종종 낮은 수율, 방법론적으로 복잡 하 고 임시, 단백질의 광범위 한 클래스에 적용 되지 않습니다. 한편, 본 프로토콜은 GUV에 기능적 일체형 멤브레인 단백질을 통합하는 유연하고 견고하며 간단한 방법을 나타냅니다.우리는 하이드로겔 스캐폴드를 준비하고 단백질을 함유하고 그 위에 얇은 지질층을 증착함으로써 이를 달성했습니다. 여기에 제시된 예에서, 우리는 G 단백질 결합 수용체, 또는 GPCR을 GUV에 통합했습니다.전체 시스템의 재수화시, GUV는 하이드로겔 표면에서 제대로 지향된 GPCRs를 포함하는 멤브레인과 함께 제거합니다.모든 시약이 실온에 올 수 있도록 합니다. 이 시간 동안, 메탄올에 배치하고 40에서 30 분 동안 초음파 처리하여 커버 슬립을 청소